李健，李美，高興祥，房鋒，董連紅

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南250100)

菟絲子生防菌“魯保一號”生物學(xué)特性及T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建

李健，李美*，高興祥，房鋒，董連紅

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，山東 濟(jì)南250100)

“魯保一號”菌劑對雜草菟絲子生防效果良好，但是受制于菌種退化問題其進(jìn)一步應(yīng)用受到限制。本研究通過對“魯保一號”菌的生物學(xué)性狀進(jìn)行分析，明確其菌種培養(yǎng)特性：最佳培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)溫度為25～28 ℃，最佳培養(yǎng)pH值為5～8。同時(shí)，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行“魯保一號”菌株轉(zhuǎn)化，并初步構(gòu)建了約含2300個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子的T-DNA插入突變體庫。轉(zhuǎn)化子經(jīng)連續(xù)繼代6次培養(yǎng)后潮霉素B抗性穩(wěn)定，隨機(jī)挑取的20個(gè)轉(zhuǎn)化子均能PCR克隆出潮霉素基因，轉(zhuǎn)化子是由T-DNA插入引起的，且篩選抗性能夠穩(wěn)定遺傳。以上研究為后期篩選獲得致病力穩(wěn)定的遺傳改良菌株，并進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

魯保一號；炭疽菌；生物學(xué)特性；突變體

菟絲子(Cuscutachinensis)是一類惡性寄生雜草[1]，其纖細(xì)的莖蔓纏繞在植物的莖稈上，借吸根從植物體內(nèi)汲取營養(yǎng)物質(zhì)，主要危害大豆(Glycinemax)、牧草和蔬菜等作物[2-4]?！棒敱Ｒ惶枴笔巧綎|省農(nóng)業(yè)科學(xué)院劉志海等于1963年研制成功的、一種對大豆菟絲子有特殊防效的微生物菌劑[5-7]。20世紀(jì)60年代該菌劑曾在山東、江蘇、安徽和寧夏等20多個(gè)省、區(qū)得到推廣和應(yīng)用，推廣面積達(dá)60萬hm2，防除效果在85% 以上，有效的控制了菟絲子在以上地區(qū)的蔓延和危害[5-6]。然而，經(jīng)過長時(shí)間的人工繼代培養(yǎng)，“魯保一號”菌種致病力減弱，產(chǎn)孢量下降，菌劑對大豆菟絲子的致病力降低，基本喪失了生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值[8]。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化(Agrobacteriumtumefaciensmediated transformation, ATMT)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于雙子葉植物和單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究上[9-10]。自1995年Bundock等[11]首次成功進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)酵母菌的遺傳轉(zhuǎn)化以來，到目前為止已在20多種真菌上獲得成功[12-14]。ATMT法可以以不同時(shí)期的真菌作為轉(zhuǎn)化受體[15]，具有受體廣泛，突變單體獲得率高、轉(zhuǎn)化效率高和轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定[16-18]等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，通過ATMT法把外源目的基因或核苷酸片段導(dǎo)入絲狀真菌細(xì)胞，為利用基因互補(bǔ)和基因同源重組等原理分析基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理乃至改造工業(yè)生產(chǎn)菌株指明了方向[15]。

“魯保一號”菌劑生防效果良好，是我國迄今為止推廣面積最廣的一個(gè)雜草生防菌劑[19]。目前，菟絲子在我國黑龍江、山東、天津、江蘇、湖南、江西、甘肅和廣州等省市廣泛分布，且在大豆、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、柑橘(Citrusreticulata)和綠化植物上危害逐年嚴(yán)重。2007年夏，寧夏草原大面積發(fā)生菟絲子危害，發(fā)生總面積約為33.3萬hm2，成災(zāi)面積10萬hm2，占草原面積的4.0%[20]。目前菟絲子化學(xué)防除難度較大，因?yàn)榫N退化問題而遺棄高效菌株無疑是對菌種資源的巨大浪費(fèi)，因此急需對“魯保一號”展開系統(tǒng)的研究，解決其培養(yǎng)和菌種退化問題，為工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)和材料支撐。

本研究運(yùn)用形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)相結(jié)合方法對“魯保一號”菌株進(jìn)行細(xì)化歸類，同時(shí)明確其多個(gè)最佳培養(yǎng)條件，為下一步遺傳改造和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化“魯保一號”菌株，構(gòu)建其T-DNA(transfer DNA)插入突變體庫，以期獲得具有穩(wěn)定致病力的遺傳改良菌株，并結(jié)合生物學(xué)特性研究，為該菌株的重新應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株和載體：農(nóng)桿菌菌株AGL-1和載體pBHt2 均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所雜草實(shí)驗(yàn)室保存?！棒敱Ｒ惶枴本曩徸灾袊胀ㄎ⑸锞N保藏中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，對該菌株連續(xù)多次回接菟絲子后獲得復(fù)壯菌株為供試材料。

試驗(yàn)時(shí)間：本研究于2015年在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所雜草室及溫室完成。

供試培養(yǎng)基：本研究所用培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(potato sucrose agar, PSA)、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基(peptone dextrose agar, SDA)、真菌培養(yǎng)基(改良馬丁培養(yǎng)基，fungi medium, FM)、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基(carrot agar medium，CAM)和水瓊脂培養(yǎng)基(water agar medium，WAM)等基本配方參考李健等[21]和方中達(dá)[22]的方法?；九囵B(yǎng)基MM(minimal medium)、共培養(yǎng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基(co-induction medium, co-IM)的配置方法參照黃貴修等[23]和王文娟[24]的方法配制。

1.2 菌株鑒定

將所購買“魯保一號”菌株在PDA平板上培養(yǎng)7～10 d，無菌水洗下分生孢子，通過劃破法接種到菟絲子內(nèi)，保濕侵染3～4 d后，真菌離體分離法分離菌種。連續(xù)5次復(fù)壯后，獲得致病力恢復(fù)的“魯保一號”菌株，并以該菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

“魯保一號”菌株在PDA平板上培養(yǎng)7～10 d，期間觀察并記錄其菌落形態(tài)。用無菌水將培養(yǎng)基表面的分生孢子洗下，制成分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)濃度至1×105個(gè)孢子/mL左右。顯微鏡下觀察“魯保一號”菌分生孢子形態(tài)。

CTAB法[25]提取“魯保一號”菌株的基因組DNA，采用引物ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5 (5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物回收后送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測得序列提交到NCBI Genebank (National Center for Biotechnology Information，美國生物信息中心)，進(jìn)行BLAST分析，并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 “魯保一號”菌株最佳培養(yǎng)條件的測定

1.3.1 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基活化“魯保一號”菌株，7 d后，在菌落的邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到各供試培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)10 d后測量菌落直徑；4 mL/皿無菌水洗下分生孢子，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)；棉棒輕輕涂下培養(yǎng)基表面菌絲，80 ℃烘箱烘烤2 h后稱量干重，以上每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，每次4個(gè)重復(fù)(下同)。

1.3.2 溫度和pH值 以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接菌后將溫度條件設(shè)置為19，22，25，28，31，34和37 ℃等7個(gè)溫度梯度，接菌10 d后，測量菌落直徑、菌絲重量和產(chǎn)孢量。

將PDA培養(yǎng)基滅菌后調(diào)制成不同pH值，設(shè)置的pH值為3，4，5，6，7，8，9，10等8個(gè)梯度。25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)10 d后，參照1.3.1的方法統(tǒng)計(jì)菌落直徑、菌絲重量和產(chǎn)孢量。

1.4 T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建

1.4.1 潮霉素B抑制濃度的篩選 為了確定潮霉素B的使用濃度，將“魯保一號”菌分生孢子懸浮液的孢子濃度調(diào)整為1×104個(gè)/mL，吸取100 μL分別接種于含潮霉素B濃度為0，100，150，200，250，300 μg/mL的MM培養(yǎng)基上，25 ℃，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每隔1 d觀察孢子萌發(fā)生長情況，直至第5天，以能夠抑制孢子萌發(fā)的最低濃度為潮霉素B的最終篩選濃度。

1.4.2 分生孢子懸浮液的制備及農(nóng)桿菌菌液的制備 PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng)“魯保一號”菌株，10 d后6 mL/皿無菌水洗下菌落表面分生孢子，雙層擦鏡紙過濾，通過血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下觀察濾液中的孢子濃度，然后用一定量的無菌水調(diào)整孢子液，使孢子濃度達(dá)到1×105個(gè)/mL，備用。

挑取新鮮活化好的含雙元載體pBHt2的農(nóng)桿菌AGL-1單菌落，接種于2 mL的LB液體培養(yǎng)基(卡那霉素50 μg/mL)中，220 r/min、28 °C培養(yǎng)1 d，備用。

1.4.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化參照李偉等[26]的方法，并略作修改。取搖好的農(nóng)桿菌溶液250 μL置于50 mL的MM培養(yǎng)基(卡那霉素50 μg/mL)中，220 r/min，28 ℃搖床瓶培養(yǎng)2 d，測量菌液的OD600值，然后用MM液體培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度使OD600值達(dá)到0.3。將含200 μmol/L 乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)和1.0 mg/mL 2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid, MES)的co-IM(pH 5.5)培養(yǎng)基倒平板，并鋪一層無菌的玻璃紙于其上，將100 μL孢子濃度為1×106個(gè)/mL的分生孢子和100 μL OD600=0.3農(nóng)桿菌菌液混勻后用涂布器輕涂于玻璃紙上，25 ℃共培養(yǎng)36 h，然后將玻璃紙揭下，帶菌面朝貼于PDA固體培養(yǎng)基(含頭孢霉素、潮霉素B)上，25 °C培養(yǎng)3 d后揭下玻璃紙，繼續(xù)培養(yǎng)4～7 d至PDA培養(yǎng)基內(nèi)長出轉(zhuǎn)化子，挑取轉(zhuǎn)化子至新的PDA(含有頭孢霉素和潮霉素B抗生素)培養(yǎng)基內(nèi)，編號后濾紙片法保存菌種。

1.4.4 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定 剪取部分轉(zhuǎn)化子的濾紙片在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行連續(xù)繼代培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)5代后接種到含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，驗(yàn)證其潮霉素B抗性遺傳穩(wěn)定性。同時(shí)挑取部分轉(zhuǎn)化子菌落接種到PDA液體培養(yǎng)基中，26 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲體，提取基因組DNA，PCR檢測潮霉素基因(潮霉素基因引物，Hyg-F: TCGATGTAGGAGGGCGTGGA; Hyg-R: CGCGTCTGCTGCTCCATACAAG)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

“魯保一號”菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d后，菌落邊緣規(guī)則，生長初期氣生菌絲為白色，后隨著分生孢子的產(chǎn)生轉(zhuǎn)為粉紅色，分生孢子為無色單孢，呈圓柱狀，兩端鈍圓(圖1)。PCR克隆該菌株18S rRNA序列(圖2)，并提交到NCBI Genebank，獲得Genebank號：KX263470。并通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，同源性和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明“魯保一號”菌與炭疽菌同源性較強(qiáng)。根據(jù)培養(yǎng)特性、系統(tǒng)發(fā)育樹分析和寄主種類等結(jié)果，“魯保一號”菌株屬于炭疽菌屬(Colletotrichum)，為尖孢炭疽菌(C.acutatum)，具體為尖孢炭疽菌菟絲子轉(zhuǎn)化型 (C.acutatumf. sp.cuscuta)。

2.2 培養(yǎng)條件的篩選

2.2.1 不同培養(yǎng)基內(nèi)的生長情況 如表1所示，“魯保一號”菌株在本研究所提供的5種真菌培養(yǎng)基內(nèi)菌落直徑不存在顯著差異。但是，綜上分析菌絲重量和分生孢子產(chǎn)量等因素，PDA培養(yǎng)基為最適合“魯保一號”菌株生長和產(chǎn)孢的培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 d后其產(chǎn)孢量達(dá)到285.4×109個(gè)孢子/皿左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他真菌培養(yǎng)基。

圖1 “魯保一號”菌株菌落與分生孢子Fig.1 Colony and conidia of Lubao No.1 strainA：“魯保一號”菌落Colony of Lubao No.1 strain；B：分生孢子Conidia of Lubao No.1 strain.

2.2.2 溫度對“魯保一號”菌生長的影響 以PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究7個(gè)溫度梯度下 “魯保一號”菌株生長狀況。由表2可以看出，綜合分析菌落直徑和分生孢子產(chǎn)量，菌株在25和28 ℃培養(yǎng)條件下生長最好，而當(dāng)溫度低于25 ℃時(shí)或高于28 ℃時(shí)菌落直徑和產(chǎn)孢量均顯著下降，而相對高溫(大于28 ℃)對于菌株生長的影響更大。

圖2 “魯保一號”菌系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 Phylogenesis analysis of Lubao No.1 strain

2.2.3 pH值對“魯保一號”菌生長的影響 由表3可以看出，“魯保一號”菌其適應(yīng)范圍較廣，在pH 值3～10上均能生長，其中在pH 4～9下菌落直徑不存在顯著差異。結(jié)合產(chǎn)孢量分析，“魯保一號”菌最適pH值為5～8，在該范圍內(nèi)其菌落直徑和產(chǎn)孢量均相近。而當(dāng)培養(yǎng)基pH<5和pH>8時(shí)其分生孢子產(chǎn)量顯著降低。

圖3 “魯保一號”菌株在潮霉素B濃度梯度培養(yǎng)基上的耐受實(shí)驗(yàn)Fig.3 Tolerance experiment of the Lubao No.1 strain on the concentration gradient of hygromycin B

2.3 T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建

2.3.1 “魯保一號”菌株對潮霉素B的耐受性 選取 “魯保一號”菌株為材料，在含不同潮霉素B濃度的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明(圖3)，在潮霉素B濃度為250 μg/mL 的培養(yǎng)基上，接種的分生孢子不能生長，而在200 μg/mL及較低濃度下在接種的分生孢子液邊緣均長出菌絲。因此，后續(xù)突變體庫的構(gòu)建過程中選取潮霉素B濃度為250 μg/mL作為篩選濃度。

2.3.2 陽性轉(zhuǎn)化子的獲得與驗(yàn)證 共培養(yǎng)3～5 d后，挑取轉(zhuǎn)化子，濾紙片法保存。經(jīng)6次遺傳轉(zhuǎn)化共獲得2267個(gè)轉(zhuǎn)化子。在普通PDA平板上活化轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)化子，連續(xù)繼代培養(yǎng)6代后，轉(zhuǎn)入含有潮霉素B的PDA平板上，結(jié)果如圖4A所示，轉(zhuǎn)化所獲得突變體對潮霉素B的抗性能夠穩(wěn)定遺傳。潮霉素基因PCR鑒定顯示(圖4B)，獲得的轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出特異性條帶，回收PCR產(chǎn)物測序結(jié)果為潮霉素基因。

表1 “魯保一號”菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況Table 1 The growth of Lubao No.1 on different culture media

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，同行數(shù)據(jù)后的不同字母表示在 0.05 水平上差異顯著，下同。

Note: The values in the table are the average value±the standard error (n=3), and the different letters within the same row data indicates that the difference is significant at the 0.05 level. The same below.

表2 溫度對“魯保一號”菌株生長的影響Table 2 Effects of the temperature on the growth of the strain Lubao No.1

表3 pH值對“魯保一號”菌株生長的影響Table 3 Effect of pH value on the growth of strain Lubao No.1

圖4 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證Fig.4 Transformants verification A：潮霉素抗性穩(wěn)定性驗(yàn)證，CK為野生型對照，1～11為轉(zhuǎn)化子;B：轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證，其中各泳道分別為：M為Marker，1為載體pBHt2，2為轉(zhuǎn)載體后農(nóng)桿菌AGL-1，CK為野生型對照，3～22為轉(zhuǎn)化子。A: Resistance stability validation of hygromycin, wild-type CK was used as a control, number 1-11 were transformants. B: PCR verification of the transformants, lane M was Marker, lane 1 was the pBHt2 vector, lane 2 was Agrobacterium AGL-1 after transformation, CK was the negative control, and lane 3-22 were the transformants.

3 討論與結(jié)論

我國每年因雜草危害造成的農(nóng)作物產(chǎn)量損失達(dá)9.7%[27]。而化學(xué)除草劑的長期使用會(huì)導(dǎo)致高抗性雜草的產(chǎn)生，從而使得除草劑的使用陷入使用劑量逐漸增加的惡性循環(huán)，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和食品安全問題[28-29]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們環(huán)保意識的增強(qiáng)和對食品安全的關(guān)注，長效無毒的生物除草劑逐漸成為當(dāng)前研制和開發(fā)的熱點(diǎn)之一[30]。

菟絲子是危害嚴(yán)重的寄生雜草?！棒敱Ｒ惶枴笔且环N對菟絲子有特殊防效的微生物菌劑，一度推廣面積達(dá)60萬hm2，防除效果在85%以上。但是該菌株在經(jīng)過較長時(shí)間的人工培養(yǎng)后，菌株致病力發(fā)生退化，基本喪失實(shí)用價(jià)值，受制于當(dāng)時(shí)的技術(shù)條件，該菌株一度被遺棄[8]?！棒敱Ｒ惶枴本N發(fā)現(xiàn)時(shí)間較早，加上后期退化后使用頻率的減少，缺乏關(guān)于其生物特性的系統(tǒng)研究，而明確其菌株特性也是其進(jìn)一步應(yīng)用的先決條件。本研究顯示，該菌株能在多種培養(yǎng)基上生長，且產(chǎn)孢量巨大，對培養(yǎng)基成分要求較低；該菌株環(huán)境適應(yīng)范圍廣，在多個(gè)溫度條件和pH條件下均能正常生長和產(chǎn)生分生孢子，以上特性說明如果能解決其菌種退化問題，“魯保一號”仍然是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用價(jià)值的優(yōu)良生防菌株。

優(yōu)良菌株的獲得是開展雜草生物防治的前提，也是最關(guān)鍵因素。而對于經(jīng)過實(shí)踐驗(yàn)證的具有良好生物防效，同時(shí)環(huán)境安全的“魯保一號”菌株來說，因?yàn)榫N退化而被遺棄，無疑是巨大的資源浪費(fèi)。而隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，尤其是真菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的日趨完善，為通過分子生物學(xué)手段從基因?qū)用娓牧忌谰?，?chuàng)造優(yōu)良高效菌株創(chuàng)造了條件[29-30]。本研究室以探索“魯保一號”菌種退化機(jī)理為方向，以創(chuàng)制致病力穩(wěn)定的改良型菌株為目的，初步運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化“魯保一號”菌株，構(gòu)建其T-DNA插入突變體庫，為后期篩選獲得能夠具有穩(wěn)定致病力的遺傳改良菌株奠定基礎(chǔ)；同時(shí)，菌種退化的問題也在多種絲狀真菌內(nèi)存在，是困擾生防真菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的重要難題之一，而與菌株退化有關(guān)基因的篩選鑒定無疑是解決這一問題的先決條件。

References：

[1] Li Y H. Identification, Control and Quarantine of Weed[M]. Nanjing: Jiangsu Science Press, 1981: 302-303. 李揚(yáng)漢. 田園雜草的識別、防除與檢疫[M]. 南京: 江蘇科學(xué)出版社, 1981: 302-303.

[2] Shan L H. The damage characteristics and control methods ofCuscutachinensis. The Chinese Livestock and Poultry Breeding, 2013, (3): 17. 單麗華. 菟絲子的危害特點(diǎn)及防治方法. 中國畜禽種業(yè), 2013, (3): 17.

[3] Shi X F. The measures for control of dodder. Shaanxi Forest Science and Technology, 2014, (2): 101-103. 石曉峰. 菟絲子的發(fā)生及防治方法. 陜西林業(yè)科技, 2014, (2): 101-103.

[4] Gao Z Y, Gan J E, Zhang Y J. The prevention and control of soybean dodder. China Rural Science and Technology, 1997, 4: 17-18. 高昭遠(yuǎn), 干靜娥, 張玉潔. 大豆菟絲子的防治. 中國農(nóng)村科技, 1997, 4: 17-18.

[5] Liu Z H, Zhu Q R. Lubao No.1 Strain[M]. Jinan: Shandong Science and Technology Press, 1980. 劉志海, 朱全讓. 魯保一號菌[M]. 濟(jì)南: 山東科技出版社, 1980.

[6] Yang C X. Study of Phyllosticta F-3 Strain to Control Dayflower Leaf Blight[D]. Shenyang: Shenyang Agricultural University, 2006. 楊春喜. 葉點(diǎn)霉F-3菌株對鴨跖草防除潛力的研究[D]. 沈陽: 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué), 2006.

[7] Zhang T Y.Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.f.sp.cuseutae. Acta Fungus Sinica, 1985, 4(4): 234-239. 張?zhí)煊? 膠孢炭疽菌菟絲子?；? 真菌學(xué)報(bào), 1985, 4(4): 234-239.

[8] Lin B Q, Nie Z, Guo H C. Bacterial degradation of the Lubao No.1 strain. Microbiology China, 1979, 6(2): 1-4. 林伯荃, 聶征, 郭恒聰. 魯保一號菌的菌種退化. 微生物學(xué)通報(bào), 1979, 6(2): 1-4.

[9] Li G T.Agrobacteriumtumefaciens-mediated Transformation ofTrichodermavirideand Correlations between Mycoparasitism and Biological Control[D]. Zibo: Shandong University of Technology, 2007. 李國田. 土壤桿菌介導(dǎo)的綠色木霉插入突變及重復(fù)寄生與生物防治能力的關(guān)系[D]. 淄博: 山東理工大學(xué), 2007.

[10] Yao R, Shi M L, Pan S Y,etal. Progress onAgobacteriumtumefaciens-mediated plant transformation. Current Biotechnology, 2011, (4): 260-265. 姚冉, 石美麗, 潘沈元, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展. 生物技術(shù)進(jìn)展, 2011, (4): 260-265.

[11] Bundock P, den Dulk-Ras A, Beijersbergen A,etal. Trans-kingdom T-DNA transfer fromAgrobacteriumtumefacienstoSaccharomycescerevisiae. The EMBO Journal, 1995, 14(13): 3206-3214.

[12] De Groot M J, Bundock P, Hooykaas P J,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology, 1998, 16: 839-842.

[13] Abuodeh R O, Orbach M J, Mandel M A,etal. Genetic transformation ofCoccidioidesimmitisfacilitated byAgrobacteriumtumefaciens. Journal of Infectious Diseases, 2000, 181(6): 2106-2110.

[14] Mullins E, Chen X, Romaine P,etal.Agrobacterium-mediated transformation ofFusariumoxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology, 2001, 91(2): 173-180.

[15] Li H Y. T-DNA Insertional Mutagenesis ofMagnaporthegrisea[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2003. 李宏宇. 稻瘟病菌T-DNA插入突變研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2003.

[16] Bundock P, Mroczek K, Winkler A,etal. T-DNA fromAgrobacteriumtumefaciensas an efficient tool for gene targeting inKluyveromyceslactis. Molecular and General Genetics, 1999, 261(1): 115-121.

[17] Michielse C, Arentshorst M, Ram A,etal.Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement efficiency inAspergillusawamori. Fungal Genetics and Biology, 2005, 42(1): 9-19.

[18] Tsuji G, Fujii S, Fujihara N,etal.Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis inColletotrichumlagenarium. Journal of General Plant Pathology, 2003, 69(4): 230-239.

[19] Liu B W. The good effect of bacteria liquid of Lubao No.1 to control soybean dodder. Hebei Agriculture, 2003, (5): 20. 劉炳文. 用“魯保一號”菌液防治大豆菟絲子效果好. 河北農(nóng)業(yè), 2003, (5): 20.

[20] Li Y F, Li K C, Huang W G,etal. The first large-scale occurrence ofCuscutachinensisin Ningxia plain. Plant Protection, 2008, (3): 151-153. 李寅菲, 李克昌, 黃文廣, 等. 寧夏草原首次大面積發(fā)生菟絲子危害. 植物保護(hù), 2008, (3): 151-153.

[21] Li J, Li Y, Gao X X,etal. The biological characteristics ofDigitariasanguinalispathogenFusariumchlamydosporumstrain ZC201301. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(3): 234-239. 李健, 李巖, 高興祥, 等. 馬唐生防菌厚垣孢鐮刀菌ZC201301的生物學(xué)特性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 234-239.

[22] Fang Z D. Plant Pathology Research Method[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2001. 方中達(dá). 植病研究法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[23] Huang G X, Xue Y C, Lu X. Construction of a T-DNA insertional mutant library ofColletotrichumgloeosporioidesof mango and its molecular analysis. Chinese Journal of Tropical Crops, 2008, 29(1): 27-32. 黃貴修, 薛迎春, 盧昕. 膠孢炭疽菌T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及其分子分析. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2008, 29(1): 27-32.

[24] Wang W J. Construction of a T-DNA Insertional Library ofColletotrichumgloeosporioidesES026[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2014. 王文娟. 膠胞炭疽菌ES026 T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.

[25] Zhang Y H, Wei D S, Xing L J,etal. A modified method for isolating DNA from fungus. Microbiology China, 2008, 35(3): 466-469. 張穎慧, 魏東盛, 邢來君， 等. 一種改進(jìn)的絲狀真菌DNA提取方法. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(3): 466-469.

[26] Li W, Zheng X L, He C P,etal. Establishment ofAgrobacterium-mediated transformation systems forColletotrichumgloeosporioides. Plant Protection, 2008, 34(1): 76-81. 李偉, 鄭肖蘭, 賀春萍, 等. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的膠孢炭疽菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立. 植物保護(hù), 2008, 34(1): 76-81.

[27] Cui A J. Study on the Investigate and Chemistry Controlling of Malignant Weed in Seed Product Field ofAgropyronmongolicumKeng[D]. Huhhot: Inner Mongolia Agricultural University, 2009. 崔愛嬌. 蒙農(nóng)1號蒙古冰草種子田雜草調(diào)查與化學(xué)防除研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

[28] Zhang C X, Ni H W, Wei S H,etal. Current advances in research on herbicide resistance. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(4): 1274-1289. 張朝賢, 倪漢文, 魏守輝, 等. 雜草抗藥性研究進(jìn)展. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(4): 1274-1289.

[29] Qiang S, Chen S G. Current status of bioherbicide research and development and its opportunities and challenges. Weed Science, 2011, 29(1): 1-6. 強(qiáng)勝, 陳世國. 生物除草劑研發(fā)現(xiàn)狀及其面臨的機(jī)遇與挑戰(zhàn). 雜草科學(xué), 2011, 29(1): 1-6.

[30] Zhao H, Zhou Y J, Liu X C,etal. Advances in bioherbicide formulation. Plant Protection, 2005, 31(5): 5-8. 趙航, 周勇軍, 劉小川, 等. 生物除草劑劑型研究進(jìn)展. 植物保護(hù), 2005, 31(5): 5-8.

Biological characteristics of Lubao No.1 biological control agent (Colletotrichum gloeosporioides) and construction of a T-DNA insertional mutant library

LI Jian, LI Mei*, GAO Xing-Xiang, FANG Feng, DONG Lian-Hong

InstituteofPlantProtection,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100,China

The application of Lubao No.1 microbial agent has been limited because of its degradation, although the strain shows high bio-herbicidal activity againstCuscutachinensis. The results of an investigation of the biological characteristics of Lubao No.1 showed that the optimal mycelium growth medium was PDA medium. The optimal culture temperature is 25-28 ℃, and optimal initial pH of culture media was 5-8. Construction of a T-DNA insertional mutant library of Lubao No.1 using anAgrobacteriummediated transformation method, produced about 2300 positive transformants. Randomly selected transformants were all resistant to hygromycin B. A hygromycin gene fragment was amplified by PCR from all 20 tested mutants, indicating that the resistance of the transformants to hygromycin B was stable and was caused by the inserted T-DNA. This study laid the foundation for obtaining further applications of a genetically modifiedColletotrichumstrains with stable pathogenicity.

Lubao No.1;Colletotrichum; biological characteristics; mutants

10.11686/cyxb2016238

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-06-07；改回日期：2016-08-05

山東省自然科學(xué)基金(ZR2015CQ014)資助。

李健(1986-)，男，山東臨沂人，助理研究員，博士。E-mail: lijian910@163.com*通信作者Corresponding author. E-mail: limei9909@163.com

李健, 李美, 高興祥, 房鋒, 董連紅. 菟絲子生防菌“魯保一號”生物學(xué)特性及T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 142-148.

LI Jian, LI Mei, GAO Xing-Xiang, FANG Feng, DONG Lian-Hong. Biological characteristics of Lubao No.1 biological control agent (Colletotrichumgloeosporioides) and construction of a T-DNA insertional mutant library. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 142-148.