陳 潔 陳興強(qiáng) 符薇薇

(三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，三亞572000)

雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠腎系膜細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響

陳 潔 陳興強(qiáng) 符薇薇

(三亞市人民醫(yī)院腎內(nèi)科，三亞572000)

目的：評(píng)價(jià)雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，探討其在糖尿病腎病防治中的意義。方法：體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞株HBZY-1分為：正常對(duì)照組、高糖組、高糖加不同濃度的雷帕霉素組，應(yīng)用CCK-8法觀察細(xì)胞增殖的變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡情況；Real-time PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)水平。結(jié)果：高糖誘導(dǎo)下HBZY-1的增殖水平明顯上升，凋亡水平下降，ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達(dá)水平上升，而雷帕霉素具有明顯抑制作用，且有劑量依賴性，并下調(diào)ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達(dá)；對(duì)于細(xì)胞周期，高糖組的S期細(xì)胞明顯高于正常組(P<0.05)；雷帕霉素干預(yù)后，S期細(xì)胞比例減少(P<0.05)。結(jié)論：雷帕霉素能夠抑制高糖狀態(tài)下HBZY-1的增殖，促進(jìn)其凋亡及導(dǎo)致G1/S期阻滯，同時(shí)下調(diào)ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達(dá)。

雷帕霉素；高糖；腎系膜細(xì)胞；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是1型糖尿病和2型糖尿病最常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要的病因之一[1]。DN的臨床表現(xiàn)為蛋白尿增多和腎臟功能的逐漸下降，直至發(fā)展成為腎衰竭。關(guān)于DN的病因尚未完全明確，目前認(rèn)為是在遺傳背景下多因素共同參與的，如高血糖、高血壓和腎臟的血流動(dòng)力學(xué)異常等因素。長(zhǎng)期的高糖環(huán)境可導(dǎo)致糖化末端產(chǎn)物的聚積、慢性炎癥反應(yīng)和促纖維化細(xì)胞因子如血管緊張素II(AngiotensinⅡ，ANGⅡ)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transfor ming growth factor beta1，TGF-β1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的分泌增多[2]。DN的病理學(xué)表現(xiàn)為腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子大量分泌、細(xì)胞外的基質(zhì)堆積和腎小球的硬化[3]。但是現(xiàn)階段對(duì)DN仍缺乏有效的治療方法，主要從控制發(fā)病因素如控制血糖、控制血壓，對(duì)于發(fā)展到終末期的DN甚至需要腎臟移植。因此針對(duì)DN的發(fā)病機(jī)制，尋求新的積極有效的治療措施迫在眉睫。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K/Akt通路下游的重要效應(yīng)靶蛋白，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[4]。雷帕霉素(Rapamycin)為mTOR的抑制劑，是吸水性鏈霉菌的代謝產(chǎn)物，在1975年首次被發(fā)現(xiàn)。后來(lái)被廣泛用于抑制器官移植的排異反應(yīng)和抗腫瘤治療[5,6]。本文通過(guò)觀察雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期及腎系膜細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的影響，探討雷帕霉素對(duì)治療糖尿病腎病的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠系膜細(xì)胞HBZY-1購(gòu)自酶聯(lián)(上海)生物試劑科技有限公司；不完全Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM)和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega公司；實(shí)驗(yàn)用藥物mTOR抑制劑雷帕霉素為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Real-time PCR試劑(SYBR Green Master Mix)、CCK-8 Cell Counting Kit均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株HBZY-1培養(yǎng) HBZY-1常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，呈貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)條件 37℃，5%CO2。在培養(yǎng)液中加入以下不同的處理因素將細(xì)胞分為4組：正常對(duì)照組(NG)：5.6 mmol/L的葡萄糖；高糖組(HG)：20 mmol/L的葡萄糖；高糖+雷帕霉素組1(HG+R1)：20 mmol/L的葡萄糖和50 nmol/L的雷帕霉素；和高糖+雷帕霉素組2(HG+R2)：20 mmol/L的葡萄糖和100 nmol/L的雷帕霉素。

1.2.2 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將4組不同處理的HBZY-1細(xì)胞以1 000個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)1、2、3、4和5 d后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的步驟檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，用全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀檢測(cè)OD值，波長(zhǎng)為450 nm。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將四組不同處理的HBZY-1細(xì)胞以1×106個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌兩次，1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。分別加入50 μl 以異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和50 μl碘化丙啶(PI)，輕柔混勻，室溫避光染色15 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期 將HBZY-1饑餓24 h后，分別以3×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板中，用上述4種處理方式培養(yǎng)72 h后再用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌2次，75%乙醇固定，PBS再次洗滌，加入1% Triton X-100 1 ml作用10 min，0.01% RNA酶1 ml處理10 min，最后以0.25%碘化丙啶(PI)染色20 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.2.5 Real-time PCR法檢測(cè)mRNA水平 用Trizol收取上述4組不同處理的HBZY-1細(xì)胞，用氯仿抽提法得細(xì)胞RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，應(yīng)用羅氏熒光定量PCR儀Lightcycler 480采用兩步法進(jìn)行定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，使用2-ΔΔCt法對(duì)結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量分析。所用引物見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞增殖的影響 各組5個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測(cè)OD450數(shù)據(jù)列于表2。整體地看，4個(gè)組間，5個(gè)時(shí)點(diǎn)間，以及分組與時(shí)間的交互作用，均有顯著性意義(P<0.05)，兩因素重復(fù)測(cè)量方差分析，提示均存在組間時(shí)點(diǎn)間差異，且各組OD450隨時(shí)間的變化趨勢(shì)不同。進(jìn)行兩兩組間及兩兩時(shí)點(diǎn)間的比較，并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來(lái)看：與正常組比較，高糖組在3 d后細(xì)胞的增殖水平明顯上升(P<0.05)；而當(dāng)在高糖培養(yǎng)的細(xì)胞中同時(shí)應(yīng)用雷帕霉素后，相對(duì)于高糖組細(xì)胞的增殖能力受到抑制，且為劑量依賴性(P<0.05)，說(shuō)明了雷帕霉素可顯著抑制高糖刺激的細(xì)胞的增殖。詳見(jiàn)表2。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

2.2 雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞凋亡水平的影響 各組早期凋亡率及總凋亡率檢測(cè)資料列于表3中。經(jīng)整體比較(單因素方差分析)：早期凋亡率及總凋亡率，4個(gè)組間整體差異均顯著(P<0.05)。再進(jìn)行兩兩組間比較，并結(jié)合主要結(jié)果來(lái)看：高糖處理組細(xì)胞的凋亡水平明顯低于正常組(P<0.05)；而當(dāng)用雷帕霉素處理后高糖組細(xì)胞的凋亡水平相對(duì)于高糖培養(yǎng)的細(xì)胞顯著升高，且為劑量依賴性(P<0.05)，提示了雷帕霉素能夠促進(jìn)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞的凋亡作用。詳見(jiàn)表3。

2.3 雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的細(xì)胞生長(zhǎng)周期資料列于表3中。4個(gè)組整體比較，S-phase(%)數(shù)據(jù)差異有顯著性意義(P<0.05)。再進(jìn)行兩兩組間比較，并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來(lái)看：高糖組細(xì)胞的S期比例明顯高于正常組(P<0.001)，當(dāng)用雷帕霉素干預(yù)后，與單純高糖培養(yǎng)的細(xì)胞比較，干預(yù)組的S期細(xì)胞比例減少，并呈現(xiàn)劑量依賴的關(guān)系(P<0.001)，表明雷帕霉素能夠一定程度促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的阻滯。詳見(jiàn)表4。

2.4 雷帕霉素對(duì)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞因子影響 已知ANGⅡ、TGF-β1和VEGF在DM中是高表達(dá)的，因此我們通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)雷帕霉素對(duì)于細(xì)胞因子的表達(dá)水平的影響。結(jié)果列于表4中。整體比較發(fā)現(xiàn)：3個(gè)細(xì)胞因子，在4個(gè)組間的差異均具有顯著性意義(P<0.05，單因素方差分析)。兩兩比較并結(jié)合主要數(shù)據(jù)來(lái)看：與正常組比較，高糖組能夠明顯促進(jìn)ANGⅡ(P<0.001)、TGF-β1(P<0.01)和VEGF mRNA(P<0.001)的表達(dá)水平。而當(dāng)用雷帕霉素處理后，ANGⅡ、TGF-β1和VEGF mRNA的表達(dá)水平明顯下降(P<0.001)。該結(jié)果提示了雷帕霉素可以抑制高糖誘導(dǎo)的腎系膜細(xì)胞分泌ANGⅡ、TGF-β1和VEGF。詳見(jiàn)表5。

表2 各組OD450數(shù)據(jù)的比較

Tab.2 Comparison of OD450 data in each group

表3 各組凋亡率數(shù)據(jù)的比較

Tab.3 Comparison of apoptosis rate data in each group

表4 各組S-phase數(shù)據(jù)的比較

Tab.4 Comparison of S-phase data in each group

GroupS?phase(%)NG6189±27HG6348±60HG+R16192±24HG+R26175±27HolisticanalysisF，P28547，0000HGvsNGLSD?t，P7344，0000HG+R1vsNGLSD?t，P0134，0894HG+R2vsNGLSD?t，P0671，0510HG+R1vsHGLSD?t，P7210，0000HG+R2vsHGLSD?t，P8015，0000HG+R2vsHG+R1LSD?t，P0805，0430

表5 3種細(xì)胞因子表達(dá)資料及組間比較

Tab.5 Expression data of three cytokines and comparison between groups

GroupANGⅡTGF?β1VEGFNG6100±019100±025100±022HG6222±045196±039216±030HG+R16082±036082±037091±030HG+R26065±011071±010067±019HolisticanalysisF，P32377，000021298，000040471，0000HGvsNGLSD?t，P6887，00005489，00007879，0000HG+R1vsNGLSD?t，P1017，03211027，03170572，0574HG+R2vsNGLSD?t，P7903，00006515，00008451，0000HG+R1vsHGLSD?t，P1974，00621655，01142197，0040HG+R2vsHGLSD?t，P8861，00007143，000010076，0000HG+R2vsHC+R1LSD?t，P0958，03500628，05371625，0120

3 討論

近三分之一的糖尿病病人患有糖尿病腎病，流行病學(xué)調(diào)查顯示全球約有3.5億人患有糖尿病，而其中約1億患者患有糖尿病腎病，而30%的患者將會(huì)進(jìn)展為腎衰竭[9]。糖尿病腎病主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白在腎小球細(xì)胞間隙累積，腎小球擴(kuò)張，基底膜增厚，腎小管間質(zhì)纖維化，是終末期腎衰竭的主要原因[10,11]。關(guān)于糖尿病腎病具體的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但是高血糖被認(rèn)為是促進(jìn)腎臟病變的動(dòng)力因素。持續(xù)的高血糖能夠促進(jìn)很多與糖尿病腎病發(fā)病相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)如ANGⅡ，TGF-β1和VEGF等[12-14]，其中ANGⅡ能夠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎小球的高過(guò)濾，內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，血栓形成和炎癥等過(guò)程；而高表達(dá)的TGF-β1可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的累積，凋亡和近端小管的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，并且研究發(fā)現(xiàn)低表達(dá)的TGF-β1可以改善糖尿病腎病，減少腎小球?yàn)V過(guò)率。細(xì)胞因子VEGF多次被報(bào)道參與內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成、遷移和增殖等過(guò)程，在糖尿病腎病的發(fā)病過(guò)程中，VEGF可以增加血管的滲透性[12,15]。此外，高表達(dá)的VEGF可以改變胞外的傳導(dǎo)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，刺激腎臟發(fā)生肥大。因此，目前迫切需要針對(duì)高糖因素在糖尿病腎病發(fā)生過(guò)程中的作用，尋找有效的治療糖尿病腎病的方法。

雷帕霉素為mTOR的抑制劑，研究顯示，PI3K/Akt可磷酸化mTOR具有負(fù)性調(diào)控作用的結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2(Tuberous sclerosis complex 1/2，TSC1/2)，TSC1/2的磷酸化失活促使mTOR激活。活化的mTOR又可磷酸化激活核糖體蛋白激酶p70S6K，從而促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。與此同時(shí)，p70S6K又可以促使HIF1-α與HIF1-β形成異源二聚體，進(jìn)入細(xì)胞核，招募p300/CBP，啟動(dòng)VEGF的合成，促進(jìn)VEGF生成增多[4,16]。因此雷帕霉素可抑制上述過(guò)程，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖，抑制VEGF的合成。

本研究中發(fā)現(xiàn)高糖培養(yǎng)條件能夠明顯促進(jìn)大鼠腎系膜細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)展，抑制細(xì)胞的凋亡過(guò)程，與先前的文獻(xiàn)報(bào)道一致，驗(yàn)證了高糖環(huán)境在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中的作用。而雷帕霉素能明顯抑制高糖對(duì)腎系膜細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響，說(shuō)明雷帕霉素能夠有效的抑制高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞的增生，甚至肥大的發(fā)生，該過(guò)程有助于預(yù)防或改善糖尿病腎病的進(jìn)展[17]。此外，雷帕霉素還能夠明顯下調(diào)高糖刺激的ANGⅡ，TGF-β1和VEGF細(xì)胞因子的表達(dá)，如上文所述，這三個(gè)細(xì)胞因子在糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的增殖和凋亡過(guò)程中發(fā)揮了極其重要的作用。而雷帕霉素很明顯的下調(diào)了ANGⅡ，TGF-β1和VEGF的表達(dá)，這提示了雷帕霉素有可能是通過(guò)下調(diào)了高糖刺激的各種細(xì)胞因子的表達(dá)抑制腎系膜細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腎系膜細(xì)胞的凋亡過(guò)程，從而阻止高糖環(huán)境對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的持續(xù)刺激。

本文總結(jié)，雷帕霉素可以明顯逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)腎系膜細(xì)胞的影響，減緩高糖在糖尿病腎病發(fā)病過(guò)程中的作用，因此可以作為糖尿病腎病的一種治療方法。

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[收稿2016-06-20 修回2016-07-15]

(編輯 許四平)

Effect of rapamycin on proliferation，apoptosis and cell cycles of high glucose-cultured rat glomerular mesangial cell

CHENJie,CHENXing-Qiang,FUWei-Wei.

DepartmentofNephrology,SanyaPeople′sHospital,Sanya572000，China

Objective:To evaluate the effects of rapamycin on the proliferation,apoptosis and cell cycle of glomerular mesangial cells induced by high glucose,and to explore its significance in the prevention and treatment of diabetic nephropathy.Methods: The rat GMC HBZY-1 was divided into four groups:control group,high glucose group,the first group of high glucose plus rapamycin,the second group of high glucose plus rapamycin.CCK-8 assay was used to detect the proliferation of cells,flow cytometry was introduced to evaluate the apoptosis and cell cycle of HBZY-1,Real-time PCR was used to detect the mRNA of AngiotensinⅡ(ANGⅡ),transfor ming growth factor beta1(TGF-β1) and vascular endothelial growth factor (VEGF).Results: The proliferation level of HBZY-1 induced by high glucose was significantly increased,and the level of apoptosis decreased,and the expression level of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF was increased.Rapamycin significantly inhibited,and there was a dose dependent,and down regulated the expression of ANGⅡ,TGF-β1,and VEGF.For the cell cycle,the S phase cells in the high glucose group were significantly higher than those in the normal group (P<0.05),and the S phase cell proportion was decreased after rapamycin intervention (P<0.05).Conclusion: Rapamycin can inhibit the proliferation of HBZY-1 in high glucose,promote its apoptosis and lead to G1/S arrest,and down regulate the expression of ANGⅡ,TGF-β1 and VEGF.

Rapamycin;High glucose;Glomerular mesangial cell;Proliferation;Apoptosis;Cell cycle

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.009

陳 潔(1984年-)，男，主治醫(yī)師，主要從事腎內(nèi)科方面的研究，E-mail：ujmesz389@sina.com。

R587.2

A

1000-484X(2017)01-0047-05