朱益波，蔣卓越,2，郭倩，鄭青云，林容天，錢志浩，齊斌，王立梅*

1(常熟理工學院 生物與食品工程學院，蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟，215500)2 (蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州，215000)

重組融合蛋白大腸桿菌不對稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸

朱益波1，蔣卓越1,2，郭倩1，鄭青云1，林容天1，錢志浩1，齊斌1，王立梅1*

1(常熟理工學院 生物與食品工程學院，蘇州市食品生物技術重點實驗室，江蘇 常熟，215500)2 (蘇州大學 基礎醫(yī)學與生物科學學院，江蘇 蘇州，215000)

將來自于Lactobacillusplantarum的突變D-乳酸脫氫酶(D-LDHY52V)和Candidaboidinii的甲酸脫氫酶(FDH)進行融合，重組成雙功能融合蛋白，為生物法合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸(D-PLA)提供新的方法。利用重疊延伸PCR技術，將對底物苯丙酮酸(PPA)親合力更高的突變蛋白D-LDHY52V與FDH通過連接肽(Gly4Ser)3融合，將融合基因克隆至表達載體pET-28a(+)，并轉化EscherichiacoliBL21(DE3)，經IPTG誘導得到高效表達。SDS-PAGE電泳分析結果表明，融合蛋白分子質量為79.7 kDa，在重組菌中獲得了正確表達；酶活性測定結果表明，融合蛋白具有D-LDH和FDH的雙重生物學活性。在不對稱轉化PPA合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸(D-PLA)的應用中，融合蛋白體系比D-LDHY52V單獨表達體系的D-PLA產量提高了40.71%。通過5 h底物分批補加發(fā)酵，D-PLA產量為17.34 g/L，底物轉化率為77.64%，生產強度3.47 g/(L·h)。雙功能融合蛋白增強了輔酶再生的效率，有效促進了 (R)-2-羥基-3-苯基丙酸的不對稱合成。

D-LDHY52V；甲酸脫氫酶；融合蛋白；D-3-苯基乳酸；輔酶再生

在食品工業(yè)中，乳酸菌一般被認為是安全菌株[1]，它們代謝產生的抗菌物質可作為天然的食品防腐劑直接應用于食品工業(yè)[2]。2-羥基-3-苯基丙酸，即苯基乳酸(Phenyllactic acid, PLA)作為乳酸菌的代謝產物之一，廣泛存在于乳酸菌發(fā)酵產品中[3]。大量研究表明，苯基乳酸是一種廣譜的抗菌物質，對大多數革蘭氏陽性菌、陰性菌和真菌都有很好的抑制效果[4]，抑菌活性強于一些常用的食品防腐劑，如苯甲酸鈉、山梨酸鉀等[5]。因此苯基乳酸的開發(fā)和利用具有廣泛的應用前景。

在乳酸菌的代謝過程中，苯丙氨酸(Phe)經過轉氨反應轉化成為苯丙酮酸(PPA)，然后苯丙酮酸通過乳酸脫氫酶(LDH)還原生成苯基乳酸[6-7]。乳酸菌細胞內的乳酸脫氫酶被認為是將苯丙酮酸還原成苯基乳酸的關鍵酶[8-9]，在微生物體內的表達受到嚴格調控而導致胞內乳酸脫氫酶含量較低，限制了苯基乳酸產量的提高。因此，利用基因工程技術構建高效表達乳酸脫氫酶的工程菌來提高苯基乳酸產量是極具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N方法。ZHU等[10]將來自Lactobacilluspentosus的乳酸脫氫酶第52位氨基酸替換成小分子疏水氨基酸后轉化大腸桿菌高效表達，有效提升了乳酸脫氫酶對非天然底物苯丙酮酸的催化效率和D-PLA的產量。ZHENG等[11]和王穎等[12]分別將來自于BacilluscoagulansNL01和BacillusmegateriumZ2013513的L-乳酸脫氫酶在大腸桿菌中表達，均獲得了高光學純度的L-PLA。

乳酸脫氫酶是NADH依賴型氧還原酶。催化過程中需要不斷消耗體系中的還原型輔酶(NADH)[13]，轉化反應也會因為還原型輔酶的不足而終止，但是還原型輔酶的額外添加會顯著增加生產成本。因此開發(fā)系統(tǒng)中還原型輔酶再生的方法亦是研究的關鍵。酶偶聯(lián)法是常用的輔酶再生的方法，在反應體系中共表達底物催化酶和輔酶再生酶，但輔酶在兩個酶分子間傳遞，游離酶之間的空間距離有可能造成輔酶再生效率不高[14]。利用基因融合技術構建雙功能酶有可能使兩個酶的活性位點接近，使輔酶在分子內高效傳遞從而提高催化效率[15-16]。SüHRER等[17]通過構建酮還原酶與甲酸脫氫酶的融合蛋白體系，在一個融合蛋白內實現NADH的再生。到目前為止，尚未有將乳酸脫氫酶與甲酸脫氫酶進行融合表達并實現輔酶再生用于生產苯基乳酸研究的報道。

研究將來自于Lactobacillusplantarum的D-乳酸脫氫酶(D-LDHY52V)與來自博伊丁假絲酵母(Candida

boidinii)的甲酸脫氫酶(FDH)進行融合表達，構建了D-LDHY52V-FDH雙功能融合蛋白，在以苯丙酮酸為底物不對稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸的反應中，實現輔酶因子的原位再生，維持反應的持續(xù)進行，獲得更高產量的(R)-2-羥基-3-苯基丙酸。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

(R)-2-羥基-3-苯基丙酸和苯丙酮酸標品購自國藥集團；酵母提取物，胰蛋白胨購自Oxoid公司(英國)；PrimeSTAR HS DNA 聚合酶，限制性內切酶，T4DNA連接酶購自大連寶生物公司(TaKaRa)；DNA分子量標準，蛋白質分子量標準，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，硫酸卡那和相關分子試劑盒購自上海生工。所有實驗試劑如果無特殊說明均為分析純。

1.1.2 菌種和質粒

pMD19-T Simple Vector購自寶生物公司(大連)；E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)，Candidaboidinii，E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-d-ldhY52V，pET-28a(+)均為實驗室保藏。菌株E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-d-ldhY52V的構建參考文獻[10]。

1.1.3 主要儀器

PCR擴增儀、水平電泳系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)美國Bio-RAD公司；高速臺式離心機德國Thermo公司；恒溫金屬浴德國Eppendorf公司；高效液相色譜儀日本島津公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱太倉市華美生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 表達質粒的構建

1.2.1.1 pET-28a-d-ldhY52V-fdh的構建

構建示意圖如圖1所示。主要過程如下：通過2輪PCR，利用特異引物序列(表1)將編碼乳酸脫氫酶的基因以及甲酸脫氫酶基因通過柔性Linker (GGGGS)3的核苷酸序列連接，并在引物P1F和P4R中分別加入BamH I和XhoI限制性酶切位點。第1次PCR，分別以質粒pET-28a(+)-d-ldhY52V和Candidaboidinii基因組為模板，擴增出D-LDH和FDH目的片段。PCR 程序為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30～35個循環(huán)后在72 ℃延伸7～10 min。第2次PCR以經凝膠回收的第1次PCR產物作為模板，應用Gene-SOEing技術構建d-ldhY52V-fdh融合基因，具體方法如下：由于d-ldhY52V的3’端和fdh的5’端形成了部分重疊鏈，在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸從而將兩段基因拼接起來，合成全長的融合蛋白基因。PCR反應條件：98 ℃預變性3 min，前5個循環(huán)為98 ℃變性10 s，45 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min；后30個循環(huán)為98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min；最后72 ℃延伸10 min，共35個循環(huán)。在前5個循環(huán)結束后加入P1F，P4R。目的片段經凝膠回收后通過雙酶切插入至pET-28a(+)載體的BamH I和XhoI位點之間。轉化E.coliBL21(DE3)后經菌落PCR、酶切等方法篩選出符合要求的陽性克隆，進行DNA測序驗證。

圖1 pET-28a-d- ldhY52V-fdh構建示意圖Fig.1 Scheme of the construction of pET-28a-d- ldhY52V-fdh

引物名稱引物序列(5’-3’)所含特殊序列P1FCGCGGATCCATGAAAATTATTG-CATATGCBamHI酶切位點P2RGTCAAACTTAACTTGTGTG無P3FCACACAAGTTAAGTTTGACGGCGGTG-GCGGCAGCGGCGGAGGCGGAAGCG-GAGGCG-GAGGAAGCATGAAGATCGTTTTAGTC連接肽序列P4RCCGCTCGAGTTTaTTTCTTATCGTGTT-TACCGXhoI酶切位點P5CGCGGATCCATGAAGATCGTTTTAGTCBamHI酶切位點

1.2.1.2 pET-28a-fdh構建

以Candidaboidinii基因組為模板，P5和P4R為引物PCR擴增fdh。擴增產物經凝膠回收純化，16 ℃過夜連接至pMD19-T，獲得重組質粒pMD19-fdh。該質粒轉化至E.coliDH5α，經測序驗證無誤后，克隆、提取質粒、BamH I和XhoI雙酶切。目的片段經凝膠回收后插入pET-28a(+)載體的BamH I和XhoI位點之間。轉化E.coliBL21(DE3)獲得E.coli BL21(DE3)/pET-28a-fdh。

1.2.2D-LDHY52V-FDH融合蛋白的誘導表達及活性鑒定

E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh單菌落接種于含有50 mg/L卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)(約9 h)，按照1%接種于含有相同濃度卡那霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)至OD600約0.6時，添加IPTG濃度至0.6 mmol/L，誘導溫度25 ℃，200 r/min條件下誘導10 h后離心收集菌體，用磷酸緩沖液(pH為7.0)重懸，將菌體沉淀冰浴超聲破碎(超聲3 s，停3 s，持續(xù)10 min)后12 000 r/min離心2 min，取適當量上清液進行乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶酶活測定。另取適量上清進行SDS-PAGE電泳分析。

乳酸脫氫酶和甲酸脫氫酶酶活測定基本原理是NADH在340 nm處有最大吸收峰，通過光吸峰值的改變定量測定酶的含量。乳酸脫氫酶檢測的標準液為：0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH為7.0)，10 mmol/L苯丙酮酸鈉，0.4 mmol/L的NADH。甲酸脫氫酶檢測標準液：100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)，167 mmol/L甲酸鈉，1.67 mmol/L NAD+。反應在30 ℃條件下，連續(xù)測定反應液3 min,在340 nm吸收值的變化。酶活定義為：在30 ℃、pH 7.0的條件下，每分鐘消耗或生成1 μmol NADH所需的酶量為1個酶活單位(1 μmol/min=1U)。比活力定義為：1 mg粗酶蛋白中酶活力(U/mg)。蛋白質質量分數的檢測參照Bradford的標準方法。

1.2.3 單批次全細胞轉化生成D-PLA

將經過誘導的菌體離心后，用pH 7.0磷酸緩沖液洗滌2次,重懸于10 mL轉化培養(yǎng)基中(pH 7.0的100 mmol/L的磷酸鉀溶液含有10 g/L PPA，0.2 g葡萄糖，0.07 g甲酸鈉 ),37 ℃，200 r/min轉化2 h，定時取一定量轉化液于4 ℃、12 000 r/min離心2 min，將上清液稀釋適當倍數，用0.22 μm濾膜過濾，然后用高效液相測定。色譜條件參考ZHU[10]的方法。同樣條件測定E.coliBL21(DE3)/p28a-d-ldhY52V菌株對苯丙酮酸的轉化。

1.2.4 底物分批補加合成D-PLA

將誘導后菌體懸浮于50 mL轉化液，菌體干重20 g/L，PPA、葡萄糖和甲酸鈉起始濃度分別為7 g/L，20 g/L和7 g/L。分別在0.5 h添加0.35 g苯丙酮酸，1 h、1.5 h添加0.2 g苯丙酮酸，在2 h、3 h添加0.1 g的苯丙酮酸，使溶液中底物濃度大致維持在8 g/L左右，定時取樣檢測，測定方法如1.2.3所述。

2 結果與討論

2.1D-ldhY52V-fdh融合基因及表達質粒的構建與鑒定

用Over-lap extension PCR法成功構建d-ldhY52V-fdh融合基因(圖2a)，測序結果表明，融合基因序列與設計一致，其中d-ldhY52V基因片段長996 bp,編碼332個氨基酸；連接肽(Linker)基因長45 bp,編碼15個氨基酸(GGGGS)3，fdh基因長1 122 bp,編碼374個氨基酸。融合基因片段定向插入pET-28a(+)表達載體后提取質粒進行BamH I/XhoI雙酶切驗證(圖2b)。雙酶切的目的DNA片段大小正確，驗證正確的質粒經DNA測序分析，無堿基錯配，最終確定重組表達質粒pET-28a-d-ldhY52V-fdh構建成功。

圖2 凝膠電泳驗證Fig.2 Validation by agarosegel electrophoresis(a)Analysis of PCR products by agarosegel electrophoresis. M-DNA marker; 1-PCR product of d-ldhY52V; 2-PCR product of fdh 3-PCR product of d-ldhY52V-fdh (b) Identification of recombinant expression vector pET-28a-d-ldhY52V-fdh. M-DNA Marker; 1-pET-28a-d-ldhY52V-fdh digested with BamH I and Xho I

2.2 融合蛋白的誘導表達及活性檢測

將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V，E.coliBL21(DE3)/pET-28a-fdh，E.coliBL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh分別進行培養(yǎng)，破碎菌體得到粗蛋白溶液樣品。對表達的重組蛋白d-ldhY52V，FDH，D-LDHY52V-FDH進行電泳分析，結果如圖3所示。D-LDHY52V的理論值為37 kDa，FDH的理論值為41 kDa，目標蛋白為79.7 kDa。由圖3可以看出，重組菌在近80 kDa處有明顯蛋白條帶(圖3，泳道3)，相對分子質量和預期的大小一致，表明融合蛋白在大腸桿菌中表達成功。表2列出了從重組菌內得到的融合蛋白D-LDH和FDH活性的檢測結果。融合蛋白的D-LDH活性只有單獨表達的D-LDH的42.97%，融合表達的FDH的活性和單獨表達的FDH活性相近。這些結果表明，融合蛋白具有D-LDH和FDH雙重生物學活性，在構建的重組菌中得到了成功表達，并對苯丙酮酸顯示出催化活力。

M-Maker; 1-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V with induction；2-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-fdh with induction；3-crude extract of E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh with induction圖3 重組工程菌誘導表達檢測Fig.3 The analysis of recombinant protein by SDS-PAGE

VariantD-LDHactivity(U/mg)FDHactivity(U/mg)D-LDHY52V104.84±4.19NDFDHND0.38±0.03D-LDHY52V-FDH49.77±5.950.41±0.07

2.3 重組菌批式全細胞合成D-PLA

對菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V和E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V-fdh進行單批次轉化實驗，在反應過程中定時取樣，考察苯基乳酸生產速率的情況。如圖4所示，表達融合蛋白的重組菌在轉化反應初期就具有較強的轉化活力，前10 min內累積的D-PLA產量是菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-d-ldhY52V的1.6倍。由此可以看出，具有輔酶NADH再生的轉化反應體系，因為反應過程中輔酶NADH的及時補充，使合成苯基乳酸的反應速率加快。KATHRIN等[18]將3-酮乙基酰基載體蛋白還原酶與突變型甲酸脫氫酶進行融合后全細胞生物轉化五氟苯乙酮生成五氟苯基乙醇的過程中，也觀察到類似現象。此外，可以看出單獨表達D-LDHY52V的體系在反應進行到40 min時，D-PLA的產量基本不再增高，而具有輔因子再生的融合表達體系因為輔酶NADH的持續(xù)供給，轉化反應能夠維持較長的時間，D-PLA單批次產量累積達到7.13 g/L，較D-LDHY52V的單獨表達體系提高40.71%。

圖4 E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V 和 E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh合成D-PLA時間曲線Fig.4 Time course of batch production of D-PLA by the recombinant E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52Vand E. coli BL21(DE3)/pET-28a-d-ldhY52V-fdh

2.4 分批補加底物合成D-PLA

對于生物催化反應而言，底物濃度的高低會顯著影響反應的速度，底物濃度太低時，酶的活性中心沒有被完全飽和，導致反應速度慢；而過高的底物濃度會對酶和菌體活性有較大的抑制[19]。為了避免轉化過程中的底物抑制作用，本研究利用分批添加底物方式來提高D-PLA的產量。轉化過程中各參數變化如圖5所示，在轉化反應的初期，PPA快速轉化合成D-PLA，反應前2 h內，菌體保持較高的轉化活力，轉化率維持在80%以上，D-PLA產量累計達到15.14 g/L。2 h以后菌體轉化活力下降，D-PLA產量上升緩慢，轉化至4 h，D-PLA產量為17.20 g/L。最終，經5 h全細胞轉化，D-PLA產量達到最大值17.34 g/L，轉化率為77.64%，生產強度3.47 g/(L·h)。相比ZHU等[10]報道的D-LDHY52V的重組菌轉化4 h，合成D-PLA產量結果(15.6 g/L)相比，本研究產量提高了10.12%。和MU等[6]報道利用菌株Lactobacillussp.SK007底物流加發(fā)酵72 h生產D-PLA(產量17.38 g/L，轉化率51.1%，生產強度0.241 g/(L·h)相比，本研究生產強度與轉化率都顯著提高。ZHENG等[20]利用1株嗜熱芽孢桿菌BacilluscoagulansSDM全細胞轉化生產苯基乳酸，獲得產量37.3 g/L，這是此前報道的生物法生產苯基乳酸的最高產量，但其發(fā)酵周期長達16 h，生產強度為2.3 g/(L·h)。與其相比，本研究在產量上仍有待進一步提高，但在生產強度方面具有非常明顯的優(yōu)勢。

圖5 分批補料添加苯丙酮酸鈉生產D-PLA時間曲線Fig.5 Time course of D-PLA production in fed-batch fermentation with intermittent PPA feeding

3 結論

本研究成功構建D-LDHY52V-FDH融合蛋白，經過體外生物學活性分析，該融合蛋白具有催化苯丙酮酸還原和再生輔因子的雙重生物學功能。在利用重組菌合成D-PLA時，融合蛋白體系較D-LDHY52V單獨表達體系具有明顯的優(yōu)勢，通過批次添加底物策略，獲得D-PLA最高產量17.34 g/L，轉化率77.64%，生產強度3.47 g/(L·h)。本研究構建的雙功能融合蛋白為解決酶偶聯(lián)法反應體系復雜、不穩(wěn)定的弊端提供了一個替代方案，為生物催化法不對稱合成(R)-2-羥基-3-苯基丙酸提供了基礎性數據。

[1] FAVARO L, PENNA A L B, TODOROV S D. Bacteriocinogenic LAB from cheeses-Application in biopreservation[J]. Trends in Food Science & Technology, 2014, 41(1):37-48.

[3] MU WM, YU SH, ZHU LJ, et al. Recent research on 3-phenyllactic acid, a broad-spectrum antimicrobial compound[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2012, 95(5):1 155-1 163.

[4] DIEULEVEUX V, LEMARINIER S, Gueguen M. Antimicrobial spectrum and target site ofD-3- phenyllactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology, 1998 ,40(3):177-183.

[5] 李德茂, 李從發(fā), 劉四新, 等.3-苯基乳酸的研究進展[J].藥物生物技術, 2004,11(5):344-347.

[6] MU WM, CHAN C, LI XF, et al. 3-Phenyllactic acid production by substrate feeding and pH-control in fed-batch fermentation ofLactobacillussp.SK007 [J]. Bioresource Technology, 2009, 100(21): 5 226-5 229.

[7] MCSWEENEY PLH, SOUSA MJ. Biochemical pathways for the production of flavour compounds in cheeses during ripening: A review[J]. Le Lait,2000,80:293-324.

[8] LI XF, JIANG B, PAN BL, et al. Purification and partial characterization ofLactobacillusspecies SK007 lactate dehydrogenase (LDH) catalyzing phenylpyruvic acid (PPA) conversion into phenyllactic acid (PLA)[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2008，56(7):2 392-2 399.

[9] JIA JH, MU WM, TAO Z, et al. Bioconversion of phenylpyruvate to phenyllactate: gene cloning, expression, and enzymatic characterization of d-and l -Lactate dehydrogenases fromLactobacillusplantarumSK002[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology, 2009，162(1):242-251.

[10] ZHU YB, HU FG, ZHU YY, et al. Enhancement of phenyllactic acid biosynthesis by recognition site replacement ofD-lactate dehydrogenase fromLactobacilluspentosus[J]. Biotechnology Letters, 2015, 37(6):1-9.

[11] ZHENG ZJ, ZHAO MY, YING Z, et al. Production of optically pure l-phenyllactic acid by using engineeredEscherichiacolicoexpressing l-lactate dehydrogenase and formate dehydrogenase[J]. Journal of Biotechnology, 2015(207):47-51.

[12] 王穎, 范銘, 薛素妹,等. 全細胞催化合成L-苯基乳酸重組大腸桿菌的構建[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2015，41(12):13-17.

[13] YOSHIROU I, SHINO T, TAKAHASHI O, et al. Recognition site for the side chain of 2-ketoacid substrate in d-lactate dehydrogenase [J]. Journal of Biochemistry, 2005, 138(6): 741-749.

[14] 黃志華, 劉銘, 王寶光,等. 甲酸脫氫酶用于輔酶NADH再生的研究進展[J]. 過程工程學報, 2006, 6(6):1 011-1 016.

[15] YU SH, ZHU LJ, ZHOU C, et al. Enzymatic production ofD-3-phenyllactic acid byPediococcuspentosaceusD-lactate dehydrogenase with NADH regeneration by Ogataea parapolymorpha formate dehydrogenase.[J]. Biotechnology Letters, 2014, 36(3):627-631.

[16] WANG R, XUE Y, WU X, et al. Enhancement of engineered trifunctional enzyme by optimizing linker peptides for degradation of agricultural by-products[J]. Enzyme & Microbial Technology, 2010, 47(5):194-199.

[17] SüHRER I, HASLBECK M, CASTIGLIONE K. Asymmetric synthesis of a fluoxetine precursor with an artificial fusion protein of a ketoreductase and a formate dehydrogenase[J]. Process Biochemistry, 2014, 49(9):1 527-1 532.

[18] H?LSCH K, WEUSTER-BOTZ D. Enantioselective reduction of prochiral ketones by engineered bifunctional fusion proteins[J]. Biotechnology & Applied Biochemistry, 2010, 56(4):131-140.

[19] 施巧琴. 酶工程[M]. 北京：科學出版社; 2005：27-31.

[20] ZHENG ZJ, MA CQ,GAO C,et al. Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells ofBacilluscoagulansSDM[J]. Plos One，2011，6(4):0019030.

Construction of fusion protein for asymmetric synthesis of (R)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid

ZHU Yi-bo1, JIANG Zhuo-yue1,2, GUO Qian1, ZHENG Qing-yun1,LIN Rong-tian1, QIAN Zhi-hao1, QI Bin1, WANG Li-mei1*

1(Key Laboratory of Food and Biotechnology of Suzhou, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China) 2(Institute of Basic Medical and Biological Sciences,Soochow University, Suzhou 215000,China)

The bifunctional fusion protein system consisting of a mutantD-lactic dehydrogenase (D-LDHY52V) and formate dehydrogenase (FDH) was constructed for asymmetric synthesis of (R)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid and cofactor regeneration. Thed-ldhY52V-fdhgene was constructed with the flexible 15 amino acids linker (Gly4Ser)3by overlap extension PCR, and the final full length product was cloned into the pET-28a(+) vector for protein expression inEscherichiacoliBL21(DE3), wherein protein expression was induced by IPTG. The expression of fusion protein was analyzed through SDS-PAGE. The result showed a specific band of about 79.7 kDa after expression ofE.coliBL21 (DE3) containing plasmid pET28a-d-ldhY52V-fdh, its size was identical with the expected molecular weight of the fusion protein. The specific activity of crude recombinant protein extracts was then found to exhibit bothD-LDH and FDH activity. In asymmetric reductions of phenylpyruvic acid (PPA), cells expressing fusion protein generated 40.71% more of theD-PLA in the batch fermentation compared with cells expressingD-LDHY52V. Fed-batch fermentation was conducted by intermittent feed PPA, after 5 h transformation, the finalD-PLA concentration reached 17.34 g/L with the conversion ratio of 77.64%. Results showed that the fusion proteinD-LDHY52V-FDH was successfully constructed, and it could provide foundation for further study of asymmetric synthesis of (R)-(+)-2-hydroxy-3-phenylpropionic acid with simultaneous cofactor regeneration.

D-LDHY52V; formate dehydrogenase; fusion protein;D-3-phenyllactic acid; cofactor regeneration

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701009

博士，副教授(王立梅教授為通訊作者,E-mail：wlmqb@126.com)。

國家自然科學青年基金(31501459)；國家自然科學基金面上項目(31470092)；江蘇省自然科學青年基金項目(BK20130380)；江蘇省“六大高峰人才”資助計劃項目(NY-021)；常熟市科技計劃項目(CN201412)

2016-06-24，改回日期：2016-08-08