崔勇，張風林，應奇，胡國漢，駱純，盧亦成

·論著·

AKT2在膠質(zhì)瘤細胞中替莫唑胺化療耐藥的作用機制研究

崔勇，張風林，應奇，胡國漢，駱純，盧亦成

目的 研究AKT2基因在U251細胞株中對替莫唑胺化療耐藥中的作用機制。方法 體外將慢病毒介導的AKT2-shRNA表達載體轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251細胞。應用細胞計數(shù)試劑盒(CCK8)法檢測RNA干擾AKT2后U251細胞對替莫唑胺敏感性的變化情況。流式細胞儀測定沉默AKT2基因表達后各組細胞凋亡的改變情況。AKT2-shRNA干擾膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U251的AKT2表達，進而采用Western blot實驗方法，來進一步分析和評價AKT2與MDR-1、MRP-1、MGMT、bcl-2、caspase-3、P53等相關(guān)蛋白表達情況和相互調(diào)控關(guān)系。結(jié)果 CCK8法檢測結(jié)果計算替莫唑胺對U251細胞的半數(shù)細胞抑制濃度(IC50)從U251空白對照組的(39.72±2.41)μg/ml、陰性對照組的(39.43±2.24)μg/ml降到(27.23±1.93)μg/ml，AKT2干擾組U251細胞對替莫唑胺藥物的IC50值顯著降低。流式細胞儀檢測凋亡實驗顯示，與空白對照的U251細胞[調(diào)亡細胞(16.95±1.32)%]和轉(zhuǎn)染陰性對照的U251膠質(zhì)瘤細胞[調(diào)亡細胞(17.93±2.29)%]相比，轉(zhuǎn)染AKT2 shRNA的U251細胞中早期、晚期調(diào)亡細胞明顯增加，總調(diào)亡細胞達(38.16±4.83)%，干擾組凋亡水平有顯著性增強(P<0.05)。AKT2-shRNA干擾U251后其凋亡明顯增加，Real-time PCR和蛋白印跡實驗結(jié)果提示bcl-2、survivin、MGMT明顯下調(diào)，而caspase-3、PTEN、P53、beclin-1明顯上調(diào)。結(jié)論 AKT2可能參與調(diào)控bcl-2、caspase-3、P53、survivin、beclin1等凋亡自噬相關(guān)蛋白及DNA損傷修復蛋白MGMT的表達，從而介導膠質(zhì)母細胞瘤細胞株U251對替莫唑胺化療抵抗。

腦膠質(zhì)瘤；AKT2基因；替莫唑胺

替莫唑胺(TMZ)已成為臨床上腦膠質(zhì)瘤一線化療藥物。聯(lián)用替莫唑胺與生物靶向藥物以提高療效和降低毒性反應是近年來最為活躍的研究領(lǐng)域之一。我們前期的實驗研究表明替莫唑胺耐藥細胞株中大量凋亡相關(guān)蛋白和DNA損傷修復蛋白發(fā)生了明顯的變化，AKT2基因也在耐藥株中明顯上調(diào)[1]，進而推斷AKT2在替莫唑胺膠質(zhì)瘤化療耐藥中起著重要作用。本實驗進一步研究AKT2-shRNA對U251替莫唑胺藥物敏感性的作用調(diào)節(jié)機制。為今后研究人膠質(zhì)瘤對替莫唑胺化療耐藥臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 慢病毒介導的AKT2-shRNA表達載體由中科院上海生命科學院協(xié)助構(gòu)建。腦膠質(zhì)瘤U251細胞(中科院上海生化與細胞所細胞庫)，以含10%新生胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)；shRNA試劑盒(Invitrogen公司)；兔抗人AKT2單克隆抗體(臺灣Abnova公司)：Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(碧云天公司)。

1.2 人腦膠質(zhì)瘤U251細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的U251細胞接種于6孔培養(yǎng)板，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞融合達70%，將AKT2-shRNA轉(zhuǎn)染U251細胞。同時轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)特異性的shRNA(GFP-shRNA)作陰性對照。

1.3 CCK8法檢測U251細胞對TMZ敏感性 細胞轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的U251細胞。制成單細胞懸液后，分別接種于96孔培養(yǎng)板。直接在孔中加入培養(yǎng)基100 μl設(shè)置調(diào)零組，每組分別設(shè)5個重復。將上述配置好的工作液分別加入到各個孔中，并做好標識，于室溫37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至72 h后，傾去培養(yǎng)液，同時加入新鮮的培養(yǎng)基100 μl，每孔避光分別加入CCK8 10 μl，避光培養(yǎng)150 min后，酶標儀測定各組的光密度值。選擇570 nm波長，酶標儀測定各孔的吸光度值(A)，記錄結(jié)果。實驗結(jié)果以細胞抑制率表示，細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值/空白對照組A值)×100%。進而根據(jù)公式計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.4 Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測 收集各實驗組對數(shù)生長期細胞，每組細胞3個復孔，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗滌細胞1次，每EP管中加入250 μl結(jié)合緩沖液懸浮細胞，轉(zhuǎn)移到流式管中，每管中加入2.5 μl Annexin V-FITC混勻后，再加入2.5 μl PI,室溫避光反應15 min,及時上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 Western blot檢測U251細胞AKT2蛋白的表達 以未轉(zhuǎn)染U251細胞為空白對照，轉(zhuǎn)染48 h后，收集轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA和GFP-shRNA的U251細胞，用預冷的PBS洗滌細胞2次。加入5倍細胞懸液體積的組織蛋白裂解液，置冰上20 min，12 000 r/min離心30min。取上清10μl加入等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，離心取上清。將變性后的總蛋白100 μg經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，100 V電泳至溴酚藍達到凝膠底部。320 mA恒流2 h后將蛋白電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1 h。加入1∶1 000稀釋的兔抗人AKT2單克隆抗體，4℃孵育過夜。1∶1 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h，化學發(fā)光劑于暗室中曝光和顯影，檢驗AKT2蛋白條帶，測定吸光度值(A)，以β-actin為內(nèi)參照，表示AKT2蛋白的相對表達強度。

1.6 統(tǒng)計學方法 實驗在相同條件下重復3次。兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)的比較采用ANOVA方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包完成。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染AKT2特異性shRNA后U251細胞對TMZ敏感性的變化 CCK8法檢測U251細胞對替莫唑胺IC50實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染AKT2-shRNA的U251細胞對替莫唑胺的IC50值為(27.23±1.93)μg/ml，轉(zhuǎn)染陰性對照組U251細胞對替莫唑胺的IC50值為(39.43±2.24)μg/ml，未轉(zhuǎn)染的空白對照組U251細胞對替莫唑胺的IC50值為(39.72±2.41)μg/ml。這些結(jié)果表明，AKT2-shRNA U251細胞對化療藥物替莫唑胺的療效和對照組相比明顯增加(圖1)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 AKT2-shRNA對U251細胞TMZ敏感性IC50的影響(*P<0.05)

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果 采用FCM定量分析AKT2-shRNA組和對照組U251細胞調(diào)亡水平。實驗結(jié)果顯示，與空白對照的U251細胞[調(diào)亡細胞(16.95±1.32)%]和轉(zhuǎn)染陰性對照的U251膠質(zhì)瘤細胞[調(diào)亡細胞(17.93±2.29)%]相比，轉(zhuǎn)染AKT2 shRNA的U251細胞中早期、晚期調(diào)亡細胞明顯增加，總調(diào)亡細胞達(38.16±4.83)%，干擾組凋亡水平有顯著性增強(P<0.05)。見圖2。

2.3 Western blot檢測結(jié)果 與陰性對照組相比，AKT2干擾組Bcl2、survivin蛋白表達下調(diào)；而caspa-se3、p53、PTEN、Beclin1表達上調(diào)。見圖3、4。

圖2 流式細胞儀定量分析U251細胞轉(zhuǎn)染前后凋亡水平變化(* P<0.05)

圖3 凋亡相關(guān)蛋白免疫印跡檢測(*P<0.05) 圖4 DNA損傷修復蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白免疫印跡檢測(*P<0.05)

3 討 論

人腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最為多見的原發(fā)的惡性腦腫瘤，發(fā)病率在所有腦瘤中達到70%以上[2]。其治療效果差，復發(fā)率高?；熓悄z質(zhì)瘤綜合治療中的重要一環(huán)，但相當一部分患者治療效果欠佳。新一代烷化劑替莫唑胺是目前對腦膠質(zhì)瘤的標準化療藥物，在化療治療中發(fā)揮著重要作用[3-4]。并已被證明有著良好的臨床治療效果。由于化療藥物內(nèi)在性和獲得性耐藥還有血-腦屏障的存在，影響了化療效果[5]。

AKT2是近年來發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，該基因通過PI3K/AKT/mTOR等途徑激活腫瘤增殖生長[6]。研究表明AKT2在腫瘤發(fā)生和進展中起著重要的作用，可能是腫瘤基因治療理想的靶點和熱點，并可能為增強化療敏感性的關(guān)鍵基因之一[7]，許多傳統(tǒng)的化療藥物都是通過引誘癌細胞的DNA損傷來發(fā)揮其細胞毒性作用的，因此一個細胞固有的DNA修復途徑可以逆轉(zhuǎn)細胞毒性藥物的DNA損傷，從而介導化療耐藥。TMZ是目前神經(jīng)外科對膠質(zhì)瘤患者化療的一線金標準口服烷化劑，雖然活性的DNA修復蛋白O6甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)已被描述為確定對膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)TMZ的敏感性影響的主要調(diào)劑蛋白，MGMT蛋白可以對膠質(zhì)瘤細胞DNA烷化損傷采用甲基化特異性的修復，是一個化療藥物TMZ在膠質(zhì)瘤腫瘤細胞中耐藥的主要原因。盡管MGMT基因失活，GBM還是對TMZ化療抵抗，這表明還有其他DNA修復機制也參與調(diào)節(jié)TMZ耐藥，如堿基切除修復(BER)、錯配修復(MMP)、核苷酸切除修復(NER)等[8-10]。即使在DNA造成的對腫瘤細胞的損傷未被很好的修復的情況下，腫瘤細胞還可以通過抑制凋亡信號途徑使腫瘤細胞能夠繼續(xù)存活，從這些方面也不難看出癌癥化療耐藥的分子機制異常復雜。

我們前期實驗研究中以AKT2為中心構(gòu)建的信號網(wǎng)絡(luò)(singal-net)圖顯示AKT2基因?qū)Χ鄠€凋亡相關(guān)蛋白如caspase-3、bad、bcl-2、bax、survivin、TP53、caspase-9等起著重要的調(diào)控作用。研究顯示，AKT2處于多個信號傳導通路的交叉口，對腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲起著至關(guān)重要的作用。本實驗流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，AKT2干擾組較對照組和空病毒陰性對照組相比凋亡明顯上調(diào)，也再次驗證了AKT2在腫瘤細胞中抑制凋亡的作用。蛋白印跡實驗結(jié)果驗證凋亡、自噬相關(guān)的蛋白bcl-2、caspase-3、P53、survivin、beclin-1、PTEN蛋白發(fā)生明顯變化，而轉(zhuǎn)運蛋白MDR1、MRP1沒有明顯變化，對DNA損傷修復相關(guān)蛋白ERCC1、XRCC1表達的影響沒有一致的趨勢，這還需要今后更多實驗進一步驗證AKT2是否調(diào)控這些蛋白。

從本實驗結(jié)果推斷，AKT2主要通過Bcl-2、p53、caspase-3、Survivin為替莫唑胺化療耐藥機制，膠質(zhì)母細胞瘤等凋亡相關(guān)蛋白和途徑。AKT2對DNA損傷修復蛋白MGMT也可能存在調(diào)控作用。但對一些MDR等轉(zhuǎn)運蛋白可能沒有直接調(diào)控作用，對堿基切除修復蛋白XRCC1、核苷酸切除修復蛋白ERCC1作用目前還不能肯定，還需再進一步驗證和發(fā)現(xiàn)。本實驗只針對U251一個細胞株進行的系統(tǒng)研究，有研究報道膠質(zhì)母細胞瘤中不同種如U251、U373、SNB19雖然種屬相同但其對化療藥物的敏感性不盡相同[11]，所以下一步實驗將在膠質(zhì)母細胞瘤中的U87、U373、SNB19等多個細胞株中進行上述凋亡自噬、DNA損傷修復相關(guān)蛋白的全面檢測，更加深入的探討AKT2 在膠質(zhì)母細胞瘤中改變對替莫唑胺化療效果影響的分子作用機制。盡早的將基礎(chǔ)研究工作能應用于臨床神經(jīng)外科對膠質(zhì)母細胞瘤患者的藥物化療中去，最大限度地減輕TMZ的化療耐藥。

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(收稿2016-08-07 修回2016-10-21)

The role of AKT2 in resistance totemozolomide in glioma cell line U251

CUIYong,ZHANGFeng-lin,YINGQi,etal.

DepartmentofNeurosurgery,411HospitalofPLA,Shanghai200081，China

Correspondingauthor：LUYi-cheng

Objective To explore the effects of AKT2 expression in U251 glioma cells on the sensitivity towards to temozolomide(TMZ).Methods The lentivirus vector of AKT2 shRNA was constructed and transfected into U251 cells．The changes of TMZ sensitivity after shRNA were examined by the CCK8 assay.Apoptosis of cells of each group was detected by flow cytometry cell technology.further analysis and evaluation of the AKT2 and the MDR-1,MRP-1,MGMT,and apoptosis related protein expression regulatory interaction used by Real-time PCR and Western Blot.Results the IC50 of U251 cell decreased from the blank control group (39.72±2.41)μg/ml,negative control group (39.43±2.24)μg/ml to (27.23±1.93) μg/ml,sensitivity of U251 cell to TMZ decreased significantly．Western blot results showed Bcl-2,survivin,MGMT was down regulated,and Caspase-3,PTEN,P53,beclin-1 increased.Conclusion AKT2 may be involved in the regulation of expression of apoptosis and autophagy related protein Bcl-2,Caspase-3,P53,survivin,Beclin1,and DNA damage repair protein MGMT,which mediates U251 chemotherapy resistance to TMZ.

glioma； AKT2； temozolomide

10.3969/j.issn.1672-7770.2017.01.007

國家自然科學基金(30930094)

200081 上海，解放軍第411醫(yī)院神經(jīng)外科(崔勇，張風林，應奇)；第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院神經(jīng)外科(胡國漢，駱純，盧亦成)

盧亦成

R739.41

A

1672-7770(2017)01-0026-04