王停停，鄭宏臣，徐健勇，彭夢，劉逸寒，路福平，宋詼*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津，300308) 3(中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，天津工業(yè)生物系統(tǒng)與過程重點實驗室，天津，300308)

木聚糖酶XynG1-1在畢赤酵母中的表達及發(fā)酵條件優(yōu)化

王停停1,2，鄭宏臣2,3，徐健勇2,3，彭夢1,2，劉逸寒1，路福平1，宋詼2,3*

1(天津科技大學 生物工程學院，天津，300457) 2(中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，工業(yè)酶國家工程實驗室，天津，300308) 3(中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所，天津工業(yè)生物系統(tǒng)與過程重點實驗室，天津，300308)

將來源于PaenibacilluscampinasensisG1-1的木聚糖酶編碼基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組上，構建了高產(chǎn)木聚糖酶XynG1-1的畢赤酵母工程菌。采用響應面法對該工程菌的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。首先使用Design-Expert軟件進行Plackett Burman實驗設計篩選出影響產(chǎn)酶量的3個主要因素，即甲醇含量、生物素含量和培養(yǎng)時間。在此基礎上使用Design-Expert軟件進行Box-Behnken實驗設計，通過響應面分析得出優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：甲醇含量2.28%，培養(yǎng)時間37.29 h，生物素4 mg/L，酵母粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，YNB 30 g/L，裝液量100 mL/L，轉速250 r/min、溫度28 ℃、磷酸緩沖液pH 6.0。經(jīng)實驗驗證，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下胞外重組酶活達到707.2 IU/mL，與響應面預測結果一致，較優(yōu)化前木聚糖酶酶活提高了7.9倍，較原始菌株產(chǎn)酶量提高了19.8倍。經(jīng)10 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)之后，重組木聚糖酶的酶活達到2 703 IU/mL。因此，該研究有效提高了木聚糖酶XynG1-1的發(fā)酵產(chǎn)量，并且，該重組酶保持了良好的酶學性質，可為工業(yè)化生產(chǎn)及應用奠定基礎。

畢赤酵母；木聚糖酶；響應面；發(fā)酵優(yōu)化；酶學性質

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase；EC3.2.1.8)是目前研究最為廣泛的半纖維素酶，也是一種重要的工業(yè)用酶，在造紙、食品、紡織、飼料等傳統(tǒng)工業(yè)領域具有廣闊的應用，隨著生物技術的不斷發(fā)展，木聚糖酶的應用領域不斷擴大，其在醫(yī)藥、環(huán)境和能源等方面的應用也正逐步被開發(fā)[1-3]。木聚糖酶的來源非常廣泛，主要存在于微生物、原生動物、甲殼類動物以及陸地植物組織中[4-5]。其中，微生物是木聚糖酶的最主要來源，約占所有來源的80%，其中，重要的木聚糖酶產(chǎn)生菌主要有：曲霉(Aspergilli)、木霉(Trichodermi)、青霉(Penicillium)、鏈霉菌(Streptomycetes)、芽胞桿菌(Bacillus)和瘤胃纖維菌(Rumihococci)等[6-9]。隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，越來越多的木聚糖酶基因成功得到外源表達，進而達到提高木聚糖酶產(chǎn)量的目的[10-11]。

畢赤酵母作為成熟的真核表達宿主具有諸多優(yōu)點：首先，作為真核表達系統(tǒng)，具有糖基化、脂肪?；⒌鞍琢姿峄确g后修飾加工功能；并且，一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復制而復制，不易丟失，具有很好的遺傳穩(wěn)定性；最重要的是該系統(tǒng)表達水平高并具有成熟的發(fā)酵工藝，易放大，大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的細胞干重可高達100 g/L以上[12-13]。目前，已有一些真核來源的木聚糖酶在畢赤酵母中成功表達。王丹丹等人將黑曲霉XZ-3X菌株來源的木聚糖酶基因轉入畢赤酵母GS115中，在畢赤酵母中成功實現(xiàn)異源表達，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后比酶活達到43 526.3 U/mg[14]；袁冬華等人將橄欖綠鏈霉菌A1來源的木聚糖酶基因在畢赤酵母中表達，經(jīng)響應面優(yōu)化后的酶活達到了262.8 U/mL，將優(yōu)化好的搖瓶發(fā)酵條件應用于7 L發(fā)酵罐，實現(xiàn)了木聚糖酶的高密度表達，酶活達到2 054.9 U/mL[15]。目前，關于細菌來源的木聚糖酶基因在畢赤酵母中表達的報道相對較少。

本研究前期篩選到1株產(chǎn)木聚糖酶的菌株PaenibacilluscampinasensisG1-1，該木聚糖酶具有很寬泛的pH穩(wěn)定性，在釀酒及造紙等行業(yè)均有很好的應用潛力，將該木聚糖酶基因xynG1-1分別在原核宿主大腸桿菌和巨大芽孢桿菌中表達，發(fā)酵酶活分別為10.58 IU/mL和304.26 IU/mL，產(chǎn)量還有待提高[16-17]。因此，本文將木聚糖酶基因xynG1-1連接到真核表達載體pPIC-9k上，進而重組到畢赤酵母GS115的染色體上。通過響應面法對畢赤酵母工程菌表達木聚糖酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，并將最優(yōu)發(fā)酵條件放大到10 L發(fā)酵罐，實現(xiàn)重組木聚糖酶的高密度發(fā)酵，為進一步提高木聚糖酶產(chǎn)量和大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

木聚糖酶原始菌株PaenibacilluscampinasensisG1-1由天津科技大學實驗室保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

酵母粉、蛋白胨：OXOID公司；D-葡萄糖、YNB、TRIS、木糖：Solarbio公司；NaOH：國藥集團化學試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4：天津市風船化學試劑科技有限公司；生物素：BIO BASIC INC公司；樺木木聚糖：天津市光復精細化工研究所。

BMGY培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 10×YNB，100 mL 10×甘油，2 mL 500×生物素。BMMY培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于700 ml水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 10×YNB，100 mL 10×甲醇，2 mL 500×生物素。YPD培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于900 mL水中(配置固體培養(yǎng)基時加入20 g/L瓊脂粉)，高壓滅菌20 min，加入100 mL 10×D。

1.1.3 儀器與設備

SKY-2111B全溫培養(yǎng)搖床，天津億諾科學儀器有限公司；MJX-100B-Z型培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；Epoth 2TC微孔板分光光度計，美國伯騰儀器有限公司；BIOTECH-10BGZ-2全自動兩聯(lián)10 L發(fā)酵系統(tǒng)，上海保興生物設備工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母工程菌的構建

以P.campinasensisG1-1基因組為模板，設計引物PCR擴增木聚糖酶基因xynG1-1，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，連接到pPIC-9k表達載體，得到重組質粒pPIC9k-xynG1-1，重組質粒經(jīng)SacI線性化后，電轉化到畢赤酵母GS115細胞中，應用AOX引物和木聚糖酶基因引物PCR驗證轉化子。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

通過平板劃線法將重組畢赤酵母接種至YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至單克隆出現(xiàn)，挑取單克隆菌落至BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至一定濃度。離心棄上清液，將菌體轉移至等體積BMMY培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)。每隔24 h取樣1 mL，并添加相應含量甲醇。樣品離心，將上清稀釋適當倍數(shù)測定酶活，上清和沉淀分別存于-20 ℃。

1.2.3 Plackett-Burman實驗

選取9個因素(甲醇含量、培養(yǎng)時間、生物素含量、酵母粉含量、蛋白胨含量、YNB含量、裝液量、pH和溫度)進行Plackett-Burman實驗(因素水平設計見表1)，以確定影響發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素

1.2.4 顯著因素的單因素水平實驗

對Plackett-Burman確定的3個主要因素A(甲醇含量)、B(培養(yǎng)時間)、C(生物素含量)進行單因素實驗，確定3個因素的3個合適水平A、B、C(-1、0、1)。

1.2.5 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)A、B、C三個因素的最終選取結果，使用Design-Expert軟件進行Box-Behnken設計3因素3水平實驗，其他發(fā)酵條件保持一致，共選取17個試驗點，包含12個析因點，5個零點重復，實驗因素水平設計見表2。

1.2.6 10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

挑取重組畢赤酵母單克隆菌落于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600nm=10左右，并將種子液加到含3 L初始培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵過程分為甘油單批培養(yǎng)，甘油分批補料培養(yǎng)和甲醇分批補料培養(yǎng)3個不同階段。每隔一段時間取樣并測OD600nm、細胞濕重和酶活，繪制菌體生長曲線，并進行蛋白檢測。

1.2.7 木聚糖酶酶活測定

木聚糖酶活力測定使用DNS法[17]。取100 μL稀釋適當倍數(shù)的酶液，加入100 μL 1%的樺木木聚糖底物溶液，60 ℃反應10 min，加入600 μL DNS終止反應，沸水浴10 min，測定540 nm處的吸光值。木聚糖酶活力單位的定義：以1%的可溶性樺木木聚糖為底物，在酶的最適反應條件下，每分鐘分解木聚糖生成1 μmol 木糖所需酶量為1個酶活力單位(IU)。

1.2.8 重組木聚糖酶酶學性質測定

將發(fā)酵上清液稀釋適當倍數(shù)，分別在40、45、50、55、60、65、70、75 ℃測定酶活，以最高酶活為100%，確定最適反應溫度。將稀釋適當倍數(shù)的酶液分別放置在50、55、60 ℃水浴鍋中，每隔一段時間分別測定酶活，以初始酶活為100%，測定重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。

將發(fā)酵上清液用不同的pH(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)緩沖液稀釋適當倍數(shù)，分別用相應pH的底物測定酶活，以最高酶活為100%，確定最適反應pH。將酶液分別用pH 6、6.5、7、7.5緩沖液稀釋適當倍數(shù)，放置4 ℃冰箱，每隔一段時間測定酶活，以初始酶活為100%，測定重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 產(chǎn)木聚糖酶畢赤酵母工程菌的構建

按圖1所示成功構建了畢赤酵母重組質粒pPIC9k-xynG1-1，質粒全長1 081 bp，將重組質粒經(jīng)SacI 線性化后轉化畢赤酵母GS115細胞中，得到128個轉化子，經(jīng)AOX引物和目的片段引物進行PCR驗證，得到陽性轉化子(圖2)，測序正確的為構建成功的產(chǎn)木聚糖酶XynG1-1的畢赤酵母工程菌。

圖1 畢赤酵母重組質粒構建示意圖Fig.1 Schematic diagram for construction of recombinant plasmid for P. pastoris

泳道1～5為AOX引物PCR結果，泳道6～10為木聚糖酶基因引物PCR結果圖2 畢赤酵母轉化子的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of P. pastoris transformants

2.2 重組畢赤酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的Plackett-Burman實驗

依據(jù)Plackett-Burman實驗設計，對發(fā)酵過程中的9個培養(yǎng)基成分進行考察，每個因素取高和低兩個水平，實驗結果如表1。各因素所代表的參數(shù)水平和方差分析結果如表2。研究的9個因素中，甲醇含量(A)、培養(yǎng)時間(B)、生物素含量(C)3個因素對重組木聚糖酶酶活產(chǎn)生顯著影響。繼而對3個顯著性因素進行不同水平的單因素實驗，而其他6個非顯著性因素在后續(xù)實驗過程中的取值由Plackett-Burman實驗結果確定。各因素對產(chǎn)酶影響可用以下方程表示(其中A代表甲醇含量、B為培養(yǎng)時間、C為生物素含量、D為酵母粉含量、E為蛋白胨含量、F為YNB含量、G為裝液量、H為pH值、I為溫度)：

酶活=362.38+38.08A+69.93B-34.01C+18.91D-14.89E+14.89F+35.52G+14.12H-28.33I

表1 Plackett-Burman實驗設計及結果

方程的決定系數(shù)R2=0.988 9，說明方程的擬合程度較好。在后續(xù)試驗過程中酵母粉、YNB和裝液量3個因素在高點取值，而蛋白胨、溫度和pH值3個因素在低點取值。進而繼續(xù)3個顯著因素最適條件的確定。

表2 偏回歸系數(shù)及因素的顯著性分析

2.3 單因素實驗確定Box-Behnken實驗的水平范圍

在后續(xù)Box-Behnken實驗設計過程中，需要確定3個顯著性因素的3個水平(-1、0、1)。應用單因素實驗測定不同甲醇含量、不同培養(yǎng)時間、不同生物素含量對重組木聚糖酶表達的影響。由圖3a結果可見，在甲醇含量為2%時重組木聚糖酶酶活最大，甲醇含量為1%和4%時酶活明顯降低，因此選取A(甲醇含量)因素的3個水平分別為1、2.5、4%；培養(yǎng)時間在36、60、84 h時酶活差距明顯(圖3b)，從而確定B(培養(yǎng)時間)因素的3個實驗水平；另外，對于因素C(生物素含量)的水平選擇0 、2 、4 mg/L較為合適(圖3c)。

2.4 響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)2.2和2.3實驗結果，用Box-Behnken軟件設計3因素3水平試驗，根據(jù)表3的實驗結果，使用Design-Expert軟件進行方差分析和二次回歸擬合實驗數(shù)據(jù)，回歸方程變量分析見表4。

a-甲醇含量對重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響；b-培養(yǎng)時間對重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響；c-生物素含量對重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響圖3 顯著影響因素的單因素水平實驗Fig.3 The influences on xylanase yields by different levels of the three notable factors

以重組木聚糖酶酶活(R1)為響應面值，以A、B、C為自變量，擬合得到多元二次回歸方程：

R1=506.16-46.27A-57.06B+13.09C+17.87AB+15.38AC-7.80BC-165.61A2-35.58B2+9.92C2

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗及方差分析可知，模型實驗擬合良好，模型的p=0.004 8<0.05，說明該試驗模型顯著。決定系數(shù)R2=0.917 3，說明回歸方程的擬合程度較好。由響應面回歸分析和回歸方程擬合繪制響應面圖形(如圖4)。

a-甲醇含量和培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶量的影響；b-甲醇含量和生物素含量對產(chǎn)酶量的影響；c-培養(yǎng)時間和生物素含量對產(chǎn)酶量的影響圖4 三個顯著性因素之間的響應面實驗Fig.4 The response surface experiments for the three significant factors

由圖4可見，A、B、C三個影響因素之間存在極值點。進而對方程求導，得到模型的極值點，3個因子的最優(yōu)試驗點分別為甲醇含量2.28%、培養(yǎng)時間37.29 h、生物素含量4 mg/L，此時模型預測的極大值為562.1 IU/mL。

2.5 驗證實驗

在其余培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不變的情況下，對模型預測的最優(yōu)條件(即甲醇含量2.28%、培養(yǎng)時間37.29 h、生物素含量4 mg/L)進行3組平行搖瓶發(fā)酵試驗，測得最終重組木聚糖酶平均酶活為707.2 IU/mL，比預測酶活值偏大1.26%，取得了預期的優(yōu)化效果。另外，與前期實驗結果相比較，本實驗獲得的畢赤酵母工程菌表達木聚糖酶XynG1-1的水平較其原始菌株(35.72 IU/ml)提高了19.8倍[16]，比該基因在大腸桿菌和巨大芽孢桿菌中表達水平分別高66.8倍和2.3倍[17]，可見，對于該木聚糖酶基因xynG1-1來說，畢赤酵母可能是其目前最合適的表達宿主。

a-重組畢赤酵母工程菌生長曲線圖；b-工程菌胞外蛋白電泳圖。M-Marker，GS115: 畢赤酵母GS115原始菌對照；1～8：誘導1～8 d的工程菌胞外蛋白圖5 10 L發(fā)酵罐實驗結果Fig.5 Fermentation results in a 10 L fermentor

試驗號A/%B/hC/(mg·L-1)酶活/(IU·mL-1)11604388.522.5602530.432.5360565.442.5840400.151600362.462.5602506.372.5602487.781842331.092.5602506.2102.5844380.0112.5364576.5121362414.1132.5602500.2144362243.2154842231.6164600281.7174604369.3

2.6 10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

在搖瓶發(fā)酵基礎上，進行10 L發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)，結果如圖5所示。重組畢赤酵母發(fā)酵189 h時，菌體生長趨于穩(wěn)定，細胞濕重達到346 g/L，重組木聚糖酶的酶活達到2 703 IU/mL，較搖瓶發(fā)酵酶活提高了3.8倍(如圖5a)。重組木聚糖酶的蛋白大小為40 kDa左右，與預測的蛋白大小一致，而陽性對照GS115在此處沒有蛋白表達，隨著發(fā)酵時間的延長，表達的重組蛋白量增加。并且由圖5b可見，重組木聚糖酶蛋白量占該畢赤酵母表達胞外蛋白90%以上，雜蛋白極少，具有良好的工業(yè)生產(chǎn)潛力。

表4 回歸方程變量分析

2.7 酶學性質

本研究還對重組木聚糖酶XynG1-1的酶學性質做了初步測定，重組木聚糖酶XynG1-1的最適作用溫度是55 ℃(圖6a)。在50、55 、60 ℃保溫30 min剩余酶活分別為68%、61%和57%(圖6b)。重組木聚糖酶XynG1-1的最適作用pH為6.5(圖6c)，該木聚糖酶在pH 6.0～7.5范圍內具有極好的穩(wěn)定性(圖6d)。

a-不同溫度對重組木聚糖酶活性的影響；b-重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性；c-不同pH對重組木聚糖酶活性的影響；d-重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性圖6 重組木聚糖酶XynG1-1的酶學性質Fig.6 The enzymatic properties of the recombinant xylanase XynG1-1

3 結論

本研究將來源于P.campinasensisG1-1的木聚糖酶基因成功重組到畢赤酵母GS115基因組上，實現(xiàn)了組成型表達，響應面法發(fā)酵條件優(yōu)化使得表達水平提高了7.9倍，優(yōu)化后搖瓶表達水平達到707.2 IU/mL，分別是原始菌的19.8倍、大腸桿菌工程菌的66.8倍、巨大桿菌工程菌的2.3倍?？梢娔揪厶敲竂ynG1-1在畢赤酵母中的表達水平最高。經(jīng)10 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最終胞外酶活可達到2 703 IU/mL，結合其優(yōu)良的酶學性質，本研究可顯著推進木聚糖酶XynG1-1的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及應用進程。

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Expression of xylanase XynG1-1 inPichiapastorisand optimization of its fermentation conditions

WANG Ting-ting1,2,ZHENG Hong-chen2,3,XU Jian-yong2,3,PENG Meng1,2,LIU Yi-han1,LU Fu-ping1,SONG Hui2,3*

1(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(Industrial Enzymes National Engineering Laboratory, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China) 3(Key Laboratory of Tianjin IndustrialBiosystem and Process Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

The gene encoding xylanase fromPaenibacilluscampinasensisG1-1 was successfully integrated into the genome ofPichiapastorisGS115, and engineeredP.pastorisfor high-yielding xylanase XynG1-1 was constructed. The fermentation conditions of the engineered bacteria were optimized by using the response surface method. Firstly, Plackett Burman design was carried out using Design-Expert software and three main factors influencing the yield of xylanase were screened out, which were content of methanol, content of biotin and incubation time. Then the Box-Behnken of Design-Expert software was used to design the experiment, the optimize culture conditions for fermentation were confirmed by the analysis of the response surface to be follows: yeast powder of 20 g/L, peptone of 20 g/L, YNB of 30 g/L, biotin of 4 mg/L, methanol content of 2.28%, liquid volume of 100 mL/L, incubation time of 37.29 h, rotational speed of 250 r/min, temperature 28 ℃, phosphate buffer pH 6.0. Verified by experiments, the extracellular recombined enzyme activity under the optimized cultivation condition was 707.2 IU/mL, which was consistent with the prediction of the response surface method and was 7.9-fold of the former xylanase enzyme activity and 19.8-fold of the enzyme activity produced by original strains. After enlarged culture in 10 L fermentation tank, the recombined xylanase enzyme activity reached 2 703 IU/mL. Therefore, this study effectively improved the fermentation yield of xylanase XynG1-1, and the recombinant enzyme retained better enzymology properties. It established foundation for the further industrial production and application of xylanase XynG1-1.

Pichiapastoris; xylanase; response surface; optimization of fermentation; enzymology properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701007

碩士研究生(宋詼研究員為通訊作者,E-mail：song_h@tib.cas.cn)。

國家“863”計劃(2014AA021302、2014AA021303)；中國科學院重點部署項目(KFZD-SW-201-2A)；天津市科技計劃項目(13ZCDZSY05000)

2016-07-05，改回日期：2016-08-29