李姍姍 秦 歡 劉芊伊 徐 林 張繼東 馮繼紅 李龍梅 泮紅飛 羅軍敏

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州省免疫分子應(yīng)用研究工程中心，遵義563099)

TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬細胞過程中表達及作用的初步探討①

李姍姍 秦 歡 劉芊伊 徐 林 張繼東 馮繼紅 李龍梅 泮紅飛 羅軍敏

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室，貴州省免疫分子應(yīng)用研究工程中心，遵義563099)

目的：在體外細胞水平，初步探討TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠骨髓來源巨噬細胞的表達及作用。方法：從BALB/c小鼠的脛腓骨中取骨髓細胞，與GM-CSF共培養(yǎng)獲得骨髓來源的M0型巨噬細胞，流式檢測F4/80和CD11b的表達并觀察其形態(tài)；100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激M0巨噬細胞，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h，Real-time PCR檢測不同時間點TLR2/4的表達水平；利用RNAi干擾技術(shù)沉默巨噬細胞表面的TLR2/4受體，MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0巨噬細胞，分別培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h，Real-time PCR檢測不同時間點TLR2/4及Ym-1、Fizz1、IL-10 、TNF-α、iNOS、TGF-β細胞因子的表達水平。結(jié)果：M0型巨噬細胞在MTB Hsp16.3刺激后出現(xiàn)了較短的偽足，沉默TLR2/4 的M0型巨噬細胞在MTB Hsp16.3刺激后出現(xiàn)了較長偽足；M0巨噬細胞在MTB Hsp16.3刺激后高表達TLR2/4。MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4 的M0型巨噬細胞，高表達M1型巨噬細胞相關(guān)的細胞因子IL-6、TNF-α、iNOS，低表達M2型巨噬細胞相關(guān)的細胞因子IL-10、TGF-β、Ym-1、Fizz1。結(jié)論：MTB Hsp16.3 通過TLR2/4促進M0型巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，抑制M1型巨噬細胞，這可能參與了MTB躲避巨噬細胞的吞噬過程。

結(jié)核分枝桿菌；Toll樣受體；MTB Hsp16.3；替代性活化巨噬細胞

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的慢性傳染性疾病。MTB是典型的胞內(nèi)菌，主要寄居于巨噬細胞內(nèi)與宿主免疫系統(tǒng)相互斗爭[1]。當機體感染MTB后，巨噬細胞可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，抑制或殺滅MTB[2]。同時MTB可以通過多種機制來逃逸巨噬細胞的殺傷，如抑制巨噬細胞的凋亡，逃避巨噬細胞的吞噬及避免反應(yīng)氧和反應(yīng)氮產(chǎn)物的毒性等[3]。在多種機制的研究中，MTB逃避巨噬細胞的吞噬受到了較為廣泛的關(guān)注。Lopes等[4]研究發(fā)現(xiàn)，Dnak蛋白可以誘導巨噬細胞向低吞噬功能的M2型轉(zhuǎn)化，使得MTB可以逃避巨噬細胞的吞噬。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，MTB Hsp16.3可以刺激巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化[5]，然而其機制是尚不清楚，為此探討MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化的機制將有助于后續(xù)研究MTB逃避巨噬細胞吞噬的機制。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是介導天然免疫和獲得性免疫的主要受體[6]，可以通過MTB的一些成分介導細胞活化，啟動天然免疫系統(tǒng)的吞噬和殺菌的效應(yīng)機制。在TLR家族中,TLR2/4是巨噬細胞識別和殺傷結(jié)核分枝桿菌的重要受體[7]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實驗擬觀察巨噬細胞在MTB Hsp16.3誘導后TLR2/4的動態(tài)變化水平，觀察MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的M0型巨噬細胞相關(guān)細胞因子的動態(tài)表達情況，從TLR2/4信號通路探討MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化的作用機制，為深入探討MTB逃避巨噬細胞的吞噬作用的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 MTB Hsp16.3蛋白由本實驗室制備保存。BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心；PrimeScript RT reagent Kit Perfect Real-time、SYBR Premix Ex Taq 、Lipofectamine 2000購自TaKaRa公司；Real-time PCR引物合成由Invitrogen公司完成；siRNA有廣州銳博公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 收集和鑒定小鼠骨髓來源的巨噬細胞 將6～8周雌性BALB/c小鼠脫臼處死，無菌取小鼠脛骨和股骨骨髓細胞，經(jīng)紅細胞裂解液裂解，10% FBS的DMEM培養(yǎng)液洗滌后，1 000 r/min，10 min離心后加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106ml-1，培養(yǎng)第7天后去除非貼壁細胞，再用10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)；第8天收集貼壁細胞即為骨髓來源巨噬細胞，并在光鏡下觀察巨噬細胞的形態(tài)，收集細胞。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 由廣州銳博公司設(shè)計合成3對siRNA序列。待骨髓來源的巨噬細胞比率達到或大于80%，可進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。每孔加入2 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，1 μl Lipofectamine 2000 與 20 pmol siRNA轉(zhuǎn)染混合物，37℃、5%CO2條件下轉(zhuǎn)染48 h，設(shè)為轉(zhuǎn)染組。

1.2.3 MTB Hsp16.3蛋白刺激巨噬細胞 100 ng/ml MTB Hsp16.3[7]分別刺激M0巨噬細胞和轉(zhuǎn)染組的巨噬細胞，每組3個復(fù)孔，并設(shè)空白對照組。置于5%CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、12、24、36、48、72 h，培養(yǎng)后分別收集細胞及上清。

1.2.4 細胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄 取上述3組培養(yǎng)后的細胞，TRIzol法抽提總RNA(按試劑盒說明書進行)，采用紫外分光光度儀測定所提RNA的濃度和純度。以總RNA為模板，Oligo(dt)為引物，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA進行后續(xù)檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測相關(guān)因子mRNA的相對表達量 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行qRT-PCR(按照SYBR Green qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行)，反應(yīng)體系：ddH2O 8 μl，SYBR 10 μl，cDNA 1 μl，上、下游引物(見表1)各0.5 μl，總體積20 μl。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃ 30 s，45個循環(huán)。Real-time PCR實驗數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需PCR的循環(huán)數(shù))分析樣本TLR2、TLR4、Ym-1、Fizz1、IL-10、TGF-β、iNOS、IL-6、TNF-α mRNA的相對表達量。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequence

GeneUpstream(5′?3′)Downstream(5′?3′)GAPDHGAGCCAAACGGGTCATCATCTGAGGGGCCATCCACAGTCTTTLR2TGGTGTCTGGAGTCTGCTGTGCGCTCCGTACGAAGTTCTCAGTLR4CCTGACACCAGGAAGCTTGAACTTCAAGGGGTTGAAGCTCAGYm?1GCAGAAGCTCTCCAGAAGCAATCCTGATTGGCCTGTCCTTAGCCCAACTGFizz1GCTGATGGTCCCAGTGAATACCCAGTAGCAGTCATCCCAGCIL?10TACAGCCGGGAAGACAATAAAGGAGTCGGTTAGCAGTATGTGF?βGGCGGTGCTCGCTTTGTATCCCGAATGTCTGACGTATTGAiNOSCTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTGGGAGTAGCCTGTGTGCACCTGGAAIL?6GAGGATACCACTCCCAACAGACCAAGTGCATCATCGTTGTTCATACATNF?αCAGGGGCCACCACGCTCTTCTTTGTGAGTGTGAGGGTCTGG

1.2.6 ELISA檢測轉(zhuǎn)染后巨噬細胞相關(guān)細胞因子表達水平 取上述培養(yǎng)后收集好的細胞培養(yǎng)上清，用ELISA檢測TNF-α、IL-10、TGF-β細胞因子的分泌。按照試劑盒說明加樣，置于37℃溫育60 min，加洗滌液洗板5次，加顯色劑A、B，37℃避光顯色5～15 min后加入終止液，終止反應(yīng)。450nm波長檢測吸光度(OD)值并測各細胞因子濃度。

2 結(jié)果

2.1 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后TLR2/4的變化

2.1.1 巨噬細胞的形態(tài) 光鏡下觀察M0型巨噬細胞呈圓形(圖1A)，MTB Hsp16.3刺激后巨噬細胞出現(xiàn)了較短的偽足(圖1B)，MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞出現(xiàn)了較長的偽足(圖1C)。

2.1.2 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后TLR2/4 mRNA表達水平 在體外培養(yǎng)條件下，100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬細胞，取貼壁細胞進行Real-time PCR，檢測不同時間點TLR2/4 mRNA的相對表達水平。所有擴增曲線均無非特異性熒光，溶解曲線呈單峰，產(chǎn)物特異性好。結(jié)果顯示，MTB Hsp16.3刺激后的巨噬細胞TLR2/4 mRNA (圖2) 的相對表達量較對照組顯著增加(P<0.05)。

2.2 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞后的變化

2.2.1 TLR2/4 siRNA的沉默效率 轉(zhuǎn)染24 h后，取各組貼壁細胞進行Real-time PCR，檢測TLR2/4 mRNA表達水平，結(jié)果顯示：與陰性對照組比較，siRNA各組的TLR2/4 mRNA表達水平均明顯降低(圖3)，在后續(xù)的實驗中分別用了TLR2的siRNA-3，TLR4的siRNA-1序列進行實驗。

圖1 電鏡下巨噬細胞形態(tài)(×20)Fig.1 Morphology of macrophages by light microsco-pe(×20)Note: A.M0 macrophages；B.Macrophages after MTB Hsp16.3 stimulated;C.si-TLR2/4 macrophages effected with MTB Hsp16.3.

2.2.2 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞后相關(guān)細胞因子mRNA表達水平 在體外培養(yǎng)條件下，100 ng/ml MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4后的巨噬細胞，分別刺激0、12、24、36、48、72 h后取貼壁細胞進行Real-time PCR，檢測不同時間點細胞因子mRNA的相對表達水平。所有擴增曲線均無非特異性熒光，溶解曲線呈單峰，產(chǎn)物特異性好。結(jié)果顯示：MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2的巨噬細胞后Ym-1、Fizz和IL-10 mRNA(圖4A)的相對表達量較MTB Hsp16.3刺激組顯著下降(P<0.05)，iNOS、IL-6和TNF-α mRNA的相對表達量較MTB Hsp16.3 刺激組顯著上調(diào)(P<0.05)； MTB Hsp16.3刺激沉默TLR4的巨噬細胞后Fizz1、TGF-β和IL-10 mRNA(圖4B)的相對表達量較MTB Hsp16.3刺激組顯著下降(P<0.05)，iNOS、IL-6和TNF-α mRNA的相對表達量較MTB Hsp16.3刺激組顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖2 MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞后TLR2/4 mRNA表達水平Fig.2 Expression level of TLR2/4 mRNA after MTB Hsp16.3 stimulated macrophagesNote: A.TLR2；B.TLR4；*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖3 TLR2/4 siRNA的沉默效率Fig.3 Silencing efficiency of TLR2/4 siRNANote: A.TLR2；B.TLR4；**.P<0.01；***.P<0.001.

圖4 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞相關(guān)細胞因子的表達水平Fig.4 Expression levels of cytokine mRNA in TLR2/4 silencing macrophages after MTB Hsp16.3 stimulatedNote: A.TLR2;B.TLR4;*.P<0.05;**.P<0.01.

圖5 MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞各細胞因子的分泌水平Fig.5 Secretion levels of cytokine mRNA in siRNA silencing macrophages after MTB Hsp16.3 stimulatedNote: **.P<0.01.

2.2.3 細胞培養(yǎng)上清進行ELISA檢測 結(jié)果顯示：MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞，TGF-β和IL-10水平顯著降低(P<0.05)，TNF-α水平明顯增加(P<0.05，圖5)，上述各細胞因子ELISA結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致。

3 討論

MTB入侵宿主后主要在巨噬細胞內(nèi)寄居，一方面巨噬細胞可以抑制或殺滅MTB，另一方面MTB可以通過逃避巨噬細胞的吞噬，抑制巨噬細胞的凋亡等機制躲避巨噬細胞的殺傷。研究發(fā)現(xiàn)，MTB在逃避巨噬細胞吞噬的過程中，可以抑制吞噬小體與溶酶體融合，抑制吞噬小體的酸化以及誘導巨噬細胞轉(zhuǎn)化為低吞噬功能的M2型巨噬細胞等[8]。其中，誘導巨噬細胞轉(zhuǎn)化為低吞噬功能的M2型巨噬細胞受到了關(guān)注。本實驗室前期發(fā)現(xiàn)了MTB Hsp16.3與巨噬細胞有著一定的聯(lián)系[9]。MTB Hsp16.3是由hspX 基因編碼的，存在于MTB膜上的主要抗原蛋白，在MTB休眠階段大量表達[10]。研究發(fā)現(xiàn)MTB Hsp16.3可以抑制巨噬細胞自噬體的形成[11]，抑制小鼠肺泡巨噬細胞的凋亡[12]，從而使得MTB在巨噬細胞內(nèi)存活。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，MTB Hsp16.3可以刺激巨噬細胞向低吞噬的M2型轉(zhuǎn)化，為深入探討MTB逃避巨噬細胞的吞噬作用的機制奠定基礎(chǔ)。

Toll樣受體是一種重要的模式識別受體，是宿主天然免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵成分。MTB的某些成分可以介導細胞活化，啟動天然免疫系統(tǒng)的吞噬和殺菌的效應(yīng)機制。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠慢性結(jié)核病的模型中，TLR4低表達的小鼠可轉(zhuǎn)變?yōu)槁苑窝?，且肝、脾、腎等器官可見MTB的擴散[13]；Lacavé等[14]發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白可以通過TLR5誘導巨噬細胞向M2型極化。提示Toll受體與MTB、M2型巨噬細胞有著一定的關(guān)系。為此，本研究將從TLR2/4信號通路探討MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化的作用機制。

實驗結(jié)果顯示：MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬細胞后，鏡下觀察巨噬細胞出現(xiàn)了較短的偽足，整體形態(tài)較為收攏，而沉默TLR2/4后巨噬細胞出現(xiàn)了較長的偽足；Real-time PCR檢測MTB Hsp16.3刺激M0型巨噬細胞后TLR2/4表達情況，顯示刺激后巨噬細胞高表達TLR2/4；Real-time PCR檢測沉默TLR2/4的巨噬細胞在MTB Hsp16.3刺激后，相關(guān)細胞因子的表達情況，顯示沉默TLR2后，M0型巨噬細胞高表達iNOS、IL-6和TNF-α，低表達M2相關(guān)細胞因子Ym-1、Fizz1和IL-10；沉默TLR4后，iNOS、IL-6和TNF-α表達水平顯著上調(diào)Fizz1、TGF-β和IL-10的表達水平顯著下降。ELISA結(jié)果與real time PCR結(jié)果一致。

上述研究發(fā)現(xiàn)，在MTB Hsp16.3刺激沉默TLR2/4的巨噬細胞后，M2型巨噬細胞相關(guān)細胞因子呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，提示在MTB Hsp16.3刺激巨噬細胞向M2轉(zhuǎn)化的過程中，TLR2/4起到一定的作用。為此我們猜測MTB Hsp16.3可能通過與巨噬細胞膜上TLR2/4結(jié)合，激活相關(guān)的信號通路，從而使得巨噬細胞向M2型轉(zhuǎn)化，分泌相關(guān)的細胞因子。本實驗僅在體外細胞水平初步探討了TLR2/4在MTB Hsp16.3刺激小鼠巨噬細胞過程中表達及作用，然而具體的信號途徑及在體內(nèi)感染MTB模型中，MTB Hsp16.3誘導巨噬細胞向M2轉(zhuǎn)化的過程是通過MTB Hsp16.3直接釋放到胞外或者其他方式與巨噬細胞的TLR2/4結(jié)合都需要進行后續(xù)的深入探討。本研究將有助于闡明MTB逃避巨噬細胞的吞噬作用的機制，為結(jié)核病免疫防治提供合適的候選分子靶點。

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[收稿2016-06-06 修回2016-08-22]

(編輯 倪 鵬)

Study of expression and regulation of TLR2/4 in mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3 effect on mouse bone marrow-derived macrophages

LIShan-Shan，QINHuan，LIUQian-Yi，XULin，ZHANGJi-Dong，F(xiàn)ENGJi-Hong，LILong-Mei，PANHong-Fei，LUOJun-Min.

DepartmentofImmunology，ZunyiMedicalCollege，ImmuneMoleculesApplicationResearchCenterinGuizhouProvince，Zunyi563099，China

Objective:To study the expression and regulation of TLR2/4 in mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3 (mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3,MTB Hsp16.3) effect on mouse bone marrow-derived macrophages in vitro.Methods: Bone marrow cells were isolated from tibia and femurs of BALB/c mice and incubated with GM-CSF，then detected the expression of CD11b and F4/80 with flow cytometry and observed morphology.The M0 macrophages were stimulated with MTB Hsp16.3 for 0 h,12 h,24 h,36 h,48 h and 72 h.Real-time PCR detected the expression of TLR2/4 in intracellular at different time point.Silencing macrophages cell surface TLR2/4 molecules by siRNA technology which stimulated with MTB Hsp16.3 for 0 h,12 h,24 h,36 h,48 h and 72 h.Real-time PCR detected the expression of TLR2/4,Ym-1,Fizz1,IL-10,TNF-α,iNOS and TGF-β in intracellular at different time point.Results: Morphology analysis showed that MTB Hsp16.3 stimulated macrophages were round cells stretching out pseudopodia,whereas MTB Hsp16.3 stimulated silencing TLR2/4 macrophages had elongated fibroblastoid.Real time PCR detected the expression of TLR2/4 were upregulated after MTB Hsp16.3 stimulated M0 macrophages.MTB Hsp16.3 stimulated silencing TLR2/4 macrophages the expression of IL-6,TNF-α,iNOS were upregulated,whereas IL-10,TGF-β,Ym-1 and Fizz1 were downregulated.Conclusion: MTB Hsp16.3 may stimulated M0 macrophages to M2 macrophages and suppress M1 macrophages through binding with TLR2/4 receptor,which may be involved the progresss of MTB evaded macrophage phagocytosis.

Mycobacterium tuberculosis;Toll like receptors;Mycobacterium tuberculosis heat shock proteins 16.3;Alternatively activated macrophage

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.007

①本文受國家自然科學基金地區(qū)項目(81460249)資助。

李姍姍(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事感染免疫學方面的研究，E-mail:lss2958@126.com。

及指導教師：羅軍敏(1970年-)，女，碩士，教授，碩士生導師，主要從事感染免疫學方面的研究，E-mail: luojm128@163.com。

R392.11

A

1000-484X(2017)01-0036-05