張永杰，牛丹丹,*，吳海洋，黃磊，董自星，劉曉光，葉秀云，路福平*

1 (天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津,300457) 2(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州,350116) 3 (天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津,300457)

Pichiapastoris細(xì)胞的酶法水解

張永杰1，牛丹丹1,2*，吳海洋1，黃磊1，董自星3，劉曉光3，葉秀云2，路福平1*

1 (天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津,300457) 2(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州,350116) 3 (天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津,300457)

以工業(yè)酶制劑生產(chǎn)中的廢棄畢赤酵母細(xì)胞為對(duì)象，研究并建立了酶法制備酵母浸出物的新工藝。新工藝為：10%(w/v)廢棄畢赤酵母菌體中加入β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶，于50 ℃作用12 h；再加入中性蛋白酶，于50 ℃作用7 h；再加入DNA酶和RNA酶，于37 ℃作用4 h。離心收集上清液，真空冷凍(或噴霧)干燥獲得酵母浸出物。運(yùn)用這一技術(shù)，酵母細(xì)胞組分的溶出率達(dá)到66.2%，固形物收得率為65.7%。使用該研究制得的酵母浸出物培養(yǎng)重要工業(yè)微生物菌種，其支撐細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的效果顯著優(yōu)于市售酵母粉。

酵母浸出物；酶法制備；畢赤酵母

酵母細(xì)胞抽提物或浸出物(yeast extract)是以酵母細(xì)胞(主要是啤酒酵母或面包酵母)為原料，經(jīng)過(guò)自溶或酶解等制得。酵母浸出物含有18種以上的氨基酸，尤其含有谷物中含量不足的賴氨酸；還富含B族維生素和鈣、鎂、鋅、鐵、硒等微量元素[1]。酵母浸出物除了作為微生物培養(yǎng)基的主要組成外，近年來(lái)已發(fā)展成為食品工業(yè)中的原/輔料，在營(yíng)養(yǎng)、調(diào)味和保健方面發(fā)揮其獨(dú)特功效。

酵母細(xì)胞及其浸出物長(zhǎng)期以來(lái)一直是食品發(fā)酵工業(yè)研究的重要內(nèi)容，國(guó)內(nèi)外有關(guān)酵母浸出物的研究主要集中在制備過(guò)程的影響因素[2]、生產(chǎn)方法[3]、下游工藝[4]、富含5’-單磷酸鳥苷(5’-GMP)的酵母抽提物的生產(chǎn)[5-6]以及酵母浸出物在生產(chǎn)紅酒澄清劑[7]、芳香成分[8]、棕櫚油酸[9]和治療肉雞的壞死性腸炎[10]等方面。但就酵母浸出物的生產(chǎn)技術(shù)研究，長(zhǎng)期停留在以自溶為基礎(chǔ)的工藝優(yōu)化方面，深入研究不多。

酵母浸出物的生產(chǎn)技術(shù)主要有：自溶法、酶解法和酸解法，其中自溶法仍然是我國(guó)酵母浸出物制備的主要方法；酸解法因?yàn)槲廴緡?yán)重、產(chǎn)品質(zhì)量低等已經(jīng)不再被使用。酵母浸出物的生產(chǎn)原料主要為啤酒釀制后的酵母廢棄生物體，所采用的生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵步驟是物理誘導(dǎo)酵母細(xì)胞自溶，在細(xì)胞自溶時(shí)釋放相關(guān)水解酶系使得細(xì)胞生物體酶解，此法簡(jiǎn)便易行但收得率較低[2]。酶解法制備酵母浸出物是一種高效、綠色制造技術(shù)，目前，世界上僅日本采用酶法生產(chǎn)酵母浸出物；我國(guó)利用酶法技術(shù)生產(chǎn)酵母浸出物工藝尚未成熟[1]，其中各關(guān)鍵因素、酶制劑的種類與使用方式等有待深入研究。

新型酵母資源替代啤酒酵母制備酵母浸出物是一個(gè)值得關(guān)注的研究方向，其中備受關(guān)注的便是能夠進(jìn)行高密度培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)[11]。作為重要酶制劑工業(yè)生產(chǎn)宿主的巴斯德畢赤酵母，在其完成酶制劑的生產(chǎn)后，主要作為廢棄物通過(guò)烘干等物理處理，用作動(dòng)物飼料的添加劑或輔料，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有得到應(yīng)有的開(kāi)發(fā)與利用。為此，本研究探索全酶法處理巴斯德畢赤酵母廢棄細(xì)胞制備酵母浸出物的新方法，并評(píng)價(jià)所獲得酵母浸出物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 酶與菌種

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)GS115為本實(shí)驗(yàn)室保藏，用YPD培養(yǎng)基(酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%)進(jìn)行培養(yǎng)。地衣芽胞桿菌CBBD302為本課題組前期研究中選育的可用于多種工業(yè)酶高效表達(dá)的工業(yè)宿主細(xì)胞，大腸桿菌JM109為分子克隆常用實(shí)驗(yàn)菌株，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏，以M9’培養(yǎng)基(以M9培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加12.05%的酵母膏并去除其中含磷元素的成分)進(jìn)行培養(yǎng)。

β-甘露聚糖酶(60 000 U/g)、β-葡聚糖酶(20 000 U/g)和果膠酶(100 000 U/g)購(gòu)自江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；中性蛋白酶(20 000 U/g)、DNA酶(330 U/g)、RNA酶(35 000 U/g)為通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室前期研制的重組菌發(fā)酵制備獲得。其他藥品和試劑均為分析級(jí)，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 酶活測(cè)定方法

中性蛋白酶活性測(cè)定采用福林酚法[13]。核酸酶活性測(cè)定采用紫外分光光度法[14]。其基本方法是：將0.1 mL酶液與0.2 mL 2 mg/mL熱變性的小牛胸腺DNA在37 ℃孵育30 min后，用7%的高氯酸終止反應(yīng)，再加入3 mL預(yù)冷的蒸餾水，在10 000×g，4 ℃條件下離心15 min，再用紫外分光光度計(jì)在260 nm下測(cè)定上清液的吸光值。反應(yīng)液與對(duì)照的吸光值之差為1時(shí)定義為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3 單酶水解試驗(yàn)

離心收集廢棄的畢赤酵母細(xì)胞，然后將其用每種酶的最適緩沖液配制成10% (w/v)的酵母液，分別用β-甘露聚糖酶(50 ℃，pH 5.5)、β-葡聚糖酶(50 ℃，pH 4.8)、果膠酶(50 ℃，pH 5.0)、中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)、DNA酶(37 ℃，pH 7.0)和RNA酶(37 ℃，pH 7.0)在各自最適反應(yīng)條件下對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)作用。在不同時(shí)間點(diǎn)取樣分析酵母細(xì)胞溶出情況，以溶出率進(jìn)行描述。

(1)

式中：η，溶出率，%；m0,初始酵母細(xì)胞質(zhì)量，g;m1剩余酵母細(xì)胞質(zhì)量，g。

1.4 組合酶水解試驗(yàn)

在10% (w/v)的酵母液中，分別添加β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶以及果膠酶中的任意兩種酶或同時(shí)添加3種酶，于50 ℃對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行酶解，并在不同時(shí)間點(diǎn)取樣，通過(guò)測(cè)定上清中還原糖的含量來(lái)判斷組合酶的作用效果，以單個(gè)酶對(duì)酵母的酶解作用為對(duì)照。

在β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶以及果膠酶作用至酵母泥質(zhì)量不再變化后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再加入中性蛋白酶于50 ℃對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行作用，考察中性蛋白酶的協(xié)同作用效果。

1.5 酶法制備酵母浸出物的基本流程

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定酶法制備凍干酵母浸出粉的基本工藝流程，并與現(xiàn)有工藝進(jìn)行比較。采用該工藝流程制備酵母浸出物，并通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)取樣，確定該工藝流程中酵母泥質(zhì)量的變化情況。再取3個(gè)250 mL三角瓶，分別加入等量(約0.85 g)的酵母泥。然后采用上述工藝流程酶解酵母細(xì)胞，離心后(12 000 r/min，10 min)，將上清液在烘箱中烘至恒重，并稱重，計(jì)算細(xì)胞組成溶出率與固形物收得率。

(2)

式中：R，固形物收得率，%;m0′,酶解前酵母干重,g;m1′,酶解酵母細(xì)胞上清液總質(zhì)量,g;m2,反應(yīng)過(guò)程中外加入的酶制劑，調(diào)pH時(shí)所加的NaOH等干重總和，g;ρ，上清液固形物含量，%。

1.6 微生物生長(zhǎng)試驗(yàn)

采用1.1描述的培養(yǎng)基，并用含有25 mL M9培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，在37 ℃、220 r/min下分別培養(yǎng)地衣芽胞桿菌CBBD302和大腸桿菌JM109，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞生物量，考察并比較其生長(zhǎng)情況。同樣，將YPD培養(yǎng)基中的酵母浸出粉替換為本研究獲得的酵母浸出物，30 ℃、220 r/min下培養(yǎng)畢赤酵母GS115，研究其對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞生物量的測(cè)定采用分光光度計(jì)法進(jìn)行[12]。

1.7 酵母浸出物的組成分析

酵母浸出物的全組成成分采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進(jìn)行分析。色譜條件如下：色譜柱：Agilent HP-5毛細(xì)管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣，載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL。初始溫度70 ℃，維持4 min，以3 ℃/min升到133 ℃，再以2 ℃/min升到200 ℃，再以3℃/min升到220 ℃，最后以5 ℃/min升到260 ℃。進(jìn)樣口溫度：270 ℃；接口溫度：280 ℃；離子化方式：電子轟擊(EI)，溫度230 ℃，電子能量70 eV；四級(jí)桿溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描范圍為85～500m/z。

此外，還原糖含量的測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS法)[15]；酵母干物質(zhì)含量測(cè)定按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[1]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶制劑對(duì)巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的作用特征

酵母浸出物制備的相應(yīng)酶制劑的首選需要其能打開(kāi)酵母的細(xì)胞壁[16-17]。據(jù)估算60 min內(nèi)酶解1 g酵母細(xì)胞時(shí)酶的添加量為：β-甘露聚糖酶508.5 U、β-葡聚糖酶508.5 U、果膠酶56.5 U、中性蛋白酶56.5 U。以此為基礎(chǔ)，在酶的最適作用條件下酶解酵母細(xì)胞，結(jié)果如圖1a所示。

在加入β-甘露聚糖酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶或果膠酶作用1 h后，酵母細(xì)胞的溶出率達(dá)到21%～43%。可見(jiàn)，上述酶皆能明顯加速酵母細(xì)胞的裂解效率與程度、促進(jìn)內(nèi)含物的釋放。其中，果膠酶的作用效果最好，這可能是因?yàn)槌俗饔糜诠z外，它還可以降解幾丁質(zhì)、β-葡聚糖等[18]，從而有利于細(xì)胞組成的水解與內(nèi)含物的快速釋放。酶解5 h后酵母細(xì)胞的溶出率達(dá)到42%～48%，繼續(xù)延長(zhǎng)作用時(shí)間，酶解作用不明顯(圖1a)。此外，通過(guò)增加酶的添加量，溶出率增加不顯著(未發(fā)表數(shù)據(jù))?？梢?jiàn)，本實(shí)驗(yàn)中計(jì)算出的用酶劑量適合巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的溶出。

▲-DNA酶；▼-RNA酶；●-未加酶的對(duì)照?qǐng)D1 不同的酶制劑對(duì)畢赤酵母細(xì)胞的作用Fig.1 Effects of different enzymes on the hydrolysis of P. pastoris GS115 cells (注：50℃、pH 7.0條件下自溶6 h，冷卻至37℃后，再加入DNA酶或RNA酶。)

本研究進(jìn)一步考察了DNA酶或RNA酶對(duì)酵母細(xì)胞浸出物形成的影響，采用自溶后的酵母細(xì)胞為作用對(duì)象，結(jié)果如圖1b所示。在330 U/g DNA酶或3.5萬(wàn) U/g RNA酶的作用下，前期對(duì)細(xì)胞組成的溶出作用不明顯，后期DNA酶呈現(xiàn)明顯的作用而RNA酶作用效果一般。由此也可以看出，通過(guò)細(xì)胞自溶獲得酵母浸出物的工藝過(guò)程中DNA酶相對(duì)不足。

2.2 組合酶對(duì)酵母細(xì)胞的水解作用

細(xì)胞的不同組分意味著酶的組合可以對(duì)酵母細(xì)胞溶出具有協(xié)同作用。為此，以可溶性還原糖釋放量為指標(biāo)，研究了β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶之間的可能協(xié)同作用對(duì)畢赤酵母細(xì)胞的酶解作用。在酶的作用下，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解上清中還原糖含量不斷增加。其中，3種酶共同作用明顯優(yōu)于2種酶之間的組合作用，并顯著優(yōu)于單酶的作用(圖2)。

▲-β-甘露聚糖酶+果膠酶；▼-果膠酶；△-β-葡聚糖酶；◆-β-甘露聚糖酶圖2 組合酶對(duì)酵母細(xì)胞的作用Fig.2 Effects of different enzyme combinations on the hydrolysis of yeast cells

在β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶共同作用至酵母泥質(zhì)量不再變化時(shí)(約12 h)，補(bǔ)加中性蛋白酶，酵母細(xì)胞的溶出率和上清中還原糖的含量隨作用時(shí)間不斷增加(圖3)。可見(jiàn)，中性蛋白酶顯著提高酵母細(xì)胞蛋白組分的溶出；蛋白酶的添加進(jìn)一步激發(fā)了還原糖的釋放，可見(jiàn)蛋白酶與糖基水解酶之間也存在協(xié)同作用。

圖3 中性蛋白酶對(duì)畢赤酵母的作用Fig.3 Effects of neutral protease on the degradation of yeast cells

2.3 酶法制備酵母浸出物工藝流程

基于上述研究結(jié)果，擬定的酶法制備酵母浸出物新工藝為：(1)制備100 g/L酵母液，pH 5.5；(2)按干菌體質(zhì)量計(jì)算，每克干菌體質(zhì)量加入：508.5 U β-甘露聚糖酶、508.5 U β-葡聚糖酶和56.5 U果膠酶，于50 ℃酶解12 h；(3)調(diào)pH至7.0后，加入56.5 U中性蛋白酶，于50 ℃酶解7 h；(4)65 ℃滅酶30 min后，冷卻至37 ℃，加入18.8 U DNA酶和300 U RNA酶解，繼續(xù)酶解4 h；(5)離心(12 000 r/min，5 min)取上清液，經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥獲得粉狀酵母浸出物。

以廢棄的畢赤酵母細(xì)胞為原料，采用上述工藝流程制備酵母浸出物，在1.0 L反應(yīng)體系下，主要工段酵母細(xì)胞溶出率分別是：β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶協(xié)同作用后，酵母細(xì)胞的溶出率達(dá)到60.5%；進(jìn)一步加入蛋白酶后的溶出率為64.5%；再在DNA酶和RNA酶的作用下，酵母細(xì)胞組分溶出率達(dá)到66.2%，固形物收得率達(dá)到65.7%。明顯高于已有報(bào)道中采用酶促自溶法以啤酒廢酵母為原料制備酵母浸出物的59.16%[1]、50%的固形物收得率[4]或用鮮酵母制備酵母抽提物的56.32%的收得率[16]。

在酶促自溶法制備酵母浸出物的生產(chǎn)工藝中，除了利用細(xì)胞自身的水解酶系(蛋白酶、核酸酶、糖基水解酶等)外，通過(guò)外加木瓜蛋白酶和溶壁酶等進(jìn)行酶促自溶，并后續(xù)再使用中性蛋白酶、5’磷酸二酯酶以及磷酸腺苷脫氨酶等進(jìn)行酶解[16]。顯然，用酶成本過(guò)高且復(fù)雜，特別是溶壁酶、磷酸二酯酶和磷酸腺苷脫氨酶等屬于特別昂貴的酶種[1]?？梢?jiàn)，與酶促自溶法相比，本研究建立的酶法制備酵母浸出物路線，是從酵母的細(xì)胞壁開(kāi)始對(duì)其大分子物質(zhì)組成進(jìn)行逐步酶法拆解(水解)，具有水解效率高、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、便于操作與自動(dòng)化控制等優(yōu)點(diǎn)，有利于后續(xù)的工業(yè)化放大與應(yīng)用。

2.4 酵母浸出物組成分析與營(yíng)養(yǎng)

采用GC-MS對(duì)所本研究制得的酵母浸出物的單體組成成分進(jìn)行全分析。其中匹配度高于85%的部分物質(zhì)列于表1中。該酵母浸出物的主要成分有糖類、氨基酸、核苷、脂肪酸及有機(jī)酸等物質(zhì)，這些單體物質(zhì)對(duì)生物體營(yíng)養(yǎng)支持與細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖是十分重要的。

表1 GC-MS分析酵母浸出物的單體組成成分

分別用本研究中制備的酵母粉替換1.1中描述的M9’培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中的酵母抽提物(OXOID)，進(jìn)行培養(yǎng)基配制，以此培養(yǎng)基分別培養(yǎng)地衣芽胞桿菌CBBD302、大腸桿菌JM109以及畢赤酵母GS115，結(jié)果如圖4所示。采用本法制備的酵母浸出物能夠很好支持包括地衣芽胞桿菌、大腸桿菌JM109和畢赤酵母的生長(zhǎng)，搖瓶條件下，地衣芽胞桿菌、大腸桿菌和畢赤酵母的最大細(xì)胞生物量(A600)分別為4.495、3.902和42.03，較對(duì)照分別提高了1.9倍、1.3倍和0.1倍；對(duì)細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)與繁殖具有極為顯著的營(yíng)養(yǎng)支撐作用。

a：地衣芽胞桿菌CBBD302；b：大腸桿菌JM109；c：畢赤酵母GS115；■：培養(yǎng)基中采用用自制酵母粉；○：培養(yǎng)基中采用酵母抽提物(OXOID)圖4 酵母浸出物對(duì)微生物生長(zhǎng)的作用Fig.4 Effects of yeast extracts on the cell growth of different microorganisms

3 結(jié)論

本研究依據(jù)酵母細(xì)胞組成大分子的基本特征，采用酶法水解路線實(shí)現(xiàn)了酵母細(xì)胞浸出物的高效酶法制備，由此獲得的酵母浸出物可更好滿足常見(jiàn)工業(yè)菌株如大腸桿菌、地衣芽胞桿菌、巴斯德畢赤酵母細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)需求。研究結(jié)果還將有利于現(xiàn)有酵母浸出物制備工藝的改進(jìn)，也為發(fā)酵工業(yè)中廢棄菌體資源化利用提供新的技術(shù)支持。

[1] 劉杰. 高品質(zhì)生化培養(yǎng)基用酵母抽提物制備的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2011.

[2] TANGULER H, ERTEN H. Utilisation of spent brewer′s yeast for yeast extract production by autolysis: The effect of temperature[J]. Food & Bioproducts Processing, 2008, 86(4):317-321.

[3] SAYED E T, BARAKAT N A M, ABDELKAREEM M A, et al. Yeast extract as an effective and safe mediator for the baker’s-yeast-based microbial fuel cell[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2015, 54(12):3 116-3 122.

[4] IN M J, DONG C K, CHAE H J. Downstream process for the production of yeast extract using brewer′s yeast cells[J]. Biotechnology & Bioprocess Engineering, 2005, 10(1):85-90.

[5] SOMBUTYANUCHIT P, SUPHANTHARIKA M, VERDUYN C. Preparation of 5′-GMP-rich yeast extracts from spent brewer′s yeast[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2001, 17(2):163-168.

[6] CHAE H J, JOO H, IN M J. Utilization of brewer′s yeast cells for the production of food-grade yeast extract. Part 1: effects of different enzymatic treatments on solid and protein recovery and flavor characteristics[J]. Bioresource Technology, 2001, 76(3):253-258.

[7] LOCHBüHLER B, MANTEAU S, MORGE C, et al. Yeast protein extracts: an alternative fining agent for red wines[J]. European Food Research & Technology, 2015, 240(4):689-699.

[8] LIN Mei-li, LIU Xiao-sheng, XU Qian-qian, et al. Aroma-active components of yeast extract pastes with a basic and characteristic meaty flavour[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture, 2014, 94(5):882-889.

[10] M′SADEQ S A, WU Shu-biao, CHOCT M, et al. Use of yeast cell wall extract as a tool to reduce the impact of necrotic enteritis in broilers[J]. Poultry Science, 2015, 94(5):898-905.

[11] SCORER C A, CLARE J J, MCCOMBIE W R, et al. Rapid selection using G418 of high copy number transformants ofPichiapastorisfor high-lever foreign gene expression[J]. Nature Biotechnology, 1994, 12(2):181-184.

[12] 陳延君, 王紅旗, 王然, 等. 鼠李糖脂對(duì)微生物降解正十六烷以及細(xì)胞表面性質(zhì)的影響[J]. 環(huán)境科學(xué), 2007, 28(9):2 117-2 122.

[13] YU Gang, LIU Jin-liang,XIE Lin-qin, et al. Characterization, cloning, and heterologous expression of a subtilisin-like serine protease gene VlPr1 fromVerticilliumlecanii[J]. The Journal of Microbiology, 2012, 50(6):939-946.

[14] CHESBRO W R, AUBORN K. Enzymatic detection of the growth ofStaphylococcusaureusin foods[J]. Applied Microbiology, 1967, 15(5):1 150-1 159.

[15] 趙凱, 許鵬舉, 谷廣燁. 3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定還原糖含量的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(8):534-536.

[16] REZANKA T, MATOULKOVD, KOLOUCHOVI，et al. Extraction of brewer’s yeasts using different methods of cell disruption for practical biodiesel production[J]. Folia Microbiologica, 2015, 60(3):225-234.

[17] 孟國(guó)慶, 王傳寶, 朱陶, 等. 啤酒廢酵母細(xì)胞破壁方法的研究[J]. 中國(guó)果菜, 2014, 34(12):30-34.

[18] KITTUR F S, VISHU KUMAR A B, VARADARAJ M C, et al. Chitooligosaccharides-preparation with the aid of pectinase isozyme fromAspergillusnigerand their antibacterial activity[J]. Carbohydrate Research, 2005, 340(6):1 239-1 245.

Enzymatic hydrolysis ofPichiapastoriscells

ZHANG Yong-jie1, NIU Dan-dan1,2*,WU Hai-yang1,HUANG Lei1,DONG Zi-xing3, LIU Xiao-guang3, YE Xiu-yun2, LU Fu-ping1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China) 2 (Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China) 3 (Department of Biological Chemical Engineering, College of Chemical Engineering and Material Sciences,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China)

Yeast extract contains abundant nutrition and has wide applications in condiment, pharmaceuticals, health care, microbial fermentation and other industries. Using spent yeast cell mass ofPichiapastorisformed during the production of industrial enzymes as raw materials, a novel enzymatic process for preparing yeast extract was established as follows. Spent cells ofP.pastoriswere re-suspended to a final concentration of 10% (w/v). β-Mannases, β-glucanase and pectinase were then added simultaneously to hydrolyze yeast cells at 50 ℃ for 12 h. The hydrolysis was then continuously carried out with neutral protease at 50 ℃ for 7 h. Additionally, the reaction mixture was treated with DNase and RNase for another 4 h. After all enzymatic treatments had been administered, the hydrolysate was centrifuged, and yeast extract was obtained from the supernatant by vacuum freeze-drying or spray drying, with a dissolution rate of 66.2% and a dry matter yield of 65.7%. Yeast extract prepared in this study was much better than that from commercial sources in cultivating microorganisms, including industrially important strainsEscherichiacoli,Bacilluslicheniformis, andP.pastoris.

yeast extract; enzymatic preparation;Pichiapastorisbiomass

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701014

碩士研究生(牛丹丹,路福平教授為通訊作者,E-mail: ddniu0529@fzu.edu.cn，lfl@tust.edu.cn)。

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目(20130628)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(青年基金項(xiàng)目)(14JCQNJC09200)；福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研(JA15049)；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(31461143026)

2016-06-22，改回日期：2016-07-29