李鋒，黃盛斌，趙樹蕃，鄧輝

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，浙江溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州 325027；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科，廣東廣州 510120；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，浙江溫州 325027）

·論 著·

富血小板血漿對脂肪干細(xì)胞體外增殖及成脂分化的影響

李鋒1，黃盛斌2，趙樹蕃3，鄧輝4

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，浙江溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州 325027；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科，廣東廣州 510120；4.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，浙江溫州 325027）

目的：研究不同體積分?jǐn)?shù)富血小板血漿（PRP）對脂肪干細(xì)胞（ASCs）體外增殖及成脂分化的影響。方法：采用酶消化組織塊法分離培養(yǎng)ASCs，有限稀釋法克隆純化，檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物并進(jìn)行鑒定。改良兩步離心法從人全血中制備PRP。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）檢測在培養(yǎng)基中分別添加不同體積分?jǐn)?shù)（0、10%、20%、30%）PRP對ASCs增殖的影響。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)PRP對ASCs成脂分化相關(guān)基因過氧化物酶體增殖體激活受體γ（PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪分化相關(guān)蛋白（adipophilin）表達(dá)的影響。結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加PRP顯著促進(jìn)了ASCs的增殖（P＜0.01）；與10% PRP相比，20% PRP或30% PRP更好地促進(jìn)了ASCs的增殖（P＜0.01），而20% PRP與30% PRP相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PRP時，PPARγ、LPL、adipophilin表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），而加入PRP的體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%時，對PPARγ、adipophilin表達(dá)的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），以20% PRP對LPL表達(dá)的促進(jìn)作用最為明顯（P＜0.01）。結(jié)論：PRP可以促進(jìn)ASCs體外增殖及成脂分化，對脂肪組織再生有重要研究價(jià)值。

富血小板血漿；脂肪干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；成脂分化

各種原因?qū)е碌能浗M織缺損不僅損毀患者外部容貌，還嚴(yán)重影響其心理、社會功能等，一直是創(chuàng)傷整形和修復(fù)重建外科所面臨的難題[1]。目前臨床軟組織修復(fù)重建的常用方法包括人工合成替代物植入、自體組織瓣移植、自體脂肪移植[2]。各種人工合成材料植入人體后容易破裂泄漏、移位、產(chǎn)生異物排斥反應(yīng)、不能進(jìn)行功能改建[3]，而液態(tài)硅膠注射更是被許多國家明令禁止；自體組織瓣移植實(shí)際屬于“拆東墻補(bǔ)西墻”，塑形難、組織量難以保證，且會造成供區(qū)損傷及繼發(fā)畸形；自體脂肪移植的存活率較低，一般為30%～60%[4]，這極大地影響了自體脂肪移植的遠(yuǎn)期療效。近年來，組織工程技術(shù)迅猛發(fā)展，為軟組織缺損的重建帶來了新的希望。脂肪組織工程包括種子細(xì)胞、支架材料及生長因子3個要素[3]。

2001年，ZUK等[5]首次發(fā)表關(guān)于脂肪組織中存在多能干細(xì)胞的研究后，脂肪干細(xì)胞（adiposederivedstemcells，ASCs）成為研究熱門。ASCs可以從脂肪組織中大量獲取，具有組織來源豐富、取材方便、獲取過程微創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，且ASCs具有更穩(wěn)定的增殖活性、自我更新能力和更強(qiáng)的成脂、成骨、成內(nèi)皮細(xì)胞等多向分化潛能[6]，因此，ASCs是脂肪組織工程中促進(jìn)脂肪再生的理想種子細(xì)胞。

富血小板血漿（platelet-richplasma，PRP）是自體全血經(jīng)過多次差速離心得到的含有高濃度血小板的血漿[7]，其被激活后可釋放出高濃度的血小板衍化生長因子（plateletderivedgrowthfactor，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblasticgrowthfactor，F(xiàn)GF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、胰島素樣生長因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）、表皮生長因子（epidermalgrowthfactor，EGF）等[8]，這些細(xì)胞生長因子對細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生、增殖、分化、新生血管形成等起到誘導(dǎo)促進(jìn)作用；激活后的PRP還含有纖維蛋白、纖維黏連蛋白、玻璃黏連蛋白等蛋白質(zhì)[9]，形成精細(xì)的纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、防止細(xì)胞流失功能。本研究旨在探討PRP對ASCs體外增殖及成脂分化的影響，觀察將PRP及ASCs應(yīng)用于脂肪組織工程的可行性。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器I型膠原酶（collagenasetype I；Hyclone，美國）、α-MEM培養(yǎng)基（alphamodifiedminimumessentialmedium，α-MEM；Hyclone，美國）、胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS；Hyclone，美國）、雙抗（青霉素、鏈霉素；Millipore，USA）、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國）、牛血清白蛋白（bovineserumalbumin，BSA；AidScience，上海）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cellcountingkit-8，CCK-8；Dojindo，日本）、RNAisoPlusTotalRNA提取試劑（TaKaRa，日本）、PrimeScript?RTreagentkit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，日本）、SYBR?PremixExTaqTMPerfectRealTime（TaKaRa，日本）；血細(xì)胞分析儀（SysmexXS-800i；Sysmex，日本）、ThermoKS12超凈工作臺（Thermo，美國）、恒溫水浴箱（Heto-Hoten，丹麥）、倒置相差顯微鏡（LeicaDMI6000，德國）、酶標(biāo)儀（Thermo，美國）、低速離心機(jī)（湘儀，湘潭）、溫控臺式離心機(jī)SORVALLRLEGENDT（Thermo，美國）、微量移液器（Thermo，美國）。

1.2 ASCs的分離培養(yǎng)和鑒定①ASCs分離培養(yǎng)：脂肪抽吸術(shù)中獲取約15mL人腹部皮下脂肪組織；于超凈工作臺內(nèi)用加有雙抗的無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate-bufferedsaline，PBS）反復(fù)漂洗脂肪組織，用眼科剪充分剪碎并去除肉眼可見的血管及筋膜組織；加入等體積0.15%I型膠原酶混勻于37℃恒溫?fù)u床消化30min；在200×g下離心10min，去除上層油脂、脂肪組織等，將離心管底部的細(xì)胞團(tuán)用含10%FBS、1%雙抗的α-MEM培養(yǎng)基重懸，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；原代培養(yǎng)96h后予以更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞；倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況，待細(xì)胞在培養(yǎng)瓶底達(dá)90%融合時，用0.25%胰蛋白酶予以消化并接種至新的培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。②ASCs表面分子標(biāo)志檢測：取生長狀態(tài)良好的第3代ASCs，待其達(dá)到90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化，PBS清洗后于低速離心機(jī)1000r/min離心5min，用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106/mL；將所制備單細(xì)胞懸液分裝入10支1.5mLEP管，每支1.0mL，1000r/min離心5min，用100μLPBS重懸細(xì)胞；在上述10支EP管中，隨機(jī)選1支不加抗體作為空白對照，其余9支分別加入20μLCD14-FITC、20μLCD29-PE、20μLCD31-FITC、20μLCD34-FITC、20μLCD44-FITC、20μLCD45-FITC、20μLCD49d-PE、5μLCD105-PE、20μLCD106-PE于4℃避光孵育30min；孵育完畢后，向各EP管中加入1mLPBS重懸細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄去上清；用300μLPBS重懸細(xì)胞，經(jīng)過200目細(xì)胞篩過濾轉(zhuǎn)移至流式離心管中，將各流式離心管放入流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 PRP的制備及血小板計(jì)數(shù)將健康志愿者捐獻(xiàn)的400mL全血平均分裝在20支離心管中，從每支離心管中吸取0.5mL全血，利用血細(xì)胞分析儀自動計(jì)數(shù)其中的血小板數(shù)量。將20支離心管130×g離心15min，可見其中的血液大致分為上下2層：上層為血漿，下層為紅細(xì)胞；從每支離心管中分別吸出3mL血漿備用。將20支離心管中剩余的血液分別用等體積的PBS進(jìn)行稀釋后緩慢加入含有淋巴細(xì)胞分離液的另外20支離心管，使血液與淋巴細(xì)胞分離液之間界限清晰；將以上20支離心管250×g離心15min，可見其中的液體從上到下分為界限清晰的4層：血漿層、富含血小板及白細(xì)胞的棕黃層、淋巴細(xì)胞分離液層、紅細(xì)胞層；使用微量移液器小心吸取20支離心管中的棕黃層，用PBS離心清洗（200×g、4℃、10min）2次后分別用之前提取的3mL血漿重懸，吹打混勻即得PRP；利用血細(xì)胞分析儀對以上20份3mL的PRP樣本分別進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。將所得20份PRP樣本混合均勻，備用。

PRP的激活：取上述PRP，分裝在20支離心管中，每支離心管中加入0.5mL人凝血酶溶液（由500U凝血酶凍干粉溶解在0.5mL1%CaCl2溶液制得，現(xiàn)制現(xiàn)用），可見PRP即被激活成凝膠狀；將離心管置于4℃過夜，以使其中的成分充分反應(yīng)，第2日晨即可見有上清液滲出。將各離心管3000×g離心10min，收集上清液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 不同體積分?jǐn)?shù)PRP對ASCs增殖的影響采用CCK-8檢測PRP對ASCs體外增殖的影響。待第2代ASCs生長達(dá)到約90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按以下5個分組制備ASCs細(xì)胞懸液：①陰性對照組：3.0mLα-MEM+1.5×105ASCs；②陽性對照組：3.0mLα-MEM+10%FBS+1.5×105ASCs；③10%PRP組：3.0mLα-MEM+10%PRP+1.5×105ASCs；④20%PRP組：3.0mLα-MEM+20%PRP+1.5×105ASCs；⑤30%PRP組：3.0mLα-MEM+30%PRP+1.5×105ASCs。將上述各組ASCs細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板中，每組均接種28孔，每孔均含細(xì)胞懸液100μL，在培養(yǎng)第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7天后，每組各取培養(yǎng)板內(nèi)4孔，分別加入10μLCCK-8溶液（注意輕手操作，不要在孔內(nèi)生成氣泡），置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)避光孵育3h，用酶標(biāo)儀測定各孔在450nm處的吸光度值（opticaldensity，OD）。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD值的±s為縱坐標(biāo)，繪制ASCs的生長曲線。

1.5 不同體積分?jǐn)?shù)PRP對ASCs成脂分化的影響取貼壁生長達(dá)90%左右融合的第3代ASCs，在以下5種環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)：①陰性對照組：α-MEM+10%FBS；②陽性對照組：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（α-MEM培養(yǎng)基中加入10%FBS，1μmol/L地塞米松，5mg/L胰島素，0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，0.2mmol/L吲哚美辛）；③10%PRP組：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基+10%PRP；④20%PRP組：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基+20%PRP；⑤30%PRP組：成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基+30%PRP。各組ASCs誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，提取各組細(xì)胞總RNA，利用KaTaRaPrimeScript?RTreagentKit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過ABIPRISMR?7300RealTimePCR儀擴(kuò)增，檢測各組細(xì)胞中成脂分化相關(guān)基因過氧化物酶體增殖體激活受體γ（peroxisomeproliferators-activatedreceptorsγ，PPARγ）、脂蛋白脂肪酶（lipoprteinlipase，LPL）、脂肪分化相關(guān)蛋白（adipophilin）以及內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）的表達(dá)情況。引物設(shè)計(jì)見表1。質(zhì)量控制及數(shù)據(jù)分析：實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組復(fù)孔，所有操作均在相同條件下由同一人完成，盡量減少實(shí)驗(yàn)的誤差。

表1 RT-PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法利用7300SystemSDS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行解析，按照2-△△Ct=2-[（Ct目的基因- Ct內(nèi)參基因）誘導(dǎo)后細(xì)胞-（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）陰性對照細(xì)胞]對基因的相對表達(dá)進(jìn)行分析。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASCs的分離與培養(yǎng)原代培養(yǎng)72h左右可見貼壁細(xì)胞逐漸增多，見圖1A。原代培養(yǎng)9d左右細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合，此時應(yīng)及時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞生長較迅速，一般3～4d即可達(dá)90%融合；且經(jīng)過1～2代的傳代培養(yǎng)后，得到較為純化的ASCs，為成纖維細(xì)胞樣長梭形，形態(tài)均一，見圖1B。

圖1 ASCs的培養(yǎng)圖（×100）

2.2 ASCs表面分子標(biāo)志的檢測流式細(xì)胞術(shù)檢測第3代ASCs表面分子標(biāo)志表明，ASCs陽性表達(dá)CD29（為95.8%）、CD44（為95.9%）、CD49d（為50.6%）、CD105（為95.2%），而陰性表達(dá)CD14（為1.4%）、CD31（為2.0%）、CD34（為1.8%）、CD45（為4.2%）、CD106（為5.5%），見圖2。

2.3 全血及PRP中的血小板檢測本研究對獲取的20份PRP樣本進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，并與全血中的血小板計(jì)數(shù)比較，見表2。全血中的血小板計(jì)數(shù)為（171.0±32.3）×109/L，PRP中的血小板計(jì)數(shù)為（1531.3±297.9）×109/L；符合PRP中的血小板濃度應(yīng)達(dá)到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

2.4 PRP對ASCs增殖的影響CCK-8所得各組ASCs生長曲線見圖3，第4天時各組細(xì)胞的OD值統(tǒng)計(jì)學(xué)比較見圖4。CCK-8結(jié)果示：與陰性對照組相比，培養(yǎng)基中添加FBS或PRP均明顯促進(jìn)了ASCs的增殖（P＜0.01）；各濃度組PRP對ASCs增殖的促進(jìn)作用明顯優(yōu)于FBS（P＜0.01）；與10%PRP組相比，20%PRP組或30%PRP組更好地促進(jìn)了ASCs的增殖（P＜0.01），而20%PRP組與30%PRP組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 PRP對ASCs成脂分化的影響ASCs在不同的條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，RT-PCR結(jié)果見圖5。與陰性對照組相比，陽性對照組的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基明顯促進(jìn)了ASCs的成脂分化，成脂相關(guān)基因PPARγ、LPL、adipophilin表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PRP時，PPARγ、LPL、adipophilin表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），而加入PRP的體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%時，對PPARγ、adipophilin表達(dá)的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），20%PRP組對LPL表達(dá)的促進(jìn)作用最為明顯（P＜0.01）。

3 討論

本研究首先利用膠原酶消化法，從人離體脂肪組織中分離培養(yǎng)ASCs，并對細(xì)胞分子表面標(biāo)志加以檢測。經(jīng)過傳代純化后，ASCs呈梭形貼壁生長，且具有較強(qiáng)的增殖能力。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcell，MSCs）通過分子表面抗原黏附于細(xì)胞外基質(zhì)[10]，ASCs陽性表達(dá)黏附分子CD29及CD44，使其黏附于細(xì)胞外基質(zhì)；同時ASCs還陽性表達(dá)CD105，與CD29、CD44一起體現(xiàn)了ASCs具有MSCs的表面分子特性[11]；陰性表達(dá)CD14、CD31、CD34及CD45說明該實(shí)驗(yàn)所得的ASCs不是造血/白細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞[12]；此外，ASCs陽性表達(dá)CD49d，而陰性表達(dá)CD106，這與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowderivedstemcells，BMSCs）正好相反[13]，結(jié)合細(xì)胞組織來源，從而說明了本研究所獲取的細(xì)胞并非BMSCs。

本研究采用BAUSSET等[14]建議的兩步離心法來制備PRP；另外，在此基礎(chǔ)上選用沉降系數(shù)在紅細(xì)胞與血小板之間的人淋巴細(xì)胞分離液，使離心過程中紅細(xì)胞與棕黃層完全分隔開來，去除了紅細(xì)胞的摻雜，進(jìn)一步提升了血小板回收率，本研究得到的PRP中血小板濃度為全血中的8.95倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足PRP中的血小板濃度應(yīng)達(dá)到全血中的5倍以上[7]的基本要求。

圖2 第3代ASCs表面分子標(biāo)志的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

表2 全血及PRP中血小板計(jì)數(shù)結(jié)果（×109/L）

CCK-8檢測表明，培養(yǎng)基中加入PRP能夠明顯促進(jìn)ASCs的增殖，這是因?yàn)镻RP激活后能夠釋放高濃度的PDGF、TGF-β、FGF等生長因子，它們能夠刺激、促進(jìn)MSCs的有絲分裂，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，從而加速細(xì)胞增殖[15-16]。本研究進(jìn)一步比較了不同量的PRP對ASCs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)20%為最適宜的用量。盡管有少數(shù)關(guān)于PRP對ASCs增殖影響的研究，但對于PRP的最佳用量卻結(jié)論不一。KAKUDO等[17]認(rèn)為培養(yǎng)基中添加5%PRP能夠明顯促進(jìn)ASCs的增殖，但是當(dāng)增加到20%時基本無促進(jìn)作用；而LIU等[18]卻報(bào)道PRP促進(jìn)ASCs增殖的最佳濃度為10%～12.5%。分析原因可能由不同的研究中PRP的制備方法、內(nèi)含血小板或生長因子的濃度不同所致。

圖3 不同培養(yǎng)條件下ASCs的增殖曲線

圖4 各組ASCs第4天時OD值比較

圖5 各組ASCs成脂分化相關(guān)基因表達(dá)比較

RT-PCR結(jié)果顯示，ASCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，成脂分化相關(guān)基因PPARγ、LPL、adipophilin表達(dá)上調(diào)，而在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PRP使這些基因的表達(dá)進(jìn)一步升高。既往研究表明：PPARγ在脂肪生成相關(guān)基因的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]；LPL是脂肪生成過程中的一種脂質(zhì)交換酶[20]；adipophilin與細(xì)胞和組織中的脂質(zhì)堆積密切相關(guān)[21]。這些基因表達(dá)的上調(diào)說明PRP促進(jìn)了ASCs的成脂分化。這或許是由PRP中所含的TGF引起，有研究表明TGF超家族成員之一的骨形成蛋白-2（bonemorphogeneticprotein-2，BMP-2）可以誘導(dǎo)間充質(zhì)祖細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化[22-23]。另外，有研究[24]表明，PRP可與胰島素協(xié)同作用一起促進(jìn)ASCs的成脂分化。這些研究與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明了PRP能夠促進(jìn)ASCs向脂肪細(xì)胞分化。

綜上所述，我們制備的PRP對ASCs的增殖及成脂分化均有一定促進(jìn)作用，且以20%體積分?jǐn)?shù)PRP作用為佳；本研究為PRP、ASCs應(yīng)用于脂肪組織再生提供了前期理論基礎(chǔ)。

[1] PATRICK C W JR. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair[J]. Anat Rec, 2001, 263(4)∶ 361-366.

[2] STERODIMAS A, DE FARIA J, NICARETTA B, et al. Tissue engineering with adipose-derived stem cells (ADSCs)∶current and future applications[J]. J Plast Reconstr Aesthet Surg, 2010, 63(11)∶ 1886-1892.

[3] STOSICH M S, MAO J J. Adipose tissue engineering from human adult stem cells∶ clinical implications in plastic and reconstructive surgery[J]. Plast Reconstr Surg, 2007, 119(1)∶71-83.

[4] OYSU C, SEMIZ-OYSU A, EKINCI G, et al. Evaluation of autologous fat volume with magnetic resonance imaging following vocal cord injection[J]. Kulak Burun Bogaz Ihtisas Dergisi, 2004, 13(3-4)∶ 67-71.

[5] ZUK P A, ZHU M, MIZUNO H, et al. Multilineage cells from human adipose tissue∶ implications for cell-based therapies[J]. Tissue Eng, 2001, 7(2)∶ 211-228.

[6] ZHU Y, LIU T, SONG K, et al. Adipose-derived stem cell∶ a better stem cell than BMSC[J]. Cell Biochem Funct, 2008, 26(6)∶ 664-675.

[7] MARX R E. Platelet-rich plasma (PRP)∶ what is PRP and what is not PRP?[J]. Implant Dent, 2001, 10(4)∶ 225-228.

[8] MEHTA S, WATSON J T. Platelet rich concentrate∶ basic science and current clinical applications[J]. J Orthop Trauma, 2008, 22(6)∶ 432-438.

[9] MARX R E. Platelet-rich plasma∶ evidence to support its use[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2004, 62(4)∶ 489-496.

[10] LANGE C, SCHROEDER J, STUTE N, et al. High-potential human mesenchymal stem cells[J]. Stem Cells Dev, 2005, 14(1)∶ 70-80.

[11] ZUK P A, ZHU M, ASHJIAN P, et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J]. Mol Biol Cell, 2002, 13(12)∶ 4279-4295.

[12] CHAMBERLAIN G, FOX J, ASHTON B, et al. Concise review∶ mesenchymal stem cells∶ their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing[J]. Stem Cells, 2007, 25(11)∶ 2739-2749.

[13] DE UGARTE D A, ALFONSO Z, ZUK P A, et al. Differen-tial expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow[J]. Immunol Lett, 2003, 89(2-3)∶ 267-270.

[14] BAUSSET O, GIRAUDO L, VERAN J, et al. Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product[J]. Biores Open Access, 2012, 1(3)∶ 115-123.

[15] GRUBER R, KARRETH F, KANDLER B, et al. Platelet-released supernatants increase migration and proliferation, and decrease osteogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells under in vitro conditions[J]. Platelets, 2004, 15(1)∶ 29-35.

[16] 梁茜, 潘福強(qiáng), 梁羽冰, 等. 富血小板血漿對人脂肪來源干細(xì)胞增殖率的影響[J]. 中國美容醫(yī)學(xué), 2016, 25(3): 36-39.

[17] KAKUDO N, MINAKATA T, MITSUI T, et al. Proliferation-promoting effect of platelet-rich plasma on human adipose-derived stem cells and human dermal fibroblasts[J]. Plast Reconstr Surg, 2008, 122(5)∶ 1352-1360.

[18] LIU Y, ZHOU Y, FENG H, et al. Injectable tissue-engineered bone composed of human adipose-derived stromal cells and platelet-rich plasma[J]. Biomaterials, 2008, 29(23)∶3338-3345.

[19] LEHRKE M, LAZAR M A. The many faces of PPARgamma[J]. Cell, 2005, 123(6)∶ 993-999.

[20] MEAD J R, IRVINE S A, RAMJI D P. Lipoprotein lipase∶ structure, function, regulation, and role in disease[J]. J Mol Med (Berl), 2002, 80(12)∶ 753-769.

[21] RUSSELL T D, PALMER C A, ORLICKY D J, et al. Cytoplasmic lipid droplet accumulation in developing mammary epithelial cells∶ roles of adipophilin and lipid metabolism[J]. J Lipid Res, 2007, 48(7)∶ 1463-1475.

[22] DATE T, DOIGUCHI Y, NOBUTA M, et al. Bone morphogenetic protein-2 induces differentiation of multipotent C3H10T1/2 cells into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes in vivo and in vitro[J]. J Orthop Sci, 2004, 9(5)∶ 503-508.

[23] FUX C, MITTA B, KRAMER B P, et al. Dual-regulated expression of C/EBP-alpha and BMP-2 enables differential differentiation of C2C12 cells into adipocytes and osteoblasts [J]. Nucleic Acids Res, 2004, 32(1)∶ e1.

[24] CERVELLI V, SCIOLI M G, GENTILE P, et al. Plateletrich plasma greatly potentiates insulin-induced adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells through a serine/threonine kinase Akt-dependent mechanism and promotes clinical fat graft maintenance[J]. Stem Cells Transl Med, 2012, 1(3)∶ 206-220.

（本文編輯：吳昔昔）

Effects of platelet-rich plasma on proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells in vitro

LI Feng1, HUANG Shengbin2, ZHAO Shupan3, DENG Hui4. 1.Department of Oral and Maxillofacial

Surgery, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Institute of Oral Science, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 3.Department of Stomatology, Guangzhou Women and Children’s Medical Center, Guangzhou Medical University, Guangzhou, 510120; 4.Department of Periodontics, Hospital of Stomatology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To evaluate the effects of platelet-rich plasma (PRP) on the proliferation and adipogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) in vitro.Methods:ASCs were isolated and cultured from human free fat tissue. The surface molecular markers of ASCs were determined with fow cytometry. PRP was prepared from human whole blood. Cell count kit-8 (CCK-8) and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to evaluate the infuence of PRP (0, 10%, 20%, and 30%) in medium on ASC proliferation and adipogenic differentiation, respectively.Results:The platelet count in PRP was over 5 times of that in whole blood. CCK-8 showed that medium supplemented with PRP promoted ASCs proliferation signifcantly and the stimulatory potency of 20% PRP was the greatest. RT-PCR detected upregulated adipogenic-related genes, such as peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), lipoprotein lipase (LPL) and adipophilin.Conclusion:These results indicates PRP facilitated the proliferation and adipogenic differentiation of ASCs, which is of great value for adipose tissue engineering.

platelet-rich plasma; adipose-derived stem cells; cell proliferation; adipogenic differentiation

R78

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.002

2016-05-31

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81500817）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY15H140008）；溫州市公益技術(shù)研究醫(yī)學(xué)項(xiàng)目（Y20140708）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃一般項(xiàng)目（2016KYB184）。

李鋒（1985-），男，山東泰安人，主治醫(yī)師，博士。

鄧輝，副教授，副主任醫(yī)師，Email：dh0726@163.com。