袁 芬

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，武漢430077)

七氟烷對新生大鼠學習記憶功能以及海馬區(qū)凋亡的影響

袁 芬

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院麻醉科，武漢430077)

目的：觀察并探討新生大鼠接受七氟烷麻醉后，生長至斷乳期的學習記憶功能的變化以及海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡的變化。方法：健康6～8日齡新生SD大鼠100只，隨機數(shù)字表法分成5組，每組20只：Ⅰ組大鼠吸入體積分數(shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅱ組大鼠僅吸入25%氧氣2 h；Ⅲ組大鼠分別在出生后第6、7、8天接受一次體積分數(shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅳ組大鼠僅吸入3次25%氧氣2 h；Ⅴ組大鼠僅放入麻醉箱，不做任何處理。麻醉后待大鼠生長至16～21 d時，采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠的空間學習和記憶能力，并且取大鼠海馬區(qū)檢測caspase-3的表達，用TUNEL法觀察海馬區(qū)凋亡細胞的變化。結(jié)果：①Morris水迷宮實驗顯示：在大鼠生長至16～21 d時進行定向航行實驗，與第Ⅳ組大鼠相比，第Ⅰ組大鼠的逃避潛伏期無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第Ⅲ組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，和其他組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；②在水迷宮的空間探索實驗中，與第Ⅳ組相比，第Ⅰ組大鼠的穿越平臺的次數(shù)無明顯的變化；第Ⅲ組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，并且較第Ⅰ組以及其他各組大鼠也顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；③第Ⅲ組大鼠的游泳速度明顯慢于其他組別；④與第Ⅳ組大鼠比，Ⅰ組大鼠caspase-3的表達稍有增加，Ⅲ組大鼠caspase-3的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。⑤僅接受一次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細胞稍有增加，而接受三次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：新生6～8 d的大鼠接受三次七氟烷麻醉后，待其生長至16～21 d，其空間學習記憶能力明顯受到影響，可能與海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡有關(guān)。

七氟烷；海馬區(qū)；學習記憶功能；凋亡

隨著醫(yī)學技術(shù)和麻醉學的發(fā)展，越來越多的嬰幼兒甚至新生兒可以在安全無痛的條件下接受手術(shù)以及一些特殊的檢查[1,2]。并且有報道顯示，約有2%的孕婦在妊娠期需要接受全身麻醉下進行的手術(shù)，這使得胎兒暴露于麻醉藥物中[3,4]，而這些藥物會不會對新生兒、嬰幼兒后期的學習記憶能力產(chǎn)生影響，造成損害目前還沒有確切的定論。七氟烷是目前在嬰幼兒麻醉中應用最為廣泛的吸入性麻醉藥之一，它對呼吸道的刺激較小，并且在麻醉的誘導過程平穩(wěn)、蘇醒迅速。與其他的吸入性麻醉藥相比，七氟烷的肺泡內(nèi)濃度與吸入濃度比例(FA/F1)較氟烷和恩氟烷高，且排泄迅速[5,6]。但是，在國外，麻醉藥對認知功能的影響主要集中在氟烷以及異氟烷的領(lǐng)域[7]，在國內(nèi)七氟烷對認知功能的影響主要是以中青年鼠或老年鼠為研究對象[8]，而七氟烷對新生兒、嬰幼兒的影響以及學習記憶功能研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，出生7 d的雄性大鼠分別給予七氟烷麻醉和異氟烷麻醉后，兩組大鼠的大腦神經(jīng)元均有凋亡的表現(xiàn)，但是在等效的濃度刺激下，異氟烷引起的神經(jīng)元損傷較七氟烷更重。那么七氟烷對發(fā)育期的大腦神經(jīng)元影響多大，僅接受一次七氟烷麻醉和接受多次七氟烷麻醉引起的神經(jīng)元損傷是否相同,就成了研究者關(guān)心的問題之一。有研究表明，阿爾茲海默病患者認知功能障礙的最主要原因是大腦膽堿能突觸的神經(jīng)沖動傳遞受損[9]，并且研究證實了如果給老年人使用擬膽堿藥，可以有效地增強老年人的認知能力。在動物實驗中，研究者們也發(fā)現(xiàn)老年雄性大鼠在接受異氟醚麻醉后，其空間學習的記憶能力是下降的，可能與大腦海馬內(nèi)膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)的濃度下降有關(guān)[10]。當然，由于老年人的生理特點決定了其麻醉后大腦神經(jīng)系統(tǒng)的影響比中青年人更為敏感，而處于生長發(fā)育期的新生動物麻醉后大腦神經(jīng)系統(tǒng)是否會受到影響還不明確。給予正處于神經(jīng)突觸發(fā)育高峰期的大鼠以七氟烷麻醉是否影響生長發(fā)育后期的學習記憶功能值得研究。本研究主要觀察新生大鼠在接受不同濃度的七氟烷麻醉后，生長至斷乳期的學習記憶能力的變化，并進一步研究其大腦海馬區(qū)中caspase-3的改變，以期能為七氟烷影響發(fā)育期大腦學習記憶功能的機制提供實驗依據(jù)，為七氟烷更安全有效地應用于臨床麻醉提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康6～8日齡新生SD大鼠100只，體重為13～20 g，將大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房，大鼠由江蘇省揚州大學實驗動物中心提供，實驗過程中對動物的處理通過了揚州大學實驗動物中心的動物實驗倫理委員會的審批，審批號為：IACUC-14030070,符合動物倫理學標準。

將大鼠按隨機數(shù)字表法分成5組，每組20只：Ⅰ組大鼠吸入體積分數(shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅱ 組大鼠僅吸入25%氧氣2 h；Ⅲ 組大鼠分別在出生后第6、7、8天接受一次體積分數(shù)為3%的七氟烷以及25%氧氣2 h；Ⅳ組大鼠僅吸入3次25%氧氣2 h；Ⅴ組大鼠僅放入麻醉箱，不做任何處理。

1.2 方法

1.2.1 Morris水迷宮實驗[11,12]Morris水迷宮是一個直徑為120 cm，高為50 cm的圓形水桶，其中有可移動的水下平臺、圖像采集以及分析軟件。水池的上方設(shè)置東、南、西、北4個方向標記，每兩個方向之間的距離相等，這4個方向在水面和水底的投影點將水桶分成4個均等的象限，分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限。在實驗的過程中，水桶內(nèi)加入氧化鈦使得水變成不透明的乳白色，并將一個直徑為6 cm的平臺放置于水面下2 cm。水溫保持在25℃，圖像分析儀(CEFET,Curitiba,PR,Brazil)將自動記錄大鼠從投入水桶到找到平臺的時間、速度以及游泳的距離。

在大鼠出生后第16～21天開始為期6 d的水迷宮實驗。前5 d進行定向航行實驗訓練，即每次將大鼠從不同象限面向池壁放入水中，記錄大鼠尋找到水下平臺的時間，若大鼠超過120 s還未能找到平臺，用木棍指引其游上平臺并停留20 s，此次逃避潛伏期(Escape lantency，EL)記為120 s，每天進行4次，第6天進行定向航行實驗以及空間探索實驗，將水下平臺取出，記錄大鼠尋找水下平臺的時間以及在120 s內(nèi)穿越原平臺的次數(shù)以及原平臺象限活動的時間，共4次。測試期間需保持實驗室內(nèi)環(huán)境安靜、燈光昏暗并無特殊氣味，以減少對實驗的干擾。

1.2.2 檢測caspase-3的表達 在大鼠進行水迷宮實驗后30 min，斷頸法處死大鼠，取腦組織用生理鹽水沖洗后在顯微鏡下解剖游離出雙側(cè)海馬組織并做好標記，全過程在冰上進行。用蛋白定量試劑盒(P0010S,Beyotime Institute of Biotechnology,China)檢測總蛋白濃度后進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，室溫放置2 h，與caspase-3的單抗(1∶1 000;Abcam ab47131) 4℃孵育過夜，用含0.05%Tween-20的TBS沖洗3次，每次10 min，用HRP標記的二抗反應1 h，用TBST沖洗3次，每次10 min，用DAB顯色，用凝膠圖像分析儀分析蛋白含量(Bio-rad,USA)。

1.2.3 TUNEL法檢測海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡 取大鼠腦組織放入4%的多聚甲醛中固定24 h，采用冰凍切片機切取冠狀腦片置于載玻片上，每只大鼠5張切片，用4%多聚甲醛固定腦片15 min，用PBS溶液沖洗兩次，每次5 min，加入溶液(乙醇∶醋酸=2∶1)固定5 min，再次用PBS溶液沖洗2次，每次5 min，用3%過氧化氫溶于甲醇溶液浸洗15 min，用PBS溶液沖洗兩次，每次5 min，最后加入0.1%TritonX-100溶于0.1%檸檬酸鈉溶液促滲2 min，再次用PBS溶液漂洗，每個樣本滴加50 μl Taq酶，充分反應60 min后用PBS溶液漂洗，加入熒光素標記液50 μl，再次用PBS溶液沖洗兩次后，加入DAB工作液50 μl室溫孵育顯色，PBS漂洗3次，用蘇木素復染幾秒后用自來水沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明后封片觀察。

在光學顯微鏡(Olympus，BX43)下觀察、計數(shù)凋亡細胞，每只大鼠取5張切片，每張切片隨機選擇5個高倍視野，計數(shù)其中的陽性細胞數(shù)量，染色陽性細胞的胞漿為棕褐色，即凋亡細胞。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮平均逃避潛伏期的比較 各組水迷宮平均逃避潛伏期資料見圖1。結(jié)果顯示與第Ⅳ組大鼠相比，第Ⅰ組大鼠的逃避潛伏期無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；第Ⅲ組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，和其他組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 水迷宮空間探索實驗結(jié)果比較 各組水迷宮空間探索實驗資料見圖2。結(jié)果顯示與第Ⅳ組相比，第Ⅰ組大鼠的穿越平臺的次數(shù)無明顯的變化；第Ⅲ組大鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，并且較第Ⅰ組以及其他各組大鼠也顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 大鼠運動能力的比較 第Ⅲ組大鼠的游泳速度在第1～5天均慢于其他組別。其中，第2、3、5天較第Ⅳ組明顯減慢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他組別的游泳速度差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖1 大鼠平均逃避潛伏期Fig.1 Mean escape latency in ratsNote: *.P<0.05.

2.4 小鼠海馬區(qū)caspase-3的表達 在以上的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)接受3次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潛伏期、空間探索實驗以及運動能力均較其他組有差異，為了進一步了解大鼠在接受七氟烷麻醉后是否發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)細胞凋亡的現(xiàn)象，檢測了大鼠海馬區(qū)caspase-3的表達，見圖4。與第Ⅳ組大鼠相比，僅Ⅰ組大鼠caspase-3的表達稍有增加，但是差異無統(tǒng)計學意義，Ⅲ組的大鼠caspase-3的表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 大鼠穿越平臺次數(shù)Fig.2 Time of cross platform in ratsNote: *.P<0.05.

圖3 大鼠游泳速度Fig.3 Swimming speed in rats

圖4 Western blot檢測caspase-3的表達Fig.4 Expression of caspase-3 detected by Western blot

圖5 海馬區(qū)TUNEL染色Fig.5 TUNEL staining in hippocampus

圖6 TUNEL染色陽性細胞統(tǒng)計圖Fig.6 Statistical map of positive cells of TUNEL stainingNote: *.P<0.05.

2.5 Tunel染色檢測大鼠海馬區(qū)凋亡細胞 由于在上一個實驗中，我們發(fā)現(xiàn)接受七氟烷麻醉的大鼠caspase-3的表達增加，接下來在細胞層面上，我們用Tunel染色觀察大鼠海馬區(qū)的凋亡，發(fā)現(xiàn)，與蛋白的結(jié)果一樣，僅接受1次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細胞稍有增加，接受3次七氟烷麻醉的大鼠海馬區(qū)染色陽性的細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5、6。

3 討論

近年來，有動物實驗表明，吸入性麻醉藥會對未成熟大腦的神經(jīng)造成不同程度的損傷，而且在大腦發(fā)育的關(guān)鍵階段，吸入麻醉可導致神經(jīng)元細胞發(fā)生退行性變和凋亡，進而影響神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建[13]。所以在本研究中，為了了解吸入性麻醉藥對大腦發(fā)育期的影響，我們選用健康6～8日齡新生SD大鼠作為研究對象，這個時期正是大鼠大腦神經(jīng)突觸發(fā)育的高峰期[14]。研究表明，學習和記憶的過程主要與大腦皮質(zhì)聯(lián)合區(qū)、下丘腦、丘腦、海馬等腦區(qū)的參與有關(guān)，其中海馬區(qū)是由中間腦皮質(zhì)分化而來的結(jié)構(gòu)，并且被公認為在陳述性記憶中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與學習記憶的功能有著非常密切的關(guān)系[15]，所以，在本研究中，我們選擇海馬區(qū)域來了解新生大鼠記憶功能的變化、并進一步探究其神經(jīng)元細胞的凋亡及可能的機制。

目前用于檢測動物學習記憶能力的方法有很多，其中Morris水迷宮實驗是被公認的用來評價鼠類等嚙齒類動物空間學習記憶功能的經(jīng)典測試方法，其對大鼠的海馬組織的損害敏感性很高。Morris水迷宮的操作過程在水中進行，能夠避免其他比如電刺激迷宮對實驗動物的刺激和傷害，并且能夠排除氣味對大鼠認知的干擾，Morris水迷宮的測試指標能夠比較全面的、系統(tǒng)的評估大鼠空間學習記憶的能力，較為客觀的反映大鼠的認知行為水平，所以在以大鼠的海馬作為實驗對象的研究中，Morris水迷宮實驗是一種具有優(yōu)越性的測試方法。大鼠的空間學習能力越好，其在實驗中的逃避潛伏期越短，穿越原平臺的次數(shù)越多，反之則說明大鼠的空間記憶能力差[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)接受一次七氟烷麻醉的大鼠在逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)以及運動能力方面與未接受麻醉組相比差異均無統(tǒng)計學意義，而接受3次七氟烷麻醉的大鼠在這三個方面較未接受麻醉組均表現(xiàn)出明顯的能力降低，提示接受3次七氟烷麻醉的大鼠在早期空間學習記憶能力受損。

以上的結(jié)果提示大鼠在麻醉后早期神經(jīng)元細胞可能發(fā)生變化導致大鼠的空間學習能力降低，而且上述結(jié)果僅是對大鼠的行為作觀察和研究，接下來，我們分別從蛋白層面和細胞層面上觀察麻醉后早期大鼠海馬區(qū)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受3次七氟烷麻醉的大鼠的海馬區(qū)caspase-3的表達明顯增加，并且觀察到明顯的神經(jīng)細胞凋亡，提示接受多次七氟烷麻醉會使大鼠的大腦神經(jīng)元細胞凋亡增多。

盡管在大鼠的模型上，我們發(fā)現(xiàn)多次七氟烷麻醉會使得大鼠的神經(jīng)元細胞凋亡，進而導致學習記憶能力受損，但是七氟烷是否會對嬰幼兒產(chǎn)生同樣的影響還需要更多的實驗研究，本研究著眼于多次七氟烷麻醉對大鼠的學習記憶功能的影響，期望能為臨床工作找到安全可靠的麻醉藥物，并為尋找較小神經(jīng)中樞毒性麻醉藥物提供實驗依據(jù)。

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[收稿2016-08-02 修回2016-09-11]

(編輯 倪 鵬)

Effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats

YUANFen.

DepartmentofAnesthesiology,LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China

Objective:To explore the effect of sevoflurane on learning and memory function and apoptosis of hippocampus in infant rats.Methods: 100 SD rats aged 6-8 days were randomly divided into 5 groups(n=20),the group Ⅰinhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅱinhaled only 25% oxygen for 2 hours;the group Ⅲ inhaled 3% sevoflurane and 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;the group Ⅳ inhaled 25% oxygen for 2 hours on the 6th,7th,8th day after birth;group Ⅴ were just put into the anesthetized box without any treatment.When the rats were grown up to 16-21 days after anesthesia,the effect of learning and memory function were assessed by Morris water maze test,and activity of caspase-3 were detected by Western blot,the apoptosis of hippocampus were detected by tunnel.Results: ①Compared to group Ⅳ,the mean escape lantency of group Ⅰ showed no significant changes(P>0.05),while group Ⅲ was significant longer (P<0.05),which was significant different from other groups(P<0.05).②In the space exploration experiment,there was no difference between group Ⅰ and Ⅳ,but compared to group Ⅰ and other groups,the number of cross platform of group Ⅲ was decreased (P<0.05).③The swimming speed of group Ⅲ was significantly slower than the other groups.④Compared to group Ⅳ,the activity of caspase-3 slightly increased in group Ⅰ,and significantly increased in group Ⅲ(P<0.05).⑤The positive cells in hippocampus stained by TUNEL in group Ⅲ was significant increased (P<0.05).Conclusion: Learning and memory function of infant rats aged 6-8 days are impaired after three exposures to sevoflurane when they grow up to 16-21 days,and this may relate to the apoptosis of hippocampus.

Sevoflurane;Hippocampus;Learning and memory function;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.008

袁 芬(1978年-)，女，主治醫(yī)師，主要從事麻醉方面的研究，E-mail:yuanfenfen_2007@163.com。

R392.32

A

1000-484X(2017)02-0201-05