柳思琪 馬俐君 顏宏利 王文睿 金珍婧

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，長春130021)

RhoGDI2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義①

柳思琪 馬俐君②顏宏利③王文睿 金珍婧

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院，長春130021)

目的：探討RhoGDI2在結(jié)直腸癌中表達(dá)及臨床意義。方法：通過免疫組化檢測 RhoGDI2 在結(jié)直腸癌組織、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)，分析其與CRC患者臨床因素及生存期之間的關(guān)系。結(jié)果：RhoGDI2在癌旁組織、腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)； RhoGDI2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P<0.05)；高表達(dá)RhoGDI2者總生存期及無病生存期短。結(jié)論：RhoGDI2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，且與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，高表達(dá)RhoGDI2者總生存期及無病生存期短。

RhoGDI2;結(jié)直腸癌;轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢，對人類的生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅。CRC的侵襲及轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因，但明確的生物學(xué)機(jī)制尚不明確，CRC的5年生存率仍徘徊在50%左右[1,2]。

Rho鳥苷三磷酸酶(RhoGTPases)家族包括Rac1、RhoA和Cdc42，它調(diào)控著諸多的信號傳導(dǎo)途徑，尤其在細(xì)胞形態(tài)、遷移、黏附、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞周期及基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮至關(guān)重要作用，更有研究證實(shí)部分腫瘤增殖及凋亡也受影響[3-5]。Rho鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子(RhoGDP dissociation inhibitor，Rho GDI)作為RhoGTPases活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮至關(guān)重要作用[6]，目前已有大量文獻(xiàn)報(bào)道RhoGDI2在肺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等腫瘤中的意義，但其在CRC中發(fā)揮作用及機(jī)制研究甚少[7-10]。

本研究通過免疫組化方法RhoGDI2在CRC腫瘤原發(fā)灶、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)，進(jìn)一步分析其與CRC患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系及對總生存期和無病生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本及臨床資料 本研究從吉林大學(xué)第一醫(yī)院病理科嚴(yán)格選取2006年6月至2012年11月期間行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者手術(shù)切除的原發(fā)灶組織石蠟標(biāo)本共計(jì)87例，其中男性54例，女性33例，年齡28～88歲，中位年齡60歲，結(jié)直腸癌TNM分期按 AJCC2010第七版標(biāo)準(zhǔn),其中Ⅰ期19例,Ⅱ期21例,Ⅲ期22例,Ⅳ期25例。所有患者自術(shù)后起均通過電話隨訪至死亡或存活滿5年。并選取18例患者對應(yīng)的癌旁組織石蠟切片和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織石蠟切片，所有選擇標(biāo)本均經(jīng)過HE染色及組織學(xué)確認(rèn)，并由兩位病理科醫(yī)生共同診斷確定結(jié)果，全部病患術(shù)前均未行放化療及靶向治療。所有患者相應(yīng)臨床資料均經(jīng)吉林大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)同意后從吉林大學(xué)第一醫(yī)院病案室或經(jīng)隨訪獲得。

1.1.2 試劑 兔抗人RhoGDI2抗體購自美國Abcam公司，兔二抗購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 脫蠟、水化：組織切片置于75℃烤箱內(nèi)烘烤15 min；二甲苯切片浸泡15 min，共兩次；100%無水乙醇浸泡2 min-100%乙醇再浸泡2 min-90%乙醇浸泡2 min-80%乙醇浸泡2 min-70%乙醇浸泡2 min；1×PBS清洗5 min×3次；封閉酶阻斷劑：每張組織切片上滴加配置好的H2O2及甲醇混合液( H2O2：甲醇=1∶9)100 μl，室溫條件下避光靜置10 min；1×PBS清洗5 min×3次；抗原熱修復(fù)：枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫：1×PBS清洗5 min×3次；封閉：10% BSA 37℃條件下封閉30 min；滴加抗體稀釋液稀釋的一抗50 μl，4℃孵育過夜；次日復(fù)溫后1×PBS清洗5 min×3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗50～100 μl，37℃孵育75 min；1×PBS清洗5 min×3次；DAB顯色：滴加50 μl新鮮配制的DAB工作液，室溫孵育，顯微鏡下觀察以控制顯色時(shí)間，自來水沖洗10 min；蘇木素45 μl復(fù)染1 min；自來水洗1 min；鹽酸酒精分化1 s；自來水洗1 min；稀氨水返藍(lán)8 s；脫水、封片：80%乙醇30 s-90%乙醇30 s-100%乙醇1 min-100%乙醇2 min-二甲苯2 min二甲苯2 min，晾干后中性樹膠封片；普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判讀 ①RhoGDI2表達(dá)主要位于細(xì)胞漿內(nèi)，在顯微鏡下觀察到胞漿中出現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性；未觀察到棕黃色或棕褐色顆粒者則為陰性。②評分標(biāo)準(zhǔn)：請3位病理科醫(yī)生對切片進(jìn)行鏡檢觀察，3人對切片所對應(yīng)患者病理資料不知情，且各自獨(dú)立在普通光學(xué)顯微鏡閱片，在切片中隨機(jī)挑選5個(gè)視野，根據(jù)切片中陽性細(xì)胞百分率和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度判斷結(jié)果。其中陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn):陰性為0分，淡棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。陽性細(xì)胞百分率評分標(biāo)準(zhǔn)：0～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。組織標(biāo)本陽性等級評分=陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分+陽性細(xì)胞百分率評分，0～2分為(-)，3分為(+)，4分為(++)，≥5分為(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析采用χ2檢驗(yàn)或 Fisher分析；原發(fā)灶、癌旁組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)蛋白表達(dá)差異比較釆用χ2檢驗(yàn)；利用Kaplan-Meier繪制生存曲線；所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 6.0或SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05定義為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.01定義為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 RhoGDI2在結(jié)直腸癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)水平 RhoGDI2在18例結(jié)直腸癌患者腫瘤原發(fā)灶、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中陽性表達(dá)分別為6例、0例及12例，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法比較RhoGDI2在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中陽性率明顯高于腫瘤原發(fā)灶及癌旁組織。見表1、圖1。

2.2 RhoGDI2表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 我們將RhoGDI2在87例結(jié)直腸癌患者的原發(fā)灶中表達(dá)水平與相應(yīng)患者臨床病理指標(biāo)結(jié)合，通過χ2檢驗(yàn)來統(tǒng)計(jì)它們之間的關(guān)系。見表2。

表1 RhoGDI2蛋白在結(jié)直腸癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中的表達(dá)情況

Tab.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues

GroupsnPositivePositiveratePCRCtissues186333%<0001Para?tumorous1800Lymphnodes1812667%

圖1 RhoGDI2蛋白在結(jié)直腸癌、癌旁組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)(SP，×200)Fig.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues(SP，×200)

表2 RhoGDI2 表達(dá)與臨床病理指標(biāo)關(guān)系

Tab.2 Relationship between RhoGDI2 expression and clinical factors

ClinicalfactorsnRhoGDI2expressionHighLowPn872364Age06828<60411031≥60461333Gender05227Male541341Female331023Size03562<5cm451035≥5cm421329Locationoftumor06427Colon611744Rectum26620Number03911Single852362Multiple202Differentiation05661High202Moderate471433Poor38929Stage00812I+Ⅱ40733Ⅲ+Ⅳ471631Lymphnodemetastasis003371)(+)441628(-)43736Remotemetastasis002841)(+)261115(-)611249Vascularinvasion04374(+)321022(-)551342Venousinvasion02003(+)321121(-)551243

Note：1)P<0.05.

2.3 RhoGDI2與結(jié)直腸癌總生存期及無病生存期關(guān)系 將RhoGDI2在87例結(jié)直腸癌患者中表達(dá)水平與結(jié)直腸癌總生存期及無病生存期關(guān)系通過Kaplan-Meier繪制生存曲線來統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖2、3。

圖2 不同表達(dá)量的RhoGDI2與結(jié)直腸癌患者總生存期關(guān)系Fig.2 Relationship between different expression of RhoGDI2 with overall survival in patients with CRC

圖3 不同表達(dá)量的RhoGDI2與結(jié)直腸癌患者無病生存期關(guān)系Fig.3 Relationship between different expression of RhoGDI2 with disease-free survival in patients with CRC

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢，逐漸成為一種嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾病。隨著外科手術(shù)的進(jìn)步、放化療及靶向治療的應(yīng)用，結(jié)腸癌患者預(yù)后有所改善，但腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的主要原因，且逐漸成為提高患者生存期及改善預(yù)后的主要屏障。因此，深入研究結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，積極尋求對抗方法，對進(jìn)一步改善患者預(yù)后、延長生存期有重大意義。

Rho蛋白家族屬于Ras癌基因超家族，是一組相對分子質(zhì)量約為20～30 kD的GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，習(xí)慣上被稱為Rho GTP酶，包括RhoA、Rac1、Cdc42[11]。

RhoGDIs與其他兩個(gè)調(diào)節(jié)因子RhoGEFs和RhoGAPs不同(每一家族超過60成員)，只存在三種亞型： RhoGDI1或RhoGDIα、RhoGDI2或RhoGDIβ及RhoGDI3或RhoGDIγ，其中，RhoGDI1和RhoGDI3表達(dá)量較低，主要與高爾基體和囊泡功能相關(guān)，在腫瘤方面的作用知之甚少。RhoGDI2由201個(gè)氨基酸構(gòu)成，分子量為27 kD，是RhoGDIs中表達(dá)最高的，最初認(rèn)為其僅特異性地表達(dá)在淋巴造血組織，參與調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活化、存活及反應(yīng)性。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，RhoGDI2在許多惡性腫瘤組織中異常表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。

RhoGDI2 在人體多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)。Theodorescu等[12，13]研究表明，RhoGDI2在原發(fā)性膀胱癌中表達(dá)水平低甚至不表達(dá)，其表達(dá)水平和膀胱癌患者生存率呈正相關(guān)，并通過單因素及多因素分析證實(shí)其是膀胱癌患者預(yù)后評估的獨(dú)立因子。RhoGDI2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，有研究指出乳腺增生病變區(qū)域RhoGDI2比乳腺正常上皮細(xì)胞表達(dá)量高，浸潤型乳腺癌中RhoGDI2 的表達(dá)比乳腺原位癌中的低，另外RhoGDI2 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[14，15]。RhoGDI2表達(dá)和胰腺癌的關(guān)系研究顯示RhoGDI2在胰腺癌中表達(dá)升高，且受累神經(jīng)節(jié)也可見RhoGDI2表達(dá)升高，siRNA RhoGDI2表達(dá)后可導(dǎo)致胰腺腫瘤細(xì)胞對神經(jīng)侵襲能力改變[16]。Cho等[17]發(fā)現(xiàn)RhoGDI2在晚期胃癌組織中表達(dá)明顯高于早期胃癌組織和正常胃黏膜，與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。還有學(xué)者指出 RhoGDI2在高分化卵巢癌中的表達(dá)水平較高，其過表達(dá)與腫瘤病理類型有關(guān)，與腫瘤分期無關(guān)[8,18]。

本研究利用免疫組化檢測RhoGDI2在不同結(jié)直腸癌組織中表達(dá)情況，以及在原發(fā)灶、癌旁組織、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)等表達(dá)差異性，以研究RhoGDI2表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移有無相關(guān)性，同時(shí)結(jié)合患者臨床化驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行分析，以明確該其與患者預(yù)后關(guān)系。結(jié)果顯示RhoGDI2蛋白在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、腫瘤原發(fā)灶、癌旁組織中表達(dá)逐漸降低，其表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與性別、年齡、腫瘤大小、位置、分期及分化程度等無關(guān)，高表達(dá)RhoGDI2的患者總生存期及無病生存期短，RhoGDI2的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

4 結(jié)論

RhoGDI2在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯升高，其在轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、原發(fā)灶、癌旁組織中表達(dá)量依次降低，RhoGDI2的表達(dá)與結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，與性別、年齡、腫瘤大小、數(shù)目、分期、分化程度、血管浸潤及神經(jīng)侵襲等無關(guān)，高表達(dá)RhoGDI2的患者總生存期及無病生存期短。

[1] Jemal A,Center MM,De Santis C,etal.Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends[J].Cancer Epidemiol Bio-markers Prev,2010,19(8):1893.

[2] 代 珍，鄭榮壽，鄒小農(nóng)，等.中國結(jié)直腸癌發(fā)病趨勢分析和預(yù)測[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2012,46(7):598.

[3] Hall A.The cytoskeleton and cancer[J].Cancer Metastasis Rev，2009,28(1-2):5-14.

[4] Hall A.Rho family GTPases[J].Biochem Soc Trans，2012,40(6):1378-1382.

[5] Vega FM,Ridley AJ.Rho GTPases in cancer cell biology[J].FEBS Lett，2008,582(14):2093-2101.

[6] Karlsson R,Pedersen ED,Wang Z,etal.Rho GTPase function in tumorigenesis[J].Biochim Biophys Acta，2009,1796(2):91-98.

[7] Niu H,Wu B,Peng Y,etal.RNA interference-mediated knockdown of RhoGDI2 induces the migration and invasion of human lung cancer A549 cells via activating the PI3K/Akt pathway[J].Tumour Biol，2015,36(1):409-419.

[8] Stevens EV,Banet N,Onesto C,etal.RhoGDI2 antagonizes ovarian carcinoma growth,invasion and metastasis[J].Small GTPases，2011,2(4):202-210.

[9] Kim IK,Park SM,Cho HJ,etal.14-3-3σ attenuates RhoGDI2-induced cisplatin resistance through activation of Erk and p38 in gastric cancer cells[J].Oncotarget，2013,4(11):2045-2056.

[10] Said N,Theodorescu D.RhoGDI2 suppresses bladder cancer metastasis via reduction of inflammation in the tumor microenvironment[J].Oncoimmunology，2012,1(7):1175-1177.

[11] Wennerberg K,Der CJ.Rho-family GTPases:it's not only Rac and Rho (and I like it) [J].J Cell Sci，2004,117(Pt 8):1301-1312.

[12] Theodorescu D,Sapinoso LM,Conaway MR,etal.Reduced expression of metastasis suppressor RhoGDI2 is associated with decreased survival for patients with bladder cancer[J].Clin Cancer Res,2004,10:3800-3806.

[13] Gildea J,Seraj MJ,Oxford G,etal.RhoGDI2is an invasion and metastasis suppressor gene in human cancer[J].Cancer Res,2002,62:6418.

[14] Hu LD,Zou HF,Zhan SX,etal.Biphasic expression of RhoGDI2 in the progression of breast cancer and its negative relation with lymph node metastasis[J].Oncol Rep,2007,17:1383-1389.

[15] Zhang Y,Zhang B.D4-GDI,a Rho GTPase regulator,promotes breast cancer cell invasiveness[J].Cancer Res,2006,66:5592.

[16] Abiatari I,DeOliveira T,Kerkadze V,etal.Consensus transcriptome signature of perineural invasion in pancreatic carcinoma[J].Mol Cancer Ther，2009,8(6):1494-1504.

[17] Cho HJ,Baek KE,Park SM,etal.RhoGDI2 expression is associated with tumor growth and malignant progression of gastric cancer[J].Clin Cancer Res，2009,15(8):2612-2619.

[18] Tapper J,Ketunen E,El-Rifai W,etal.Changes in gene expression during progression of ovarian carcinoma[J].Cancer Genet Cytogenet,2001,128:1.

[收稿2016-09-27]

(編輯 張曉舟)

RhoGDI2 expression and clinical significance in colorectal cancer

LIUSi-Qi,MALi-Jun,YANHong-Li,WANGWen-Rui,JINZhen-Jing.

TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To explore the expression and clinical significance of RhoGDI2 in colorectal cancer.Methods: Immunohistochemistry was used to identify RhoGDI2 expression in clinical samples of colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues.The relationships between CRC clinical factors and survival were analyzed.Results: RhoGDI2 expression contributed positively with tumor progression and metastasis in clinical tissues.It was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.Conclusion: RhoGDI2 showed high expression in colorectal cancer and it was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.

RhoGDI2;Colorectal cancer;Metastasis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.022

①本文受吉林省發(fā)展和改革委員會(huì)資助(2013C026-1)。

柳思琪(1988年-)，女，碩士，醫(yī)師，主要從事慢性肝病、重癥肝病的臨床及基礎(chǔ)研究。

及指導(dǎo)教師：金珍婧(1965年-)，女，博士，主任醫(yī)師，主要從事消化道腫瘤、肝硬化的臨床及基礎(chǔ)研究，E-mail:jinyu0429@sina.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)01-0108-04

②上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院，上海200336。

③第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院，上海200433。