沈剛，蘇作鵬，全勇，徐福林，徐鋒

·論著·

重編程人成纖維細胞為誘導型類小腦顆粒樣細胞的體外實驗研究

沈剛，蘇作鵬，全勇，徐福林，徐鋒

目的 在體外直接誘導重編程獲取患者成纖維細胞來源的誘導型類小腦顆粒樣細胞(hiCGCs)，并研究這些細胞的生物學特征。方法 篩選與小腦神經(jīng)細胞發(fā)育、分化相關(guān)的誘導因子；構(gòu)建攜帶有轉(zhuǎn)錄因子的表達載體；以標準皮膚細胞培養(yǎng)流程培養(yǎng)出人頭皮成纖維細胞，使用慢病毒載體介導Ascl1、Sox2和OCT4三個轉(zhuǎn)錄因子在胞內(nèi)表達，并在培養(yǎng)過程中加入神經(jīng)營養(yǎng)因子：BMP4，F(xiàn)GF8b和Wnt3a；誘導獲得具有小腦顆粒神經(jīng)元特征的hiCGCs。結(jié)果 經(jīng)細胞免疫組織化學和電生理檢測，證實該hiCGCs具有類似正常小腦顆粒神經(jīng)元的生物學和生理學特征。使用Ascl1、Sox2和OCT4三個轉(zhuǎn)錄因子及BMP4、FGF8b和Wnt3a三種營養(yǎng)因子可將成人成纖維細胞直接轉(zhuǎn)變成為具有小腦顆粒神經(jīng)元特征的hiCGCs。結(jié)論 HiCGCs在形態(tài)上與小腦顆粒神經(jīng)元非常相似，能夠表達小腦顆粒神經(jīng)元的特異性蛋白，并具有類似正常小腦顆粒神經(jīng)元的電生理特性。

人誘導型類小腦顆粒樣神經(jīng)細胞；再生醫(yī)學；譜系重編程

小腦是腦組織中相對獨立和特殊的區(qū)域，在運動控制和認知功能領域發(fā)揮著重要的作用。顆粒細胞是谷氨酸能的興奮性神經(jīng)元，也是小腦數(shù)量最多的神經(jīng)元[1-2]。臨床上常見的小腦疾病包括小腦萎縮和小腦發(fā)育不良[3-6]，該類疾病目前無有效的治療方法。通過外源性細胞、組織移植的方式可以促進神經(jīng)組織及其功能修復，并重建神經(jīng)信號網(wǎng)絡，有望成為攻克該類疾病的重要途徑[7]。但小腦特異性功能神經(jīng)細胞的來源途徑有限，采用細胞譜系重編程技術(shù)將人頭皮成纖維細胞直接轉(zhuǎn)化為小腦特異性的神經(jīng)細胞，可以提供大量、穩(wěn)定的小腦特異性細胞，解決移植細胞來源局限的問題。在此基礎上，本研究采用神經(jīng)外科手術(shù)患者的成纖維細胞(頭皮組織來源)，使用慢病毒載體介導Ascl1、Sox2和OCT4三個因子在細胞內(nèi)表達，并在培養(yǎng)過程中加入體外誘導胚胎干細胞向小腦神經(jīng)元分化的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子——BMP4、FGF8b和Wnt3a，誘導獲得了具有小腦顆粒神經(jīng)元特征的人誘導型小腦顆粒樣神經(jīng)細胞(hiCGCs)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本 收集神經(jīng)外科手術(shù)患者的健康頭皮標本。在知情同意的前提下，所有標本均在手術(shù)切除后立刻剪碎并用于培養(yǎng)原代的成纖維細胞。

1.2 成纖維細胞培養(yǎng)及病毒感染 (1)收集接受外科手術(shù)患者術(shù)中脫落的頭皮組織，在70%乙醇中浸泡消毒5 min，PBS清洗2遍；用無菌小剪刀剪成1 mm3的碎片，加入含雙抗的PBS清洗2遍；加入膠原酶Ⅳ(1 mg/ml)，離心5 min后棄上清。向沉淀物中加入適量0.25%胰蛋白酶。收集離心的細胞懸液2～3次，在成纖維細胞培養(yǎng)液內(nèi)重懸細胞，調(diào)整至一定細胞密度后接種到培養(yǎng)瓶。用第5代細胞進行誘導重編程。將慢病毒加入到靶細胞，測定病毒滴度后，用足量含病毒的培養(yǎng)液感染靶細胞。第二輪病毒感染后，用N3培養(yǎng)液進一步誘導培養(yǎng)。

1.3 體細胞重編程為hiCGCs 每天給細胞進行換液直到顆粒樣神經(jīng)元樣細胞(granular-like cells)出現(xiàn)。經(jīng)過大約1周的慢病毒感染能看到顆粒神經(jīng)元樣細胞，14 d左右能進行細胞克隆挑選并換用N2培養(yǎng)液。穩(wěn)定傳代生長3～5代。其中，根據(jù)形態(tài)特征剔除掉非神經(jīng)元樣細胞，同時也將處于轉(zhuǎn)染體系中轉(zhuǎn)變的神經(jīng)元樣細胞挑取補充進培養(yǎng)體系中。

1.4 鑒定hiCGCs的生物學特征 將成纖維細胞接種至6孔板，使用前述因子表達來誘導hiCGCs的產(chǎn)生，觀察在誘導細胞中GFP陽性并具有典型神經(jīng)元細胞形態(tài)：在三維成像的層面上有一條≥3倍胞體長度的細長突觸的完整細胞。用細胞計數(shù)器計數(shù)Tuj1+/GFP+并具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細胞數(shù)，計算病毒轉(zhuǎn)染后不同時間點的hiCGCs細胞誘導效率，同時計數(shù)Tuj1+/Ath1+雙陽性的細胞數(shù)；誘導效率=hiCGCs細胞數(shù)/接種的成纖維細胞數(shù)。使用蛋白免疫印跡(Western blot)、RT-PCR分析小腦顆粒樣細胞相關(guān)蛋白及RNA的表達水平。膜片鉗技術(shù)檢測hiCGCs的電生理特性，記錄興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents,EPSCs)。EPSCs在電壓鉗模式下記錄，給予刺激，電壓鉗制在-80 mV和+40 mV。所采集的數(shù)據(jù)經(jīng)數(shù)模轉(zhuǎn)換器及pClamp 9.2軟件處理。

2 結(jié) 果

2.1 人頭皮成纖維細胞的原代培養(yǎng)及鑒定 采用組織塊培養(yǎng)法進行人頭皮成纖維細胞培養(yǎng)。接種后約2～3d，在倒置顯微鏡下可觀察到組織塊周圍有細胞爬出，呈輻射狀生長，表現(xiàn)出典型的成纖維細胞樣。在原代培養(yǎng)初期，細胞增殖較慢，傳3～5代之后，細胞增殖速度加快。波形蛋白(viementin)和膠原蛋白(collagen)是在成纖維細胞中最經(jīng)常被檢測到的蛋白，是可靠的成纖維細胞標志。在原代培養(yǎng)的人頭皮成纖維細胞上廣泛檢測到viementin和collagen的表達(圖1)，證明用于重編程的頭皮細胞主要是成纖維細胞。

為排除起始細胞群可能有來自于本身就具有一定多向分化潛能的神經(jīng)嵴及其衍生物。分別使用神經(jīng)干/祖細胞標志Nestin、小腦顆粒神經(jīng)元標志Ath1、神經(jīng)上皮標志Pax6、Sox10和多能干細胞標志Nanog等來鑒定人成纖維細胞。經(jīng)過免疫化學實驗檢測，起始細胞并不表達神經(jīng)干/祖細胞、小腦顆粒神經(jīng)元等的標志蛋白。

圖1 人頭皮成纖維細胞viementin和collagen蛋白的表達(scale bar=400 μm)

2.2 體細胞重編程產(chǎn)生誘導型顆粒神經(jīng)元樣細胞

顯微鏡下觀察，在病毒感染后7 d出現(xiàn)部分神經(jīng)元樣細胞，形態(tài)主要為：胞體變小，有單級或雙極突觸出現(xiàn)。其后繼續(xù)變化，14 d左右形成肉眼可見的較典型神經(jīng)元樣細胞，形態(tài)更為復雜，有明顯的突觸延伸出胞體。到第21 d，部分培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出典型神經(jīng)元的細胞形態(tài)，呈三角形或橢圓形，胞體變小、折光性強，邊界清楚，向外延伸出一根或多根軸突樣突起。進一步培養(yǎng)28 d后，部分細胞表現(xiàn)出更為成熟的神經(jīng)元的細胞形態(tài)，部分細胞突觸出現(xiàn)典型的小腦顆粒神經(jīng)元樣的T形分叉。經(jīng)過穩(wěn)定傳代篩選培養(yǎng)，hiCGCs在形態(tài)上與小腦顆粒神經(jīng)元非常相似。

2.3 hiCGCs誘導效率分析 Tuj1抗體已經(jīng)被廣泛證實僅識別神經(jīng)細胞的neuronal class Ⅲβ-tubulin，是比較公認的神經(jīng)元標志。小腦顆粒神經(jīng)元缺乏特異性標識，需要結(jié)合多種標志物進行鑒定。Ath1是小腦顆粒神經(jīng)元產(chǎn)生所必需的物質(zhì)，是第一個在活體內(nèi)獲得的能夠產(chǎn)生顆粒細胞的基因，其表達提示小腦顆粒神經(jīng)元的可能。通過計數(shù)：(1)具有典型神經(jīng)元的細胞形態(tài)；(2)表達Tuj1+/GFP+雙陽性的細胞，來計算誘導為神經(jīng)細胞的效率。同時計算轉(zhuǎn)分化為Tuj1+/Ath1+神經(jīng)元的效率。結(jié)果顯示，隨著轉(zhuǎn)染后時間的增加，Tuj1+/GFP+雙陽性細胞出現(xiàn)的比例逐漸增高；到轉(zhuǎn)染后的第21d后，Tuj1+/GFP+細胞的數(shù)量陡然增多(P<0.01)，見圖2。

圖2 體細胞重編程產(chǎn)生Tuj1+/GFP+的誘導效率

病毒轉(zhuǎn)染后第28 d，Tuj1+/GFP+雙陽性細胞占被轉(zhuǎn)染細胞總數(shù)的比例，使用Ascl1、Sox2和OCT4 3個外源基因誘導為神經(jīng)元的效率可達(11.90±0.85)%；Tuj1+/Ath1+雙陽性細胞的數(shù)量呈現(xiàn)同樣的趨勢，在加入BMP4、FGF8b和Wnt3a因子的情況下，最高可達(5.35±0.80)%；而在沒有添加3種因子的情況下，只有(2.20±0.42)%(圖3)。不同誘導方案的誘導效率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖3 不同誘導方案產(chǎn)生hiCGCs的效率

2.4 誘導產(chǎn)生hiCGCs的對照實驗 作為對照，將人頭皮成纖維細胞置于不含外源轉(zhuǎn)錄因子的N3培養(yǎng)體系中，只在培養(yǎng)液及BMP4、FGF8b、Wnt3a營養(yǎng)因子的作用下，結(jié)果顯示有部分細胞在形態(tài)上表現(xiàn)出了向神經(jīng)元樣細胞轉(zhuǎn)變的趨勢，但形態(tài)不典型；且這部分形態(tài)變化的細胞不表達神經(jīng)元特異蛋白Tuj1及Ath1。這表明，在沒有外源誘導因子存在的情況下，成纖維細胞不能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元或小腦顆粒樣細胞。同時，將只介導表達GFP的慢病毒載體導入成纖維細胞內(nèi)，結(jié)果顯示被病毒感染的細胞表達綠色熒光，但形態(tài)上并沒有發(fā)生變化，也不表達Tuj1；表明僅靠GFP蛋白不能誘導重編程。

2.5 hiCGCs表達小腦顆粒神經(jīng)元特異性蛋白 除了使用Tuj1檢測誘導神經(jīng)元的產(chǎn)生，還使用免疫細胞化學的方法來檢測MAP2和突觸素蛋白(synapsin)等神經(jīng)元標識(圖4、5)，以進一步確認所獲得的重編程細胞是神經(jīng)元。小腦顆粒神經(jīng)元缺乏特異性標識，使用Ath1、Zic1、En1等小腦顆粒神經(jīng)元相對特異的標志物結(jié)合Tuj1的表達來確認獲得的神經(jīng)元主要為小腦顆粒樣神經(jīng)元。此外，還檢測到某些細胞表達部分神經(jīng)元亞型的特征性蛋白，如谷氨酸能神經(jīng)元(vGluT1)和GABA能神經(jīng)元。在GFP+細胞上使用星形膠質(zhì)細胞標志蛋白GFAP和少突膠質(zhì)細胞標志蛋白MBP進行免疫細胞化學檢測，結(jié)果顯示，GFP+細胞無明顯表達GFAP和MBP；表明本課題所采用的誘導體系主要將成纖維細胞誘導轉(zhuǎn)變成為神經(jīng)元。

蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，Ascl1和Sox2表達水平從7 d～28 d呈現(xiàn)明顯上升，而OCT4則維持在一個相對較低的表達水平。Ath1、NeuN和Pax6表達水平隨時間的變化反映出由成纖維細胞向小腦顆粒神經(jīng)元轉(zhuǎn)化的過程。p53蛋白表達水平在整個過程中一直呈低水平表達，表明轉(zhuǎn)化的過程及所獲得的hiCGCs均具有一定的安全性。用qPCR檢測Ascl1、Sox2和OCT4在進入細胞后的表達變化，發(fā)現(xiàn)其與western blot檢測的結(jié)果基本一致，Ascl1和Sox2表達水平呈現(xiàn)比較明顯的上升趨勢，而OCT4的表達量則緩慢升高(圖6)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 hiCGCs表達神經(jīng)元標志物MAP2(Scale bar=200 μm)

圖5 hiCGCs表達小腦顆粒神經(jīng)元標志物(Scale bar=200 μm)

圖6 外源誘導因子在hiCGCs內(nèi)的表達水平動態(tài)變化

2.6 hiCGCs的神經(jīng)電生理特性 在誘導重編程后28 d左右，在電流鉗模式下顯示，在150 pA下暴發(fā)第1次動作電位。動作電位保持在比較穩(wěn)定的電壓增量和波幅范圍內(nèi)。在電壓鉗模式下，保持鉗制電壓為-70 mV，觀察到分化所得的hiCGCs具有活躍的電生理特性，表現(xiàn)出類似成熟神經(jīng)元的動作電位特征。在電壓鉗模式下，給予刺激可以記錄到NMDA/AMPA受體介導興奮性突觸后電流(EPSC)，電壓分別鉗制在-80 mV和+40 mV。給予NMDA/AMPA受體拮抗劑(50 μM APV和5 μM NBQX)，會被特異性阻斷。這顯示，誘導小腦顆粒樣神經(jīng)元具有谷氨酸能神經(jīng)元的電生理特點，并在培養(yǎng)中與周圍細胞形成了功能性突觸聯(lián)系，從而參與神經(jīng)電信號的傳導。實驗結(jié)果表明，hiCGCs表達有電壓門控離子通道，能發(fā)放興奮性突觸后電流，具有類似正常小腦顆粒神經(jīng)元的電生理特性。

3 討 論

首先使用腦發(fā)育(主要后腦)的主要轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建一個誘導因子篩選的基因池[8-10]。通過多次篩選，選擇了Ascl1、Sox2和OCT4三個因子。使用qPCR及western blot檢測Ascl1、Sox2和OCT4三個外源誘導因子在進入細胞后的表達情況，Ascl1和Sox2表達隨時間推移呈現(xiàn)比較明顯的上調(diào)趨勢，而OCT4的表達量則表現(xiàn)為持續(xù)緩慢升高。這表明，在成纖維細胞向小腦顆粒樣神經(jīng)元轉(zhuǎn)變的過程中，Ascl1和Sox2可能起到主要的作用，而OCT4則可能是一個重要的輔助因子。故推測，Ascl1和Sox2首先形成了一個具有重要功能的同源結(jié)構(gòu)域，這個蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)對于啟動重編程進程、打開染色體致密結(jié)構(gòu)，在細胞水平上開啟譜系轉(zhuǎn)變具有決定性作用，進而召喚OCT4等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到各自特定的目標位點上，從而打開小腦顆粒樣細胞重編程所涉及的多個激活位點，在重編程過程中主要發(fā)揮啟動/開關(guān)的作用，在整個基因組水平上推動了重編程事件的發(fā)生和發(fā)展。

神經(jīng)營養(yǎng)因子BMP4、FGF8b和Wnt3a在整個誘導過程中起著重要的作用，在神經(jīng)前體細胞向小腦顆粒神經(jīng)元分化的過程中起著導向性的作用。在沒有這三種營養(yǎng)因子的情況下，Tuj1+/Ath1+雙陽性細胞的數(shù)量只有添加三種營養(yǎng)因子下的一半，而對Tuj1+的細胞數(shù)量則沒有明顯的影響。在Ascl1、Sox2和OCT4三個轉(zhuǎn)錄因子和BMP4、FGF8b和Wnt3a三個營養(yǎng)因子的共同作用下，神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化效率及Tuj1+/Ath1+雙陽性細胞達到最高。

神經(jīng)元特異性蛋白的表達對于確認誘導細胞的屬性十分重要，包括Tuj1、MAP-2、synapsin等[11-13]。Tuj1抗體是比較公認的神經(jīng)元標志，已經(jīng)被證實僅識別神經(jīng)細胞的neuronal class Ⅲβ-tubulin。微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated protein-2，MAP-2)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、形成和再生過程的不同時期發(fā)揮重要的作用，是神經(jīng)元細胞骨架的重要組成成分。Synapsin是與突觸囊泡相關(guān)的有代表性的磷酸蛋白，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)的早期發(fā)育分化的過程中扮演著重要的角色。說明誘導的hiCGCs表達神經(jīng)元特異性標志物。通過監(jiān)測hiCGCs的部分電生理特性，表明hiCGCs具有類似神經(jīng)元的電活動，并具有一定功能。通過對GFAP及MBP的檢測，顯示誘導的hiCGCs不表達膠質(zhì)細胞的特異性標志物。

小腦顆粒神經(jīng)元缺乏特異性標識,Ath1、Zic1、En1是小腦顆粒神經(jīng)元特異性相對較高的標志物。在Tuj1+/GFP+雙陽性細胞中，可以檢測到Ath1、Zic1、En1分別在不同的亞群中表達，Tuj1+/Ath1+細胞在Tuj1+/GFP+雙陽性細胞中更有近一半的表達量。因此結(jié)合Tuj1及Ath1、Zic1、En1的表達，可確定Tuj1+/GFP+雙陽性細胞主要為小腦顆粒樣神經(jīng)元，即hiCGCs。Ath1是小腦顆粒神經(jīng)元產(chǎn)生所必需的物質(zhì)，是第一個在活體內(nèi)獲得的能夠產(chǎn)生顆粒細胞的基因，其表達提示小腦顆粒神經(jīng)元的可能[9-10,14]。Zic1、En1、Pax6等也是特異性較高小腦顆粒神經(jīng)元的標志物[9-10]。小腦顆粒神經(jīng)元為谷氨酸能神經(jīng)元[15]，部分誘導細胞給予刺激可以記錄到NMDA/AMPA受體介導興奮性突觸后電流，在谷氨酸受體拮抗劑(APV和NBQX)存在時，會被特異性阻斷。通過多種小腦顆粒神經(jīng)元特異性標志物的檢測以及谷氨酸能神經(jīng)元細胞電生理的檢測，可以說明誘導的細胞為小腦顆粒樣神經(jīng)細胞。

為了證明誘導產(chǎn)生hiCGCs的體系具有特異性，作為對照，本實驗將人頭皮成纖維細胞置于不含外源轉(zhuǎn)錄因子的N3培養(yǎng)體系中(含神經(jīng)營養(yǎng)因子BMP4、FGF8b和Wnt3a)，檢測是否也可能發(fā)生重編程。結(jié)果顯示，只在含營養(yǎng)因子培養(yǎng)液的作用下，成纖維細胞不能夠轉(zhuǎn)變?yōu)樾∧X顆粒樣神經(jīng)元。還將只介導表達GFP的慢病毒載體導入人頭皮成纖維細胞內(nèi)，結(jié)果表明僅靠GFP不能誘導成纖維細胞發(fā)生重編程。

此外，轉(zhuǎn)分化獲取細胞的質(zhì)量還受到一些目前尚不能確定的因素的影響。雖然本研究中轉(zhuǎn)分化過程是在統(tǒng)一規(guī)范的條件下完成的，但獲取細胞的質(zhì)量并不完全一致，轉(zhuǎn)化效率和細胞形態(tài)上存在一定的差異?，F(xiàn)尚無法明確造成這些差異的因素，可能與頭皮成纖維細胞的個體差異以及操作中的細微差別有關(guān)。如果可以明確此類因素的影響，有望進一步提高細胞轉(zhuǎn)化的質(zhì)量。

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(收稿2016-09-11 修回2016-10-23)

In vitro experimental study of reprogramming human fibroblasts into induced cerebellar granule cells

SHENGang，SUZuo-peng，QUANYong，etal.

DepartmentofNeurosurgery，CentralHospitalofMinhangDistrict,Shanghai，Shanghai201100，China

Correspondingauthor：QUANYong

Objectives Directly reprogram patients’ fibroblasts into human induced cerebellar granule cells (hiCGCs) and study the biological characteristics of these cells in vitro.Methods Screening inducing factors associated with cerebellar cell development and differentiation;build expression vector with transcription factors;collect and culture patients’ skin fibroblasts;use slow virus carrier mediated Ascl1,OCT4 and Sox2 transcription factors in intracellular expression,and add neurotrophic factor:BMP4,FGF8b and Wnt3a in the process of culture,get human induced cerebellar granule neurons (hiCGCs) with characteristics of cerebellar granule neurons).Results Confirm the hiCGCs with similar normal biology and physiology characteristics of cerebellar granule neurons via cell immunohistochemical and electrophysiological examination.By using three transcription factors Ascl1,OCT4 and Sox2 and three nutrition factors BMP4,FGF8b and Wnt3a,adult fibroblasts can be directly transformed into hiCGCs with the characteristics of cerebellar granule neurons.Conclusions HiCGCs are very similar with cerebellar granule neurons in morphology,can express granular specific proteins and similar normal electrophysiological characteristics of cerebellar granule neurons.

human induced cerebellar granular-like cells; regenerative medicine; lineage reprogramming

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.01.008

國家自然科學基金(81471242)

201100 上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)外科(沈剛，蘇作鵬，全勇，徐福林)；復旦大學附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科(徐鋒)

全勇

R394.2,Q421

A

1672-7770(2017)01-0030-05