岑丹維，宋易玲，張嬋瓊，毛珊珊，葉曉鮮，陳俊，陳韶，朱珊麗，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035）

·論 著·

綠膿桿菌外毒素PE38KDEL重組蛋白原核表達及多克隆抗體的制備

岑丹維，宋易玲，張嬋瓊，毛珊珊，葉曉鮮，陳俊，陳韶，朱珊麗，張麗芳

（溫州醫(yī)科大學(xué)分子病毒與免疫研究所，浙江溫州 325035）

目的：通過原核表達系統(tǒng)制備綠膿桿菌外毒素（PE）PE38KDEL重組蛋白，并制備特異性兔免疫血清多克隆抗體。方法：選擇PE部分基因（PE38），并將C端609-613位的氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL，通過原核密碼子優(yōu)化（http://www.jcat.de）后全基因合成，經(jīng)Hind I I I和Xho I酶切位點克隆至pET32a（+）原核表達載體，構(gòu)建pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒，將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細菌中，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達重組PE38KDEL蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析法制備純化蛋白，采用SDS-PAGE電泳和Western blot法進行鑒定。進一步將PE38KDEL純化蛋白免疫日本大耳白兔制備PE38KDEL特異性多克隆抗體，并采集免疫前后血清，用ELISA法檢測免疫后的抗體反應(yīng)和效價。結(jié)果：成功構(gòu)建了pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒。在原核表達系統(tǒng)中該質(zhì)粒成功表達并獲得純化的PE38KDEL蛋白。SDSPAGE電泳顯示蛋白分子質(zhì)量約為57 kDa，與預(yù)計理論值大小相符合。Western blot法檢測結(jié)果顯示，在分子質(zhì)量約57 kDa處出現(xiàn)單一條帶。通過免疫大耳白兔成功獲得PE38KDEL特異性多克隆抗體，抗體效價高達1:60 000。結(jié)論：PE38KDEL蛋白可誘導(dǎo)兔產(chǎn)生特異性多克隆血清抗體，且該抗體效價高、特異性強，為進一步研究基于PE38KDEL毒素的生物學(xué)和免疫學(xué)等功能奠定了基礎(chǔ)。

銅綠假單胞菌；外毒素類；PE38KDEL；多克隆抗體；兔

綠膿桿菌在自然界分布廣泛，常引起人類傷口的化膿性感染，由于感染后膿液和滲出液呈綠色，亦被稱為銅綠色假單胞菌，其致病特點為致病力較低但抗藥性強。綠膿桿菌分泌的綠膿桿菌外毒素（Pseudomonasaeruginosaexotoxin，PE）可通過抑制細胞蛋白質(zhì)合成，發(fā)揮損傷和殺死細胞的作用[1]。由于這種特性，將PE與特定的載體結(jié)合（如單克隆抗體、細胞因子等）組成相應(yīng)的免疫毒素，可用于腫瘤的靶向治療研究[2]。相對于傳統(tǒng)的化療和放療，免疫毒素治療具有靶向性，能特異性殺傷腫瘤細胞，近年來，PE類重組免疫毒素被廣泛報道[3]。將PE的C端REDLK突變?yōu)镵DEL獲得的PE38KDEL，進入細胞的跨膜能力和毒素作用活性變得更強，因此PE38KDEL更適合作為免疫毒素的毒素部分進行研究[4]。本研究通過對PE毒素密碼子的原核優(yōu)化及堿基突變，獲得經(jīng)修飾的PE38KDEL基因，并通過全基因合成及分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了原核表達重組質(zhì)粒，經(jīng)原核系統(tǒng)制備PE38KDEL重組蛋白，進一步免疫日本大耳白兔制備了PE38KDEL特異性兔多克隆抗體，為基于PE38KDEL免疫毒素的生物學(xué)和免疫學(xué)等功能研究提供了必要的檢測抗體。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與酶類：蛋白電泳marker、限制性內(nèi)切酶HindIII和XhoI、T4DNA連接酶均購自美國Fermentas公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒、1kbDNAmarker、DL2000DNAmarker、2×TaqPCRMix、質(zhì)粒小提試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，Cycle-pure純化試劑盒、完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑均購自美國Sigma公司，氨芐青霉素購自山東齊魯制藥有限公司，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）購自德國默克公司，鼠抗His單克隆抗體購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（H+L）抗體、山羊抗鼠IgG（H+L）抗體購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，鎳螯合親和層析膠體（Ni-NTAAgarose）購自美國Qiagen公司，脫脂奶粉購自美國BD公司，單組分TMB顯色液購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒和菌株：pET32a（+）克隆載體和E.coliBL21（DE3）均為本實驗室原先保存。

1.1.3 實驗動物：健康日本大耳白兔，雄性，體質(zhì)量1.8～2.4kg，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號：SYXK（浙）2014-0006。

1.2 方法

1.2.1 PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建：從GenBank中獲取PE全長毒素（AE004091.2）的全氨基酸序列后缺失整個DomainIa區(qū)獲得PE40氨基酸序列，在其基礎(chǔ)上將第365-第380位的氨基酸缺失，并將羧基端REDLK通過突變修飾為KDEL，從而獲得PE改造后的PE38KDEL氨基酸序列，通過生物網(wǎng)站進行原核表達密碼子優(yōu)化（http://www.jcat.de/）獲得PE38KDEL密碼子優(yōu)化全基因序列，交由上海生物工程有限公司全基因合成后，克隆至pET32a（+）載體，構(gòu)建pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細菌，利用氨芐抗性篩選陽性克隆，并用特異性引物（OzlfFT：CCGCCGAAAGACGAACTGTAACTCGAG，OzlfRT：CCGCCGAAAGACGAACTGTAACTCGAG）進行PCR驗證，提取陽性克隆菌株DNA后經(jīng)酶切和測序鑒定。質(zhì)粒的提取、酶切、酶連、轉(zhuǎn)化等按照分子克隆技術(shù)常規(guī)方法進行。

1.2.2 PE38KDEL重組蛋白表達、鑒定及純化：將pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21（DE3）后，接種至1mL含100μg/mL終濃度氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，250r/min震蕩培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)至吸光度A600=0.6～0.8時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG，37℃，250r/min誘導(dǎo)8h后12000r/min離心5min收集細菌菌體，加入40μL8mol/L尿素溶解菌體沉淀，經(jīng)100℃加熱煮沸5min破菌，取樣進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。小鼠抗His單克隆抗體為一抗（1:10000），HRP-羊抗鼠IgG（H+L）作為二抗，進行Westernblot分析和鑒定。經(jīng)SDS-PAGE電泳和Westernblot法鑒定后進行重組蛋白的純化，即進一步收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液，經(jīng)PBS洗滌2次后加入蛋白酶抑制劑PMSF至終濃度為1mmol/L，冰浴中超聲破菌，12000r/min離心20min收集上清，用Ni-NTAAgarose親和層析柱純化和收集純化后的蛋白。

1.2.3 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗體的制備及效價分析：PE38KDEL純化蛋白免疫日本大耳白兔，分為3組，分別是PE38KDE10μg組、PE38KDE50μg組、PE38KDE100μg組，同時設(shè)置TRX-His蛋白對照組和PBS對照組。分別于1、3、5周時進行免疫，首次免疫抗原與完全弗氏佐劑等量混合，充分乳化，第2、第3次免疫抗原與不完全弗氏佐劑等量混合，每次每只家兔于背部皮下多點注射。同時，于0、2、4、6周時兔耳緣靜脈取血，于第8周時心臟取血，收集的血液于37℃水浴鍋中靜置30min后，放置于高速離心機中，4℃，3000r/min離心10min，分離上層血清并置于-80℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

用間接ELISA法檢測0、2、4、6、8周時的血清抗體反應(yīng)。即將PE38KDEL純化蛋白按終濃度10μg/mL包被ELISA板，放置于4℃包被過夜，經(jīng)PBS洗滌、3%脫脂牛奶封閉，將免疫的兔血清稀釋為1:100，二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG（H+L）。反應(yīng)結(jié)果置于BioElx800酶標儀中，于450nm波長處讀取吸光度（A）值，所有血清標本均重復(fù)3孔，以TRX-His蛋白和PBS免疫血清作為對照組。同時ELI-SA法檢測免疫6周后血清抗體效價，方法同上，經(jīng)洗滌、封閉后將6周時的血清分別倍比稀釋為1:100、1:500、1:2500、1:12500、1:62500、1:312500，所有血清標本均重復(fù)3孔。

1.2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗體特異性分析鑒定：誘導(dǎo)表達后的PE38KDEL菌株和純化后的PE-38KDEL蛋白經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜，以1:10000稀釋的兔多克隆血清抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔抗體IgG（H+L）為二抗，進行Westernblot檢測，ECL發(fā)光液顯色分析。

2 結(jié)果

2.1 pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

通過全基因合成PE38KDEL片段，通過HindI I I和XhoI酶切位點將其克隆至pET32a（+）載體相應(yīng)位置，成功構(gòu)建了pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒（見圖1A）。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，在約7000bp位置可見清晰單一的重組質(zhì)粒條帶。通過特異性引物PCR擴增鑒定，在圖1B中第3泳道可見約1100bp單一條帶，證明了所構(gòu)建重組質(zhì)粒正確。進一步測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒構(gòu)建完全正確（見圖1C）。

2.2 pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒原核表達及鑒定通過將重組質(zhì)粒導(dǎo)入BL21大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，裂解菌體后取上清小樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分析可見誘導(dǎo)后在57kDa位置出現(xiàn)蛋白條帶，未誘導(dǎo)的重組菌體則無此條帶。通過Ni-NTA親和層析，在57kDa位置同樣出現(xiàn)單一清晰的電泳條帶并且與理論預(yù)計蛋白大小相符，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)及純化成功（見圖2A）。通過Westernblot法（一抗為His鼠單克隆抗體）檢測，在57kDa處出現(xiàn)陽性單一條帶（見圖2B）。

2.3 PE38KDEL蛋白免疫后兔血清抗體IgG反應(yīng)及效價通過ELISA法檢測抗體反應(yīng)和效價，結(jié)果顯示，在蛋白免疫家兔2周后，注射PE38KDEL重組蛋白的家兔開始出現(xiàn)特異性IgG抗體反應(yīng)，至第6周時血清免疫效果達最高峰（見圖3A）。PE38KDEL蛋白3個免疫劑量組之間的IgG抗體反應(yīng)隨蛋白注射劑量增大而加強（見圖3B）。取6周時免疫血清做抗體稀釋滴度檢測，間接ELISA法檢測結(jié)果顯示，100μg免疫組PE38KDEL多克隆抗體血清的效價可達1:60000（見圖3C）。

2.4 PE38KDEL蛋白兔多克隆抗體特異性分析鑒定

誘導(dǎo)表達后的PE38KDEL菌株和純化后的PE38KDEL蛋白經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜，以免疫后第6周家兔血清抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔抗體IgG（H+L）為二抗，用Westernblot法檢測其與PE38KDEL蛋白結(jié)合的特異性。結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約57kDa處可見特異性單一陽性信號條帶（見圖4）。

3 討論

PE為單鏈蛋白，全長由613個氨基酸組成，包括3個不同結(jié)構(gòu)域，即受體結(jié)合區(qū)（DomainI）、跨膜區(qū)（DomainI I）和催化區(qū)（DomainI I I）[5]。DomainIa具有細胞結(jié)合識別能力，DomainIb功能目前尚不清楚，大部分氨基酸的缺失不影響其毒素分子活性，DomainI I具有跨膜轉(zhuǎn)運功能，DomainI I I具有ADP核糖基化活性，能抑制蛋白質(zhì)合成，是PE細胞毒性作用的主要依賴區(qū)[6]。將PE的Ia區(qū)缺失即得到PE40，將它直接與靶向分子融合即可構(gòu)成選擇性殺傷特定靶細胞的免疫毒素，但由于其相對分子質(zhì)量較大，腫瘤組織穿透力較低[7]，影響腫瘤靶向治療的效果。進一步將PE的Ib區(qū)去掉，得到的PE38相對分子量較小[8-9]，將PE催化區(qū)最后5個氨基酸REDLK突變?yōu)镵DEL，可提高其進入細胞的跨膜能力，增強毒素作用的活性，使免疫毒素更具殺傷力[10]。BRINKMANN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，由多種人類腫瘤相關(guān)抗原的鼠源單抗B3制成的免疫毒素B3（Fv）-PE40和B3（Fv）-PE38KDEL對多種腫瘤細胞均有殺傷作用，均可使腫瘤組織塊縮小甚至消退，而修飾改造后的PE38KDEL分子殺傷腫瘤細胞的作用更強。故本研究將PE38KDEL作為研究對象。

圖1 重組質(zhì)粒pET32a（+）/PE38KDEL構(gòu)建及酶切鑒定

圖2 pET32a（+）/PE38KDEL重組質(zhì)粒原核表達

本研究對PE38KDEL基因進行原核密碼子優(yōu)化，使目的基因更適合于原核表達，以利于增加蛋白表達量。密碼子優(yōu)化協(xié)調(diào)是進行蛋白質(zhì)異源系統(tǒng)表達常用的手段。經(jīng)過密碼子優(yōu)化的異源系統(tǒng)表達可實現(xiàn)目的蛋白的高產(chǎn)量，同時保證表達系統(tǒng)穩(wěn)定性[12-13]。密碼子優(yōu)化協(xié)調(diào)有多種方法，不同優(yōu)化方法作用下蛋白表達效果差異較大。目前常用的密碼子優(yōu)化方法有：改造宿主、稀有密碼子替換、異源表達宿主的選擇或同源表達、密碼子對優(yōu)化、密碼子對協(xié)調(diào)等[14]。根據(jù)以上理論和設(shè)想，并通過在線（http://www.jcat.de）預(yù)測，本研究對PE38KDEL重組蛋白原核密碼子進行了密碼子對優(yōu)化，并進行了原核表達，獲得了較高的目的蛋白表達。

免疫毒素由毒性蛋白和相應(yīng)配體（生長因子、抗體等）連接在一起組成，其配體可以與一種靶細胞抗原結(jié)合，在配體的靶向介導(dǎo)下，免疫毒素被細胞逐漸內(nèi)吞并通過其連接的毒素部分達到殺傷靶細胞的目的[15]。自1999年美國FDA批準免疫毒素ONTAK（DAB389-IL2）上市用于治療成人皮膚T細胞淋巴瘤[16]以來，腫瘤免疫毒素靶向治療研究成果顯著。目前，國外基于PE38KDEL構(gòu)建的免疫毒素已有15種進入了I期臨床試驗[17]。本研究制備的PE38KDEL蛋白為進一步研究免疫毒素提供了基礎(chǔ)。

圖3 PE38KDEL重組蛋白免疫后兔血清抗體的反應(yīng)和效價檢測

圖4 Westernblot法檢測PE38KDEL兔血清抗體的特異性

單克隆抗體因具有高度特異性而在臨床和基礎(chǔ)研究方面廣泛應(yīng)用。由于單克隆抗體僅能夠識別一個B細胞表位而具有其應(yīng)用的局限性，因此多克隆抗體的制備和研究仍然有較廣的應(yīng)用前景。徐悅玥等[18]通過原核優(yōu)化表達肺炎鏈球菌表面蛋白A并通過純化的蛋白免疫新西蘭大耳白兔，制備了高純度和高效價的多克隆抗體，具有快速檢測肺炎鏈球菌的應(yīng)用價值。本實驗室通過同樣方法制備的人乳頭瘤病毒E7蛋白的多克隆抗體，具有特異性強和效價高的特點，不僅可識別宮頸癌Siha細胞和Caski細胞株中的天然HPV16E7蛋白，也可識別HPV16E7重組蛋白，可應(yīng)用于HPV16E7的檢測[19]。因此，針對多個B細胞抗原表位的多克隆抗體仍具有研究的意義和必要性[20]。

綜上所述，本研究利用密碼子對優(yōu)化的方法設(shè)計了PE38KDEL基因，通過原核表達系統(tǒng)獲得了PE38KDEL重組蛋白，進一步將該重組蛋白作為特異性抗原免疫日本大耳白兔，獲得了高效價血清多克隆抗體，經(jīng)ELISA法檢測其效價達到1:60000，經(jīng)Westernblot法檢測其能特異性識別PE38KDEL蛋白。本研究制備的多克隆抗體，具有制備過程短、特異性強、成本低和抗體效價高等優(yōu)點。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Prokaryotic expression of recombinant PE38KDEL protein and preparation of its polyclonal antibody

CEN Danwei, SONG Yiling, ZHANG Chanqiong, MAO Shanshan, YE Xiaoxian, CHEN Jun, CHEN Shao, ZHU Shanli, ZHANG Lifang. Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To prepare PE38KDEL recombinant protein from Pseudomonas exotoxin A in prokaryotic expression system and prepare the PE38KDEL specifc polyclonal antibody.Methods:The C-terminal 609-613 amine acid REDLK from Pseudomonas aeruginosa exotoxin (PE) genes (PE38) was mutanted to KDEL. After prokaryotic codon optimization (http∶//www.jcat.de), the full gene sequences were synthesized and then cloned into expression vector pET32a (+) prokaryotic expression vector inserted into Hind III and Xho I and constructed the recombinant plasmid pET32a (+)/PE38KDEL. After sequenced, the plasmid was transformed into E.coli BL21 (DE3) and induced by isopropyl beta-D-1-thiogalactoside (IPTG) to get the PE38KDEL protein. The recombinant protein was purifed by Ni-NTA affnity chromatography, SDS-PAGE and Western blot were used to identify it. Then, the rabbits were immunized by the PE38KDEL purifed protein. The sera were collected before and after immunized. The antibody reaction and titer were detected by ELISA.Results:The pET32a (+)/ PE38KDEL recombinant plasmid was successfully constructed and the protein was expressed and purifed in the prokaryotic expression system. The protein molecular weight was about 57 kDa which was in accordance with the expected theoretical value. The PE38KDEL polyclonal antibody was obtained by immunization of rabbits and the titer of it was as high as 1∶60 000.Conclusion:The PE38KDEL recombinant protein can induce the rabbit to produce serum polyclonal antibody which has high titer and strong specifcity and can be used for further study which laid a solid foundation on the biology and immunology function.

Pseudomonas aeruginosa; exotoxins; PE38KDEL; polyclonal antibody; rabbits

R3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.01.001

2016-05-13

國家自然科學(xué)基金資助項目（81372447）。

岑丹維（1991-），女，浙江舟山人，碩士生。

張麗芳，教授，博士生導(dǎo)師，Email：wenzhouzlf@126.com。