姬會(huì)春 劉軍權(quán) 周 燏 李 昳 陳復(fù)興 費(fèi)素娟

(宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷223800)

阿托伐他汀對(duì)人 NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制研究①

姬會(huì)春 劉軍權(quán)②周 燏②李 昳②陳復(fù)興②費(fèi)素娟③

(宿遷市第一人民醫(yī)院，宿遷223800)

目的：探討阿托伐他汀對(duì)人NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制。方法：不同濃度的阿托伐他汀作用于3株結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116、SW-480、Caco-2)，CCK-8法測(cè)定阿托伐他汀對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響。SCGM培養(yǎng)基體外擴(kuò)增人NK細(xì)胞，自動(dòng)生化分析儀測(cè)定NK細(xì)胞對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率。結(jié)果：(1)NK細(xì)胞的培養(yǎng)：培養(yǎng)前CD3-CD56+的NK細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例為4.5%，培養(yǎng)10 d時(shí)NK細(xì)胞的比例增至93.1%。(2)阿托伐他汀對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響：阿托伐他汀作用48 h后，在濃度5～40 μmol/L的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率較對(duì)照組升高(P<0.05)。作用96 h后，在1.25～40 μmol/L的所有濃度組(6個(gè))中，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。另外， HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著阿托伐他汀濃度的升高而逐漸上升，相關(guān)分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈正相關(guān)(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。(3)NK細(xì)胞經(jīng)阿托伐他汀作用96 h后，除濃度為20 μmol/L和40 μmol/L時(shí)抑制率高于對(duì)照組，其他各組對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響。(4)阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響：NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀濃度2.5～10 μmol/L組均顯著高于對(duì)照組，對(duì)SW-480的殺傷活性在5～20 μmol/L組較對(duì)照組明顯升高，對(duì)Caco-2的殺傷活性在2.5～20 μmol/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，其中同一濃度時(shí)對(duì)HCT-116細(xì)胞殺傷作用最強(qiáng)。(5)阿托伐他汀對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響：在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)，在10 μmol/L及20 μmol/L組，SW-480細(xì)胞MICA/B表達(dá)率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在2.5～40 μmol/L 組，Caco-2細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。 結(jié)論：(1)阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、SW-480 及Caco-2的生長(zhǎng)；(2)阿托伐他汀能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性，可能與阿托伐他汀上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)有關(guān)；(3)阿托伐他汀可以上調(diào)3株結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率，提高結(jié)腸癌細(xì)胞的免疫原性。

阿托伐他??；結(jié)腸癌細(xì)胞；NK細(xì)胞；MICA/B

結(jié)腸癌是一種發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率第五位，男性發(fā)病率的第五位，女性的第三位[1]。全球每年約有50萬患者死于結(jié)腸癌[2]。臨床上確診時(shí)大都已經(jīng)發(fā)展為中晚期，錯(cuò)過了最佳手術(shù)期，其預(yù)后差、病死率高。結(jié)腸癌的非手術(shù)治療越來越受到業(yè)內(nèi)人士的關(guān)注。 他汀類藥物是臨床常用的降血脂藥物。近年來有研究表明，他汀類藥物具有抗腫瘤作用[3]，阿托伐他汀為人工合成的他汀類降血脂藥物。自然殺傷(Natural killer，NK)細(xì)胞是人體第一道免疫防線的重要組成部分，有強(qiáng)大的抗腫瘤、抗感染及清除非己細(xì)胞等作用[4]。臨床上NK細(xì)胞過繼免疫治療多種腫瘤已取得了一些療效。但其臨床抗腫瘤的療效一直未能得到大幅度的提高，如何增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性是提高NK細(xì)胞抗腫瘤療效的關(guān)鍵。目前尚沒有阿托伐他汀與NK細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行抗腫瘤研究的報(bào)道。本文擬探討阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司)；人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116(低分化腺癌)、SW-480(低分化腺癌)和Caco-2(人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞)(中科院上海細(xì)胞所)；無血清培養(yǎng)基和NK細(xì)胞培養(yǎng)基(浙江博納生物科技有限公司產(chǎn)品)；PE標(biāo)記MICA/B(美國(guó)BD公司)；淋巴細(xì)胞分離液(中國(guó)科學(xué)院血液病研究所)；PE標(biāo)記的CD3、FITC標(biāo)記的CD56(美國(guó)BD公司)；ST-360酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；Encore自動(dòng)生化分析儀(北京希亞克技術(shù)有限公司)；熒光倒置顯微鏡TE2000-S(日本Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(Flow cytometry，F(xiàn)CM)(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 NK細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 使用淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離健康個(gè)體外周血獲得單個(gè)核細(xì)胞，PBS洗滌2次，將細(xì)胞加入含有rhIL-2 和人AB血漿的NK培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)10 d的NK細(xì)胞，PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107ml-1。取100 μl細(xì)胞懸液，分別加入 FITC-Anti-CD56和PE-Anti-CD3，室溫避光孵育15 min，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM進(jìn)行表型檢測(cè)。

1.2.2 CCK-8測(cè)阿托伐他汀對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 為了篩選出阿托伐他汀對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116、SW-480和Caco-2細(xì)胞)抑制最佳藥物濃度和作用時(shí)間。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116細(xì)胞，PBS洗滌3次，使用含10%小牛血清的McCoy′S5A培養(yǎng)基將細(xì)胞配成1×104ml-1的細(xì)胞懸液；SW-480和Caco-2細(xì)胞按同樣的方法收集，并置于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，配成1×104ml-1的細(xì)胞懸液。3株細(xì)胞分別加入96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的阿托伐他汀(終濃度分別為1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，同時(shí)設(shè)DMSO溶劑對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕搖勻，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。按下列公式計(jì)算結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 阿托伐他汀誘導(dǎo)NK細(xì)胞的方法 收集培養(yǎng)10 d的NK細(xì)胞，PBS洗滌3次，用NK細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞配成1×105ml-1的細(xì)胞懸液，加入96孔板，200 μl/孔。然后加入終濃度分別為0、1.25、2.5、5、10、20、40 μmol/L的阿托伐他汀，同時(shí)設(shè)DMSO溶劑對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別于24、48、72和92 h每孔加入CCK-8 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕搖勻，于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。按下列公式計(jì)算NK細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.4 LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷活性 將復(fù)蘇后的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、SW-480和Caco-2體外傳代培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)分別給予胰酶消化，收集3株結(jié)腸癌細(xì)胞，洗滌3次，使用相應(yīng)的培養(yǎng)基將細(xì)胞配成5×105ml-1的細(xì)胞懸液，加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。分別將不同濃度的阿托伐他汀(終濃度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集培養(yǎng)第48小時(shí)結(jié)腸癌細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×105ml-1，作為靶細(xì)胞。以培養(yǎng)10 d后的NK 細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106ml-1，按效靶比10∶1接種于試管中。同時(shí)設(shè)效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組、靶細(xì)胞自然釋放組、靶細(xì)胞最大釋放組，置 37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，1 000 r/min離心5 min，吸取上清液，自動(dòng)生化分析儀測(cè)LDH值。按下列公式計(jì)算NK細(xì)胞的殺傷活性。NK細(xì)胞的殺傷活性 =(實(shí)驗(yàn)組LDH值-效應(yīng)細(xì)胞自然釋放組LDH值)/(靶細(xì)胞最大釋放組LDH值-靶細(xì)胞自然釋放組LDH值)×100%。

1.2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的檢測(cè) 分別收集3株結(jié)腸癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105ml-1，以每孔5 ml接種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度的阿托伐他汀(終濃度0、2.5、5、10、20、40 μmol/L)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌，細(xì)胞密度調(diào)至1×107ml-1，取細(xì)胞懸液100 μl，加入PE-MICA/B 20 μl，室溫避光孵育15 min，同時(shí)設(shè)同型IgG1對(duì)照。PBS洗滌并重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測(cè)MICA/B的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 NK細(xì)胞的鑒定 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)前血CD3-CD56+的NK細(xì)胞占外周血單個(gè)核細(xì)胞的比例為4.5%。培養(yǎng)10 d時(shí)NK細(xì)胞的比例增至93.1%，符合實(shí)驗(yàn)要求，見圖1。

2.2 不同濃度的阿托伐他汀對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

2.2.1 阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 由表1、圖2可見，不同濃度的阿托伐他汀作用24、48、72和96 h時(shí)，結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116(低分化腺癌)的生長(zhǎng)抑制率均較對(duì)照組升高，統(tǒng)計(jì)分析顯示，作用48 h后，阿托伐他汀濃度5～40 μmol/L的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。作用96 h后，阿托伐他汀1.25～40 μmol/L的所有濃度組(6個(gè))中，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。另外， HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨著阿托伐他汀濃度的升高而逐漸上升，相關(guān)分析顯示，阿托伐他汀的濃度與HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率呈正相關(guān)(r[48 h]=0.13，r[96 h]=0.22，P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時(shí)，HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在24 h和48 h組與72 h和96 h組之間比較，除1.25、2.5和5 μmol/L組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示，阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制HCT-116細(xì)胞的生長(zhǎng)，且延長(zhǎng)作用時(shí)間可以增強(qiáng)阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。其他結(jié)果見表1。

2.2.2 阿托伐他汀對(duì)SW-480細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 阿托伐他汀作用24 h和48 h后，濃度1.25～40 μmol/LNote：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.的6個(gè)濃度組中，結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480(低分化腺癌)的生長(zhǎng)抑制率均顯著高于對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)分析差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；作用72 h和96 h后，阿托伐他汀濃度2.5～40 μmol/L的5個(gè)濃度組中，SW-480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。另外，隨著阿托伐他汀濃度的增高，SW-480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，相關(guān)分析結(jié)果顯示，SW-480的生長(zhǎng)抑制率與阿托伐他汀濃度呈正相關(guān)(r[48 h]=0.16，r[96 h]=0.19，P<0.05)，阿托伐他汀濃度相同時(shí)，較高濃度組(10～40 μmol/L)中，SW-480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在96 h組顯著高于24 h和48 h 組(P<0.05)。上述結(jié)果提示阿托伐他汀能夠呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480的生長(zhǎng)，且較高濃度時(shí)延長(zhǎng)作用時(shí)間能夠提高阿托伐他汀對(duì)SW-480細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，見表2、圖3。

圖1 NK細(xì)胞的鑒定(FCM檢測(cè))Fig.1 FCM results of NK cells cultured before and after 10 days

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)InhibitionrateofHCT?116cells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125120±008208±018635±0441)2)836±0181)2)25130±009160±015745±0541)2)961±0201)2)5279±011379±0381)812±0591)2)851±0281)2)10312±012352±0341)999±0761)2)1158±0441)2)20595±0341)726±0141)1473±1211)2)1912±1251)2)401256±1221)2168±1401)4126±3121)2)4546±1961)2)

2.2.3 阿托伐他汀對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 阿托伐他汀作用24、48、72和96 h時(shí)后，濃度1.25～40 μmol/L的6組中，結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2(人克隆腺癌細(xì)胞)的生長(zhǎng)抑制率均顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而且，Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨阿托伐他汀濃度增加而逐漸升高，相關(guān)分析顯示，兩者呈正相關(guān)(r[48 h]=0.20，r[96 h]=0.23，P<0.05)。阿托伐他汀濃度相同時(shí)，除40 μmol/L 組外，Caco-2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在48 h組與72 h和96 h組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果證實(shí)，阿托伐他汀能夠有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的生長(zhǎng)，且呈劑量依賴性，但延長(zhǎng)作用時(shí)間并不能提高阿伐他汀對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。其他結(jié)果見表3、圖4。

圖2 阿托伐他汀對(duì)HCT-116細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different concentrations of atorvastatin on HCT-116 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125423±0351030±0781)823±0531)311±03225733±0561)1525±1221)1026±0981)583±0401)51218±1141)2431±1941)1836±1321)2491±2101)101631±1121)2212±1961)2598±1971)3631±3921)2)202247±1191)2651±2111)3265±2361)2)3941±1671)2)402636±1291)3173±2231)4023±3381)2)4523±3771)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.3 不同濃度的阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 NK細(xì)胞經(jīng)不同濃度的阿托伐他汀作用24～96 h后，除誘導(dǎo)96 h濃度為20 μmol/L和40 μmol/L 兩組對(duì)NK細(xì)胞抑制率高于對(duì)照組外(差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)，其他各組阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞生長(zhǎng)均無明顯影響，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖5。

圖3 阿托伐他汀對(duì)SW-480細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of atorvastatin on SW-480 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Inhibitionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125325±024405±015423±031436±02525957±0431)1331±1051)915±0641)772±0371)51639±1291)2495±1991)2036±1981)2163±1911)102037±1911)2372±2271)2145±1731)2398±2391)202378±1871)2928±2641)2948±2571)3359±2851)402967±2061)3307±2891)3649±3121)4418±3541)2)

Note：1)P<0.05 compared with the control group;2)P<0.05 compared with the 24 and 48 h group.

2.4 阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響 從表5、圖6可見，NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～10 μmol/L的3個(gè)濃度組中均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，對(duì)SW-480的殺傷活性在5～20 μmol/L的3個(gè)濃度組較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，而對(duì)Caco-2的殺傷活性在2.5～20 μmol/L的4個(gè)濃度組中均顯著升高(P<0.05)。另外，在阿托伐他汀2.5 μmol/L及5 μmol/L 的2個(gè)濃度組中，NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性均顯著高于對(duì)SW-480及Caco-2的殺傷活性(P<0.05)，其中，濃度5 μmol/L時(shí)NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性最高，濃度為10 μmol/L時(shí)NK細(xì)胞對(duì)SW-480、 Caco-2殺傷活性最強(qiáng)。以上結(jié)果提示阿托伐他汀能夠提高NK細(xì)胞對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性，但對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞的作用存在差異，其中對(duì)HCT-116細(xì)胞的作用最強(qiáng)。

2.5 阿托伐他汀對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響 不同濃度的阿托伐他汀對(duì)3株結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響存在差異，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.05)，其中2.5 μmol/L組HCT-116細(xì)胞MICA/B表達(dá)率最高。

圖4 阿托伐他汀對(duì)Caco-2細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different concentrations of atorvastatin on Caco-2 cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)Reproductionrateofcells(%)24h48h72h96h0(Controlgroup)0000125008±001015±002018±002051±00825031±003045±005098±007073±0075054±006067±007064±005004±00510001±001007±001-091±009-101±04220-047±007-089±009-106±018-267±0381)40-054±011-119±027-214±0411)-278±0361)

Note：1)P<0.05 compared with the control group.

圖5 經(jīng)阿托他汀誘導(dǎo)96 h后的NK細(xì)胞生長(zhǎng)情況Fig.5 Effect of after 96 h induced by atorvastatin on NK cells growthNote: *.P<0.05 compared with the control group.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)KillingactivityofNKcellsHCT?116SW?480Caco?20(Controlgroup)4023±2343071±2743282±230255932±3901)2)3452±4424023±2771)56230±2461)2)3846±1901)4673±3321)105042±5641)4461±2351)4983±2501)204532±2393672±1271)4214±3981)403943±5463344±3253545±162

Note：Compared with the control group,1)P<0.05；compared with the SW-480,Caco-2,2)P<0.05.

圖6 阿托伐他汀對(duì)NK細(xì)胞殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞活性的影響Fig.6 Killing activity of NK cells to colon cancer cell which cultured with atorvastatinNote: *.P<0.05 compared with the control group;△.P<0.05 compared with the SW-480,Caco-2.

Concentrationofatorvastatin(μmol/L)ColoncancercellsMICA/Bexpressionrate(%)HCT?116SW?480Caco?20(Controlgroup)5129±280342±0582042±209257098±2101)400±0502891±1691)56487±3271)396±0293502±4131)105540±3831722±2441)4855±4421)204242±4471430±2411)4900±3231)402719±2781)430±0764036±2261)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05.

圖7 不同濃度的阿托伐他汀對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B表達(dá)的影響Fig.7 Effect of different concentrations of atorvastatin on colon cancer cells MICA/B expression rateNote: *.P<0.05 compared with the control group.

SW-480細(xì)胞MICA/B表達(dá)率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在阿托伐他汀2.5～40 μmol/L的5個(gè)濃度組中，Caco-2細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。其中，阿托伐他汀濃度10 μmol/L組 SW-480細(xì)胞的MICA/B表達(dá)率最高，20 μmol/L組Caco-2細(xì)胞的MICA/B表達(dá)率最高(見表6、圖7)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，適宜濃度的阿托伐他汀可以上調(diào)3株結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率，提高結(jié)腸癌細(xì)胞的免疫原性。

3 討論

近年來，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人們生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變及環(huán)境污染等，結(jié)腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，新發(fā)病例以每年4%的速度增長(zhǎng)，每年新發(fā)病例超過17萬，現(xiàn)已成為我國(guó)發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一[5,6]， 且發(fā)病年齡越來越年輕化，病程較為漫長(zhǎng)，反復(fù)發(fā)作，給患者帶來了極大的痛苦，嚴(yán)重威脅國(guó)人的健康。 根據(jù)目前結(jié)腸癌的發(fā)病形勢(shì)，傳統(tǒng)的手術(shù)治療仍然是治療結(jié)腸癌的主要手段，但因發(fā)現(xiàn)時(shí)機(jī)較晚，許多患者已經(jīng)失去手術(shù)治療的意義。而放化療副作用大，患者耐受力差，也限制了該治療方式的廣泛應(yīng)用。積極尋找新的有效低毒的治療結(jié)腸癌的藥物具有重要的臨床意義。目前結(jié)腸癌的發(fā)病原因尚不明確，最近有報(bào)道表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，可能為自身免疫性疾病，細(xì)胞免疫與實(shí)體腫瘤的抗腫瘤機(jī)制有關(guān)[7]?，F(xiàn)在有越來越多臨床工作者正在研究利用藥物增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤功能來達(dá)到腫瘤治療的目的。

他汀類藥物作為臨床常用的降血脂藥物已被廣泛用于治療心血管疾病，隨著對(duì)該類藥物研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有抗腫瘤作用，且已經(jīng)受到越來越多的學(xué)者關(guān)注。 他汀類藥物可通過抑制HMG-CoA還原酶阻斷膽固醇的合成，甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)是膽固醇合成的中間產(chǎn)物，可參與細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中所必需的GTP酶的戊烯化。多項(xiàng)研究表明他汀類藥物的抗腫瘤可能與以下機(jī)制有關(guān)：(1)他汀類藥物可通過阻斷MVA合成途徑影響細(xì)胞周期，使腫瘤細(xì)胞停滯于G0-G1期或G1-S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[8,9]。(2)他汀類藥物還可通過抑制基因轉(zhuǎn)錄后的異戊二烯化而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，且MVA能夠逆轉(zhuǎn)上述作用，推測(cè)異戊二烯代謝物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的作用[10]。(3)Ras突變是腫瘤發(fā)生過程中經(jīng)常發(fā)生的事件，他汀類藥物可以抑制Ras蛋白翻譯后修飾，干擾Ras活化，阻滯Ras信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡。Park等[11]報(bào)道，洛伐他汀能夠通過抑制Ras蛋白異戊二烯化抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖。(4)半胱氨酸蛋白酶(Caspase)是細(xì)胞凋亡中起重要作用的一類蛋白水解酶，Caspase活化與凋亡的啟動(dòng)有關(guān)，Bcl-2則可阻礙細(xì)胞的凋亡過程。 Cho等[12]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可上調(diào)Caspase-3蛋白表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞的凋亡，且可明顯抑制小鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用不同濃度的阿托伐他汀作用于HCT-116、SW-480和Caco-2結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示隨著阿托伐他汀濃度的升高，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用逐漸增強(qiáng)，相關(guān)分析結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)，證實(shí)阿托伐他汀呈劑量依賴性抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

NK細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)靶細(xì)胞的識(shí)別無主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex，MHC)限制性，NK細(xì)胞表面NKG2D可與細(xì)胞表面的模型MICA結(jié)合，通過NKG2D-MICA系統(tǒng)同時(shí)參與調(diào)節(jié)固有性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，發(fā)揮殺傷效應(yīng)， 這種調(diào)節(jié)機(jī)制在腫瘤免疫、自身免疫及抗感染免疫等領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注[13,14]。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的MICA分子與NK細(xì)胞表面的NKG2D交聯(lián)，可以促使NK細(xì)胞活化并產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶裂解靶細(xì)胞,從而提高NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷活性[15]。細(xì)胞在腫瘤的微環(huán)境或受病毒感染以后NKG2D表達(dá)可上調(diào)[16-18]， Pende等[19,20]研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞對(duì)高表達(dá)MICA的腫瘤細(xì)胞殺傷活性明顯高于低表達(dá)者或者陰性者，殺傷活性增強(qiáng)的機(jī)理可能與腫瘤細(xì)胞MICA等配體的表達(dá)上調(diào)誘導(dǎo)NK細(xì)胞的活化有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用不同濃度阿托伐他汀作用48 h后的HCT-116、SW-480和Caco-2細(xì)胞與NK細(xì)胞配置成10∶1效靶比，發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞對(duì)HCT-116細(xì)胞的殺傷活性在阿托伐他汀5～10 μmol/L時(shí)顯著高于對(duì)照組，對(duì)SW-480的殺傷活性在阿托伐他汀濃度5～20 μmol/L時(shí)較對(duì)照組顯著升高，而對(duì)Caco-2的殺傷活性在阿托伐他汀2.5～20 μmol/L的4個(gè)濃度組中均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證實(shí)阿托伐他汀可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞殺傷活性， 另外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示阿托伐他汀能上調(diào)上述3株結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，推測(cè)阿托伐他汀提高結(jié)腸癌細(xì)胞表面活化型受體NKG2D的配體MICA/B表達(dá)可能與NK細(xì)胞的殺傷活性升高有關(guān)。

MHCⅠ類相關(guān)基因A( Major histocompatibility complex class Ⅰ chain related gene A,MICA) 是位于HLA-B 位點(diǎn)上游約46 kb的基因，具有豐富的多態(tài)性[21]，目前報(bào)道有85種MICA等位基因， 其編碼產(chǎn)物介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)激時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，該分子在正常細(xì)胞和組織中不表達(dá)， 但癌變、感染或應(yīng)激狀態(tài)可上調(diào)其表達(dá),MICA具有免疫原性，是一種腫瘤相關(guān)性抗原[22]。 Li等[23]運(yùn)用免疫組化檢測(cè)82例卵巢癌患者腫瘤組織MICA/B表達(dá)，結(jié)果表明腫瘤組織中MICA/B表達(dá)率高達(dá)97.6 %, 而正常組織基本不表達(dá)。而Watson等[24]研究結(jié)果顯示 結(jié)直腸癌MICA高表達(dá)可作為結(jié)直腸癌預(yù)后良好的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)資料顯示不同濃度阿托伐他汀作用于結(jié)腸癌細(xì)胞48 h后，在阿托伐他汀濃度2.5 μmol/L及5 μmol/L組，HCT-116細(xì)胞MICA/B的表達(dá)率與對(duì)照組比較顯著升高，SW-480細(xì)胞MICA/B表達(dá)率在阿托伐他汀10 μmol/L及20 μmol/L組顯著高于對(duì)照組，而在2.5～40 μmol/L的5個(gè)濃度組均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證實(shí)阿托伐他汀可以上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞MICA/B的表達(dá)，增強(qiáng)其免疫原性，有利于NK細(xì)胞表面NKG2D受體的識(shí)別，提高NK細(xì)胞的殺傷活性。

本研究證實(shí)阿托伐他汀能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，相同藥物濃度對(duì)NK細(xì)胞的生長(zhǎng)無明顯影響。阿托伐他汀能上調(diào)HCT-116、SW-480和Caco-2表達(dá)MICA/B，增強(qiáng)NKG2D受體識(shí)別MICA/B的能力，從而達(dá)到增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的敏感性。為藥物與NK細(xì)胞聯(lián)合抗腫瘤提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)中及一些其他研究均表明存在著藥物劑量的依賴性，如何找到一種安全合適的劑量進(jìn)行抗腫瘤治療是后來者需要解決的問題。另既往相關(guān)研究及本實(shí)驗(yàn)均為體外實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)是否能達(dá)到同樣的效果，有待進(jìn)一步的研究。

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[收稿2015-11-20 修回2016-05-25]

(編輯 張曉舟)

Effect and mechanism of atorvastatin on cytotoxicity of human NK cells to colon cancer cells

JIHui-Chun，LIUJun-Quan，ZHOUYu，LIYi，CHENFu-Xing，F(xiàn)EISu-Juan.

SuqianFirstHospital，Suqian223800，China

Objective:To explore the mechanism of the cytotoxicity of human NK cells induced by atorvastatin to colon cancer cell lines.Methods: After colon cancer cells (HCT-116,SW-480,Caco-2) were cultured with different concentrations of atorvastatin,CCK-8 assay was used to assess the effect of atorvastatin on growth of colon cancer cells.The amplification of human NK cells was induced by SCGM medium in vitro.Automatic biochemical analyzer was applied to test the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells which cultured with different concentration of atorvastatin.FCM was used to detect the expression rate of MICA/B on the cells.Results: (1) The cultivation of NK cells: The proportion of NK cells attained to 93.1% from 4.5% after cultured for 10 days.(2) The effects of atorvastatin on the growth of the colon cancer cells: After cultured with atorvastatin,the inhibition rate of HCT-116 cells was higher than that in control when the density of atorvastatin increased from 5 μmol/L to 40 μmol/L after 48 h and from 1.25 μmol/L to 40 μmol/L after 96 h(P<0.05).Correlation analysis showed that the concentration of atorvastatin and the growth inhibition rate of HCT-116 cells were positively correlated(r[48 h]=0.13,r[96 h]=0.22,P<0.05).(3) The cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells effected after atorvastatin: In different atorvastatin concentrations groups,the cytotoxicity of NK cells to three colon cancer cell lines was all higher than that in control(P<0.05).The atorvastatin concentration was from 2.5 μmol/L to 10 μmol/L for HCT-116 cells,from 5 μmol/L to 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 20 μmol/L for Caco-2 cells.Among the three cell lines,the cytotoxicity of NK cells to HCT116 was the highest in the same concentration.(4)NK cells by atorvastatin cutting statins 96 h,the concentration of 20 mmol/L and 40 mmol/L inhibition rate was higher than that of control group,more than other groups on NK cell growth without significant effect. (5) The impact of atorvastatin on MICA/B expression of colon cancer cells: After cultured with different concentrations of atorvastatin,the expression of MICA/B on colon cancer cells was higher than that in control(P<0.05).The concentration was 2.5 μmol/L and 5 μmol/L for HCT-116 cells,10 μmol/L and 20 μmol/L for SW-480 cells,and from 2.5 μmol/L to 40 μmol/L for Caco-2 cells. Conclusion: Atorvastatin could inhibit the growth of colon cancer cells (HCT-116,SW-480 and Caco-2) in a dose-dependent manner;and it could enhance the cytotoxicity of NK cells to colon cancer cells;it also could promote the expression of MICA/B of colon cancer cells,and improve the immunogenicity of colon cancer cells.

Atorvastatin;Colon cancer cell lines;Natural killer cells;MICA/B

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.004

①本文受南京軍區(qū)醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新課題經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目(13MA039)資助。

姬會(huì)春(1982年-)，女，碩士，主治醫(yī)師， 主要從事消化道腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail：48587581@qq.com。

及指導(dǎo)教師：費(fèi)素娟(1963年-)，女，碩士，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，主要從事消化系腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail:feisj1031@yahoo.com.cn。

R735.3

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1000-484X(2017)02-0178-08

②中國(guó)人民解放軍97醫(yī)院，徐州221000。

③徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化科，徐州221000。