李金海，陳輝春，張海峰，翟華偉，林碎芳，戴華衛(wèi)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普通外科，浙江溫州 325200）

·論 著·

表柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞成瘤性及caveolin-1表達(dá)的影響

李金海，陳輝春，張海峰，翟華偉，林碎芳，戴華衛(wèi)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普通外科，浙江溫州 325200）

目的：探討表柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞成瘤性及其對(duì)腫瘤中細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1（caveolin-1）表達(dá)的影響。方法：以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)分為表柔比星組、環(huán)磷酰胺組、表柔比星+環(huán)磷酰胺組（聯(lián)合用藥組）和對(duì)照組（注射等體積0.9%氯化鈉溶液），采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤中caveolin-1表達(dá)，以圖像信號(hào)采集與分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描分析。結(jié)果：表柔比星組、環(huán)磷酰胺組和聯(lián)合用藥組的抑瘤率分別為31.28%、33.42%和66.14%。免疫組織化學(xué)法顯示給藥組腫瘤組織中caveolin-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，caveolin-1在聯(lián)合用藥組（253.22±38.52）腫瘤組織中表達(dá)較對(duì)照組（31.73±2.28）和表柔比星組（157.52±32.69）、環(huán)磷酰胺組（148.23±41.66）明顯增強(qiáng)，圖像灰度值統(tǒng)計(jì)分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：表柔比星和環(huán)磷酰胺可抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，二者聯(lián)用抑瘤作用增強(qiáng)，腫瘤生長(zhǎng)體積與caveolin-1的表達(dá)呈反向性，提示二者之間可能在抑瘤機(jī)制上存在相關(guān)性。

表柔比星；環(huán)磷酰胺；乳腺腫瘤；MDA-MB-231細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白

化療已被證實(shí)是控制乳腺癌進(jìn)展的有效治療方案，盡管乳腺癌術(shù)后化療方案在不斷改進(jìn)，但乳腺癌仍系女性惡性腫瘤之首，不斷明確藥物的作用機(jī)制，并改善惡性腫瘤的治療策略已成為當(dāng)今研究的重點(diǎn)[1]。細(xì)胞質(zhì)膜微囊蛋白-1（caveolin-1）是細(xì)胞質(zhì)膜微囊的功能蛋白，參與多種細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的內(nèi)吞以及細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，其缺失與乳腺癌的發(fā)生及分化、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[2]。本研究通過(guò)觀察臨床常用乳腺癌化療藥物對(duì)乳腺癌移植瘤中caveolin-1表達(dá)的影響，來(lái)探討caveolin-1在乳腺癌中的作用及化療機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與動(dòng)物人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，置于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的L-15培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5%CO2。BALBC裸鼠48只，雌性，體質(zhì)量26～28g，購(gòu)自南京君科生物工程有限公司。

1.2 藥品與試劑L-15培養(yǎng)液與0.25%胰蛋白酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；兔抗人caveolin-1蛋白多克隆抗體為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品，稀釋度為1:500。免疫組織化學(xué)SP試劑盒與DAB顯示劑購(gòu)自日本TaKaRa公司。表柔比星、環(huán)磷酰胺均購(gòu)自山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司。

1.3 建立裸鼠移植瘤模型

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組：48只裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（注射等體積0.9%氯化鈉溶液）、表柔比星組、環(huán)磷酰胺組、表柔比星+環(huán)磷酰胺組（聯(lián)合用藥組），每組12只。

1.3.2 模型建立：人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞株用L-15培養(yǎng)液置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，用胰酶消化，收集細(xì)胞后配制成4×106個(gè)細(xì)胞/mL的單細(xì)胞懸液，一次性注射器吸取細(xì)胞懸液0.2mL對(duì)健康雌性裸鼠右側(cè)腋窩處進(jìn)行皮下注射來(lái)構(gòu)建乳腺癌模型（4×106個(gè)細(xì)胞/只）。隔日測(cè)量1次腫瘤大小，計(jì)算腫瘤體積（V），V=ab2/2（a為長(zhǎng)度，b為寬度），以每組裸鼠移植瘤體積的平均值繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.3 藥物干預(yù)：裸鼠乳腺癌模型建成后10d，大部分局部形成瘤體（腫瘤直徑＞5mm）。第10天分組進(jìn)行腹腔注射藥物。參照徐叔云主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[3]及藥物使用說(shuō)明書(shū)，予表柔比星組腹腔注射表柔比星（10mg/kg），環(huán)磷酰胺組腹腔注射環(huán)磷酰胺（30mg/kg），聯(lián)合用藥組腹腔注射表柔比星（10mg/kg）、環(huán)磷酰胺（30mg/kg），對(duì)照組腹腔注射與聯(lián)合用藥組等體積的0.9%氯化鈉溶液。隔日給藥1次，給藥至第28天，共10次。

1.3.4 取材與固定：末次給藥后第2天將裸鼠處死，切除瘤體，稱(chēng)體質(zhì)量，甲醛固定切片。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)按照免疫組織化學(xué)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，將石蠟切片予二甲苯脫蠟，酒精脫水，用PBS沖洗3次，每次5min，3%H2O2孵育15min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；PBS再次洗滌3次后，滴加非免疫性動(dòng)物血清，37℃孵育15min，棄去非免疫動(dòng)物血清；滴加一抗，4℃過(guò)夜；PBS洗滌3次后再滴加二抗，37℃孵育10min；PBS洗滌3次后滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶復(fù)合物，37℃孵育15min，PBS洗滌3次后，用新鮮配制DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。利用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用±s表示，多樣本均數(shù)比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，組間比較用Student-Newman-Kewls法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠生長(zhǎng)及成瘤情況整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組裸鼠生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)其他異常發(fā)病。各組瘤體生長(zhǎng)情況分別為：對(duì)照組成瘤12例，表柔比星組11例，環(huán)磷酰胺組10例，聯(lián)合用藥組11例。第10天各組間瘤體平均體積差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組第10天平均瘤體體積比較（±s）

表1 各組第10天平均瘤體體積比較（±s）

組別例數(shù)平均瘤體體積（mm3）對(duì)照組12151.53±24.16表柔比星組11157.34±23.56環(huán)磷酰胺組10145.26±31.58聯(lián)合用藥組11148.34±30.84

2.2 化療藥物對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞成瘤性的影響

2.2.1 移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)：從乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種后第10天起，隔日測(cè)量1次腫瘤大小，繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)。用藥后腫瘤生長(zhǎng)速度減緩明顯，其中聯(lián)合用藥后腫瘤生長(zhǎng)速度減緩最為顯著。見(jiàn)圖1。

圖1 各組移植瘤生長(zhǎng)情況

2.2.2抑瘤率：腹腔注射藥物隔日給藥10次，末次給藥后的第2天處死裸鼠，瘤體稱(chēng)重（g），按如下公式計(jì)算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1-治療組平均腫瘤重量/對(duì)照組平均腫瘤重量）×100%。其中表柔比星+環(huán)磷酰胺組抑瘤率最高（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組抑瘤率的比較（±s）

表2 各組抑瘤率的比較（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與表柔比星組、環(huán)磷酰胺組比：bP＜0.05

組別例數(shù)瘤體平均質(zhì)量（g）抑瘤率（%）對(duì)照組121.21±0.320.00表柔比星組110.73±0.1831.28a環(huán)磷酰胺組100.68±0.2333.42a聯(lián)合用藥組110.37±0.0866.14ab

2.3 表柔比星及環(huán)磷酰胺對(duì)caveolin-1表達(dá)的影響根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果，caveolin-1的表達(dá)于各組裸鼠乳腺癌移植瘤組織細(xì)胞中，呈現(xiàn)為棕黃色顆粒樣著色。caveolin-1主要表現(xiàn)為胞質(zhì)表達(dá)，此外，細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)中也有表達(dá)，見(jiàn)圖2。圖像灰度值統(tǒng)計(jì)分析顯示，與對(duì)照組比較，表柔比星、環(huán)磷酰胺和聯(lián)合用藥組caveolin-1表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 各組移植瘤中caveolin-1表達(dá)的比較（±s）

表3 各組移植瘤中caveolin-1表達(dá)的比較（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與表柔比星組、環(huán)磷酰胺組比：bP＜0.05

組別例數(shù)caveolin-1對(duì)照組1231.73±2.28表柔比星組11157.52±32.69a環(huán)磷酰胺組10148.23±41.66a聯(lián)合用藥組11253.22±38.52ab

圖2 各組移植瘤組織中caveolin-1的表達(dá)（SP，×200）

3 討論

caveolins是細(xì)胞質(zhì)膜中發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)域的主要結(jié)構(gòu)成分，不僅參與細(xì)胞損傷的修復(fù)反應(yīng)，而且可調(diào)控細(xì)胞周期，并可通過(guò)參與調(diào)解肌動(dòng)蛋白的活動(dòng)，參與腫瘤細(xì)胞的分裂生殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過(guò)程[4]。caveolins作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的支架蛋白，能與多種信號(hào)分子如G蛋白α亞基、酪氨酸激酶受體等相互作用。目前已發(fā)現(xiàn)的caveolins成員共3種，分別系caveolin-1、caveolin-2和caveolin-3，它們?cè)诓煌M織中發(fā)揮各自作用[5]。已知caveolin-1與乳房上皮細(xì)胞增生的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究[6]證實(shí)，caveolin-1在人類(lèi)癌細(xì)胞中或經(jīng)癌基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中表達(dá)下降，在宮頸癌、胰腺癌、肉瘤等多種惡性腫瘤組織中caveolin-1蛋白低表達(dá)。相關(guān)研究[7]證實(shí)，caveolin-1的缺失與乳腺癌細(xì)胞的分裂增殖、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)，caveolin-1的檢測(cè)有望作為臨床判斷乳腺癌患者預(yù)后及轉(zhuǎn)移潛能的重要指標(biāo)應(yīng)用于臨床，并通過(guò)分析乳腺癌的發(fā)展及淋巴轉(zhuǎn)移情況，為患者提供靶向治療方案。

表柔比星聯(lián)合環(huán)磷酰胺（EC方案）作為乳腺癌術(shù)后經(jīng)典化療方案之一已成熟應(yīng)用于臨床。表柔比星可直接嵌入DNA堿基對(duì)之間，干擾癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，阻止mRNA的形成，并通過(guò)對(duì)拓樸異構(gòu)酶I I的抑制發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[8]；環(huán)磷酰胺為常見(jiàn)的烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥，在體內(nèi)微粒體功能氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為醛磷酰胺，進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)而分解成酰胺氮芥及丙烯醛，其中酰胺氮芥對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，從而發(fā)揮抗癌作用[9]。本研究中，表柔比星及環(huán)磷酰胺均可顯著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為31.28%和33.42%，單獨(dú)用藥抑瘤率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合用藥組結(jié)果顯示，其對(duì)人乳腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用明顯加強(qiáng)，抑瘤率為66.14%（P＜0.05）。

本研究結(jié)果顯示，在表柔比星與環(huán)磷酰胺作用下，乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖能力明顯減弱，二者聯(lián)合給藥后效果更為顯著。caveolin-1在表柔比星和環(huán)磷酰胺單獨(dú)用藥組中表達(dá)顯著增強(qiáng)，二者聯(lián)合用藥caveolin-1表達(dá)增強(qiáng)更為明顯。通過(guò)對(duì)不同用藥組的抑瘤率和腫瘤組織中caveolin-1的表達(dá)變化情況進(jìn)行分析，可推斷腫瘤的生長(zhǎng)體積與caveolin-1表達(dá)具有異向性，提示腫瘤的生長(zhǎng)與caveolin-1表達(dá)的降低密切相關(guān)。

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（本文編輯：吳昔昔）

Effects of epirubicin combined with cyclophosphamide on tumor formation and caveolin-1 expression in MDA-MB-231 breast cancer cells

LI Jinhai, CHEN Huichun, ZHANG Haifeng, ZHAI Huawei, LIN Suifang,

DAI Huawei. Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200

Objective:To investigate the effects of epirubicin combined with cyclophosphamide on tumor formation and the expression of caveolin-1 in MDA-MB-231 breast cancer cells.Methods:Human breast cancer xenografts in nude mice were established by using MDA-MB-231 cells. Epirubicin group, cyclophosphamide group, and epirubicin+cyclophosphamide group, and saline control group were set up. By using immunohistochemistry the expression of caveolin-1 was detected in xenografts. Image signal acquisition and analysis system was applied for image scanning analysis.Results:The rate of tumor suppressor in epirubicin group, cyclophosphamide group and epirubicin+cyclophosphamide group was 31.28%, 33.42% and 66.14% respectively. Immunohistochemistry demonstrated that the caveolin-1 expression in epirubicin+cyclophosphamide group (253.22±38.52) was signifcantly increased compared with saline control group (31.73±2.28), epirubicin group (157.52±32.69) and cyclophosphamide group (148.23±41.66) (P＜0.05).Conclusion:Epirubicin and cyclophosphamide can inhibit the growth of MDA-MB-231 cells with a synergic effect. The caveolin-1 expression is increased signifcantly in epirubicin+cyclophosphamide group, indicating caveolin-1 protein may play an important role in tumor cells growth.

epirubicin; cyclophosphamide; breast neoplasms; MDA-MB-231; caveolins

R735.35

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.007

2016-07-09

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20160420）。

李金海（1983-），男，山東棗莊人，主治醫(yī)師，碩士。