朱榮，馬建設(shè)

ZHU Rong，MAJian-she

間歇與持續(xù)有氧運(yùn)動改善慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原代謝研究

朱榮，馬建設(shè)

ZHU Rong，MAJian-she

心力衰竭（心衰）是一種全身性疾病，而非僅涉及心臟。心衰時骨骼肌功能異常，其機(jī)制與毛細(xì)血管稀疏、肌纖維由I型（氧化型）向II型（糖酵解型）轉(zhuǎn)變、物質(zhì)與能量代謝異常以及肌萎縮有關(guān)，最終導(dǎo)致運(yùn)動耐力下降，是造成心衰患者呼吸困難、易于疲勞的主要原因［12］。流行病學(xué)研究證實(shí)，運(yùn)動能力低下是心衰患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測變量［29］。

心衰時機(jī)體分解代謝加強(qiáng)，糖代謝供能比例增加使肌糖原含量減少。研究證實(shí)，骨骼肌糖原含量降低是心衰患者運(yùn)動耐力下降的重要原因，減少骨骼肌糖原利用、增加肌糖原含量可顯著提高心衰患者的運(yùn)動能力并改善生活質(zhì)量［21］。研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動療法不僅能夠改善心衰患者心功能，對骨骼肌系統(tǒng)也存在良性影響［10］，但針對心衰患者的最佳運(yùn)動處方仍未確定。已經(jīng)明確的是，中等強(qiáng)度持續(xù)有氧運(yùn)動是心衰患者的首選運(yùn)動方式，可改善心功能和骨骼肌異常，其安全性和有效性也得到普遍認(rèn)可。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，長期中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動能夠提高正常大鼠［3］以及心衰大鼠［4］骨骼肌糖原含量并改善運(yùn)動能力。有研究顯示，高強(qiáng)度間歇運(yùn)動亦可作為心衰患者的康復(fù)治療手段，不良反應(yīng)的發(fā)生率并未明顯增加，其對于運(yùn)動能力和心功能的良性效應(yīng)甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的持續(xù)運(yùn)動［22，31］。本團(tuán)隊(duì)曾采取正常大鼠高強(qiáng)度間歇運(yùn)動方案，發(fā)現(xiàn)骨骼肌糖原含量上調(diào)［2］，但對心衰大鼠的作用及機(jī)制未知。因此，本研究進(jìn)一步以心衰大鼠為對象，對比高強(qiáng)度間歇運(yùn)動和中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動對其不同類型肌纖維糖原含量的影響及機(jī)制進(jìn)行探討，以期為制定特異性的運(yùn)動康復(fù)處方以及制定新的治療策略和干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

健康雄性SD大鼠40只，體重250～300 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物生產(chǎn)許可證批號：SCXK-（軍）2007-004，動物批號：0006645，動物使用許可證批號：SYXK（京）2008-0009。動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，自動溫控（21± 2℃），濕度60%～65%，12 h晝夜交替光照，每籠5只，自由進(jìn)食飲水。本實(shí)驗(yàn)在溫州醫(yī)科大學(xué)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所作物功能基因與遺傳改良研究室完成。

1.2 分組與造模

將大鼠隨機(jī)分為心衰安靜組（heart failure sedentary，HFS）、心衰間歇運(yùn)動組（heart failure interval exercise，HF-IE）、心衰持續(xù)運(yùn)動組（heart failure continuous exercise，HF-CE）和假手術(shù)組（sham-operated，SHAM），每組各10只。利用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)進(jìn)行心衰造模，方法為：0.1 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉動物后仰臥固定，胸部備皮，連接小動物呼吸機(jī)，在心尖搏動處開胸暴露心臟，0號絲線結(jié)扎冠狀動脈前降支。心電圖顯示心肌缺血改變（Ⅱ?qū)С霈F(xiàn)ST段弓背抬高）持續(xù)超過30 min標(biāo)志手術(shù)成功。迅速放回心臟縫合胸壁。術(shù)后連續(xù)3天給予青霉素1×105U/d肌注預(yù)防感染。SHAM組開胸后只穿針，但不結(jié)扎冠狀動脈前降支，其余處理同上。

1.3 運(yùn)動耐力測定與運(yùn)動方案

所有大鼠在術(shù)后4周開始進(jìn)行跑臺適應(yīng)性訓(xùn)練（10～15 m/min，30 min/d，共5天），而后利用遞增負(fù)荷運(yùn)動實(shí)驗(yàn)測定大鼠運(yùn)動耐力［15］。將跑臺坡度設(shè)置為0°，起始負(fù)荷為5 m/ min，每2 min遞增1.5 m/min，直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)：大鼠拒絕繼續(xù)運(yùn)動，在電刺激下仍持續(xù)停留于電動跑臺后部。記錄最大位移、力竭時間和最大跑速（maximal velocity，Velmax）。

根據(jù)Borges等［8］、Hoydal等［17］的方法制定跑臺運(yùn)動方案。HF-IE組進(jìn)行高強(qiáng)度間歇運(yùn)動：先以40%Velmax運(yùn)動5 min，再以80%Velmax運(yùn)動4 min和40%Velmax運(yùn)動4 min，之后依次交替進(jìn)行，重復(fù)7次（運(yùn)動時間為56 min），5天/周，共8周。HFCE組進(jìn)行中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動：熱身運(yùn)動5 min（40%Velmax），之后以60%Velmax持續(xù)運(yùn)動56 min，5天/周，共8周。兩種訓(xùn)練方式總的運(yùn)動負(fù)荷相同（HF-IE組：［80%×4＋40%×4］×7＝33.6 Velmax·min；HF-CE組：60%×56＝33.6 Velmax·min），可排除因運(yùn)動負(fù)荷不同造成的結(jié)果差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第2天再次測定運(yùn)動耐力。

1.4 心臟超聲檢測

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后第3天進(jìn)行心臟超聲檢測。首先稱大鼠體重（body weight，BW），0.1 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔麻醉，仰臥固定，胸部備皮，用小動物超聲影像診斷系統(tǒng)（Vevo 770，加拿大visualsonics公司）進(jìn)行心臟超聲檢查。探頭（頻率為7.0 MHz）置于左胸獲取M型超聲心動圖，獲取以下參數(shù)：左心室收縮末期直徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒張末期直徑（left ventricular end-diastolic diameter LVEDD）、縮短分?jǐn)?shù)（fractional shortening，F(xiàn)S）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）和心率（heart rate，HR）。

1.5 取材

心臟超聲檢測結(jié)束后，尾靜脈取血300 μL，4℃、3 000 rpm離心取血清。而后迅速取出心臟，稱量心臟重量（heart weight，HW）后分離左心室并稱量左室重量（left ventricular weight，LVW），分別計(jì)算與體重比值作為心臟質(zhì)量指數(shù)（heart weight index，HWI）和左室心臟質(zhì)量指數(shù)（left ventricular weight index，LVWI）。取左側(cè)肺葉稱濕重，置干燥箱24 h稱干重，計(jì)算肺含水率（lung water ratio，LWR）=（肺濕重－肺干重）/肺濕重×100%。分離脛骨前?。旒橹鳎┖捅饶眶~?。橹鳎?，將組織分為3部分；第一部分新鮮組織做酶的活性和葡萄糖攝取率；第二部分連同心臟制作組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)觀察；第三部分進(jìn)行蛋白含量檢測，用錫紙包裹投入液氮中并轉(zhuǎn)移至－80℃低溫冰箱凍存待測。

1.6 肌纖維類型測定

骨骼肌標(biāo)本置于4%的多聚甲醛緩沖液中固定4～8 h后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片（5 μm）。ATP酶染色法鑒定I型和II型骨骼肌纖維：堿預(yù)孵（pH 10.6）后，I型肌纖維ATP酶活性被抑制，II型肌纖維ATP酶活性仍然保持，故II型纖維被染成深色，I型纖維則著色較淺。封固后，切片用顯微照相圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行照相，用Simple PCI圖像分析軟件分析肌纖維類型分布以及肌細(xì)胞橫截面積（cross-sectional area，CSA）。

1.7 血糖和血胰島素測定

利用半自動生化分析儀（MD-100型）以氧化酶法測定血糖濃度（試劑盒購自南京建成生物有限公司）。利用γ放免儀（FMQ-9013C型）以放免法測定血清胰島素含量（試劑盒購自武漢博士德生物公司）。

1.8 肌糖原含量測定

蒽酮法測定，儀器為722型光柵分光光度計(jì)。取50 mg骨骼肌用400 μL濃度為30%的KOH消化（100℃，30 min），隨后加入800 μL無水乙醇沸水浴10 min。冷卻后4℃、3 000 g離心30 min，小心棄上清，將沉淀物懸浮于1 mL濃度5%的三氯乙酸中。取100 μL溶液與600 μL濃度0.2%的蒽酮溶液混勻，沸水浴5 min。冷卻后以空白管調(diào)零，測定各樣品和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在620 nm處的吸光度，計(jì)算糖原含量（單位：μg/ mg肌肉組織）。

1.9 葡萄糖攝取率測定

根據(jù)Turban等［30］方法稍作修改。取2塊50 mg骨骼肌加入到5mL Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液中（117 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，2.5 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L KH2PO4，1.2 mmol/L MgSO4，24.6 mmol/L NaHCO3，pH 7.4），預(yù)孵育30 min。取出分別加入到2 mL不含胰島素（-Ins）和含胰島素（+ Ins，1.0μmol/L）的Krebs-Ringer碳酸鹽緩沖液中，37℃、5% CO2、95%O2條件下震蕩孵育1 h。再加入2 mL 1.5 nmol/L 2-脫氧葡萄糖（含0.5 μCi3H-2-脫氧葡萄糖），孵育30 min。冰生理鹽水洗滌5次后，加入0.5 mL 4%（w/v）過氯酸，80℃消化30 min，室溫冷卻，14 000 g離心10 min。取250 uL至液閃瓶中，加1 mL乙二醇乙醚（助溶劑）和2 mL閃爍液（2.5-二苯基惡唑（PPO）0.5 g、1，4-雙-（5-苯基，惡唑基）-苯（POPOP）0.2 g、甲苯1 000 mL混勻），Beckman LS 3801全自動液閃儀（美國）測定其放射性（單位：pmol/mg/min）。

1.10 糖原合酶活性測定

糖原合酶活性（glycogen synthase，GS）測定根據(jù)Franch等［16］的方法稍做修改。50 mg骨骼肌組織加入0.5 mL緩沖液（50 mmol/LTris-HCl，pH 7.0，1 mmol/LEDTA，0.1%β-mercaptoethanol，0.25 mol/L sucrose，5 μg/mL aprotinin，5 μg/mL leupeptin，0.1 mmol/L PMSF）勻漿后，4℃、3 000 g離心30 min。取上清液測蛋白濃度，另取50 μL上清液加等體積含10 mmol/L葡萄糖-6-磷酸（glucose 6-phosphate，G-6-P）（+G-6-P）和不含G-6-P（-G-6-P）的緩沖液（終濃度為25 mmol/L Tris/HCl，50 mmol/L NaF，5 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L UDP-glucose，0.1 mCi/mmol［14C］-UDP-glucose），30℃孵育20 min。取75 mL溶液點(diǎn)在2 cm2Whatman濾紙上過濾，然后放進(jìn)66%乙醇中清洗，晾干測試放射性活性（單位：pmol/mg/ min）。緩沖液不含G-6-P為活化型GS測定，緩沖液含G-6-P為GS總酶測定。GS活性用活化型酶活性與總酶活性的比值表示（-G-6-P/+G-6-P），即活性GS比，測試儀器同葡萄糖攝取率。

1.11 糖原磷酸化酶活性測定

糖原磷酸化酶活性（glycogen phosphorylase，GP）測試方法與儀器同糖原合酶活性測試。取50 mg骨骼肌勻漿后加入0.5 mL緩沖液混勻，4℃、3 000 g離心30 min。取50 μL上清液加等體積含2.5 mCi/mol［14C］-葡萄糖-1-磷酸（glucose 1-phosphate，G-1-P）緩沖液，活化型GP測定緩沖液不含AMP（-AMP），GP總酶測定緩沖液含2 mmol/L AMP（+AMP）。測定14C摻入糖原的放射活性（單位：nmol/mg/min）。GP活性用活化型酶活性與總酶活性的比值表示（-AMP/+AMP），即活性GP比。

1.12 Western Blotting測定蛋白表達(dá)量

取50 mg骨骼肌組織液氮研磨，勻漿裂解，4℃、15 000 g離心20 min，用考馬斯亮藍(lán)法測定總蛋白含量。取10 μg蛋白樣品經(jīng)15%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗（1: 1 000，購自美國Santa Cruz公司的兔抗鼠GP），磷酸化GP（p-GP）、GS和磷酸化GS（p-GS）4℃靜置過夜。再以1:1000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（二抗）37℃孵育1 h，充分洗滌后，使用ECL發(fā)光成像，Image J軟件讀取各條帶的灰度值，β-actin為內(nèi)參蛋白。相對表達(dá)量＝目的蛋白灰度值÷β-actin灰度值。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 17.0 for windows。數(shù)據(jù)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間用One-Way ANOVA比較，多重比較使用Bonferroni檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動耐力結(jié)果

如圖1所示，與SHAM組比較，HF-S組力竭時間降低（P＜0.05）；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組力竭時間升高（P＜0.05）；與HF-CE組比較，HF-IE組力竭時間升高（P＜0.05）。

圖1 本研究各組大鼠運(yùn)動至力竭的時間柱狀圖Figure 1.Exhaust Duration of Rats in Each Group

2.2 心臟結(jié)構(gòu)與功能結(jié)果

如表1所示，與SHAM組比較，HF-S組LVESD和LVEDD升高（P＜0.05），F(xiàn)S和LVEF降低（P＜0.05）；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組LVESD和LVEDD降低（P＜0.05），F(xiàn)S和LVEF升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠的心臟結(jié)構(gòu)與功能Table 1 Cardiac Structure and Function of Rats in Each Group

2.3 體重與心臟指數(shù)結(jié)果

如表2所示，與SHAM組比較，HF-S組HW、HWI、LVW、LVWI和LWR升高（P＜0.05），HF-CE和HF-IE組 HWI、LVW和LVWI升高；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組LWR降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠體重與心臟指數(shù)Table 2 Body Weight and Heart Index of Rats in Each Group

2.4 骨骼肌纖維類型分布與CSA結(jié)果

ATP酶染色見圖2、圖3，I型肌纖維著色較深，II型肌纖維著色較淺。肌纖維分布和CSA見圖4、圖5。與SHAM組相較，HF-S組比目魚肌和脛骨前肌I型肌纖維比例減少（P＜ 0.05），II型肌纖維比例增加（P＜0.05），CSA下降（P＜0.05）。與HF-S組相較，HF-CE和HF-IE組比目魚肌和脛骨前肌I型肌纖維比例增加（P＜0.05），II型肌纖維比例減少（P＜0.05），CSA無顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠比目魚肌ATP酶染色示意圖Figure 2.ATP Anzyme Staining of Rat Musculus Soleus in Each Group

圖4 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌I型與II型肌纖維分布柱狀圖Figure 4.Distribution of Type I and Type II Muscle Fibers of Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

圖5 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌CSA柱狀圖Figure 5.CSA of Type I and Type II Muscle Fibers in Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

2.5 血糖和胰島素含量結(jié)果

如表3所示，與SHAM組比較，HF-S組血胰島素升高（P＜0.05）；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組血胰島素降低（P＜0.05）。

2.6 肌糖原含量結(jié)果

如圖6所示，與SHAM組比較，HF-S組比目魚肌和脛骨前肌糖原降低（P＜0.05）；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組比目魚肌和脛骨前肌糖原升高（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血糖和胰島素含量Table 3 Concentration of Blood Glucose and Insulin of Rats in Each Group

圖6 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌糖原含量柱狀圖Figure 6.Glycogen Concentration in Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

2.7 葡萄糖攝取率結(jié)果

如圖7所示，比目魚肌和脛骨前肌基礎(chǔ)葡萄糖攝取率（-Ins）在四組間無顯著性差異（P＞0.05），但胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取率（+Ins）HF-S組低于SHAM組（P＜0.05），HF-CE和HF-IE組則高于HF-S組（P＜0.05）。

圖7 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌葡萄糖攝取率柱狀圖Figure 7.Rates of Glucose Uptake of Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

2.8 GS活性和蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖8～10所示，與SHAM組比較，HF-S組比目魚肌和脛骨前肌活化型GS活性（-G-6-P）和活性GS比（-G-6-P/+G-6-P）降低，p-GS蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與HF-S組比較，HF-CE和HF-IE組活性GS比（-G-6-P/+G-6-P）升高，p-GS蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。GS總蛋白和GS總酶活性（+G-6-P）在4組間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖8 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌GS活性柱狀圖Figure 8.GS Activity of Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

圖9 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌活性GS比（-G-6-P/+G-6-P）柱狀圖Figure 9.Ratio of GS Activity（G-6-P/G-6-P）of Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

圖10 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌GS和p-GS蛋白含量變化示意圖Figure 10.Changes of GS and p-GS Protein Level in Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

2.9 GP活性和蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖11～13所示，與SHAM組比較，HF-S組比目魚肌和脛骨前肌活化型GP活性（-AMP）、活性GP比（-AMP/+ AMP）和p-GP蛋白表達(dá)量升高；與HF-S組比較，HF-CE和 HF-IE組活化型GP活性（-AMP）、活性GP比（-AMP/+ AMP）和p-GP蛋白降低（P＜0.05）。GP總蛋白和GP總酶活性（+AMP）在4組間無顯著性差異（P＞0.05）。

圖11 各組大鼠比目魚肌和脛骨前肌GP活性柱狀圖Figure 11.GP Activity of Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

圖13 比目魚肌和脛骨前肌GP和p-GP蛋白的變化示意圖Figure 13.Changes of GP and p-GP Protein Level in Rat Musculus Soleus and Anterior Tibial Muscle in Each Group

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗塞后，心臟發(fā)生重塑，表現(xiàn)為左室肥厚，心腔代償性擴(kuò)張，肺水腫，最終導(dǎo)致心功能下降。研究報(bào)道，心衰常伴骨骼肌功能異常并造成運(yùn)動能力下降，后者則是心衰患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因子［29］。隨著對心衰時骨骼肌細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制的深入研究，學(xué)者們提出多個治療心衰的潛在靶點(diǎn)，如代謝酶、鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白、氧化應(yīng)激以及炎癥因子等。盡管治療心衰的藥物有多種，但沒有一種藥理學(xué)手段可阻止骨骼肌肌病的發(fā)生［12］。因此，心衰治療方案中應(yīng)強(qiáng)調(diào)在提高心功能的同時改善骨骼肌異常。

研究顯示，中等強(qiáng)度持續(xù)有氧運(yùn)動可顯著改善心衰患者骨骼肌功能和運(yùn)動耐力，減輕呼吸困難、易疲勞等癥狀，在一定程度上改善生活質(zhì)量并降低住院率與死亡率［10］，但針對心衰患者的最佳運(yùn)動處方仍未確定。近年來，在傳統(tǒng)有氧運(yùn)動方式基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種新穎的運(yùn)動模式，即間歇有氧運(yùn)動（以下簡稱間歇運(yùn)動）。由于既往研究認(rèn)為，間歇運(yùn)動對心血管患者可能存在安全隱患而在實(shí)踐中很少應(yīng)用，但最近的流行病學(xué)研究、實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究都證實(shí)，間歇運(yùn)動能夠產(chǎn)生比中低強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動更有效的強(qiáng)心作用［20］。間歇運(yùn)動是一種高效率的方式，即使在較低的負(fù)荷量時也可以產(chǎn)生與傳統(tǒng)持續(xù)有氧運(yùn)動相同的骨骼肌代謝方面的適應(yīng)性變化［25］。本研究中，雖然HF-CE和HF-IE組心臟指數(shù)（HWI、LVW和LVWI）仍高于SHAM組，但力竭時間、FS和LVEF高于HF-S組，LVESD、LVEDD和LWR低于HF-S組，上述心臟結(jié)構(gòu)與功能參數(shù)以及運(yùn)動耐力參數(shù)的變化說明，兩種運(yùn)動方式均可抑制心臟重塑并提高心功能和運(yùn)動能力。此外，HF-IE組運(yùn)動耐力顯著高于HF-CE組，提示，間歇運(yùn)動對于提高運(yùn)動能力的效果更佳。

肌肉萎縮是心衰患者運(yùn)動能力下降的主要原因。在本研究中，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，HF-S組目魚肌和脛骨前肌CSA均較SHAM組顯著性下降，而兩種運(yùn)動方式對CSA并無顯著影響，可能與本研究建立的心衰模型動物骨骼肌萎縮程度較輕以及運(yùn)動時間有關(guān)。與SHAM組比較，HF-S組比目魚肌和脛骨前肌I型肌纖維減少，II型肌纖維增多，提示，心衰時肌纖維由耐疲勞的I型（氧化型）向不耐疲勞的II型（糖酵解型）轉(zhuǎn)變，這是心衰患者肌力減退和易于疲勞的首要原因［19］。運(yùn)動后快、慢肌I型肌纖維比例均顯著增加，但不同運(yùn)動方式之間并無顯著性差異，與Bartlett等［7］針對人體試驗(yàn)的結(jié)果一致，說明，運(yùn)動改善骨骼肌有氧代謝能力的作用不依賴于運(yùn)動方式。

肌糖原是葡萄糖在肌肉中的儲存形式，是肌肉收縮的重要能源物質(zhì)，其儲備量與運(yùn)動能力密切相關(guān)［24］。心衰時機(jī)體能源物質(zhì)不足，骨骼肌灌注減少，缺血缺氧使骨骼肌的供能方式由利用自由脂肪酸轉(zhuǎn)向糖酵解，細(xì)胞酸中毒，糖原利用增加［6］，因此，肌糖原含量下降。在本研究中，HF-S組大鼠比目魚肌和脛骨前肌糖原含量均低于SHAM組，同時運(yùn)動耐力降低，提示，肌糖原含量下降是心衰骨骼肌功能異常、易疲勞和運(yùn)動不耐受的重要原因。規(guī)律運(yùn)動可改善心肌和骨骼肌代謝異常，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)［1］，8周跑臺運(yùn)動可促進(jìn)心衰大鼠心肌脂肪酸氧化利用，減輕心肌脂質(zhì)沉積并改善脂毒性心臟異常。研究證實(shí)，增加骨骼肌糖原含量可提高心衰患者運(yùn)動耐力并促進(jìn)心臟康復(fù)［21］。規(guī)律運(yùn)動可提高正常骨骼肌糖原含量［2，3，26］，因此推測，運(yùn)動亦可增加心衰時骨骼肌糖原含量。在本研究中，間歇運(yùn)動和持續(xù)運(yùn)動均可提高比目魚肌和脛骨前肌糖原含量，且兩種運(yùn)動方式的作用是等效的。有研究通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)［23］，肌糖原在肌纖維亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布存在異質(zhì)性，包括肌內(nèi)（intramyofibrillar）糖原、肌間（intermyofibrillar）糖原和肌膜下（subsarcolemmal）糖原3種亞細(xì)胞定位，以肌間糖原為主。I型肌纖維中的比例為12%、77%和11%，II型肌纖維則為8%、84%和8%。心衰時糖原定位的改變以及運(yùn)動的干預(yù)效果尚無研究報(bào)道。

糖原含量是由骨骼肌攝取葡萄糖、糖原合成以及糖原分解等因素共同決定的，由此，本研究對心衰和不同方式運(yùn)動影響肌糖原含量的具體機(jī)制進(jìn)行了深入探討。糖原缺乏時骨骼肌可通過攝取血糖作為能量底物，因此，肌糖原的合成與肌細(xì)胞攝取葡萄糖的速率成正比，且這一過程受胰島素調(diào)控［28］。本研究中，HF-S組血胰島素明顯升高而胰島素刺激的葡萄糖攝取率（+Ins）降低，提示，心衰時存在胰島素抵抗，其機(jī)制與肌膜葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)下調(diào)有關(guān)［14］，造成骨骼肌對血糖的利用減少。HF-IE和HF-CE組血胰島素降低，胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取率（+Ins）顯著升高，提示，長期運(yùn)動改善了胰島素抵抗，骨骼肌攝取血糖的能力增強(qiáng)。GS和GP分別是糖原合成與分解的限速酶，GS磷酸化失活，去磷酸化激活，GP則相反。此外，GS還受G-6-P的別構(gòu)調(diào)節(jié)［11］。本研究中，與SHAM組比較，HF-S組GS活性（-G-6-P/+G-6-P）降低，GP活性（-AMP/+AMP）、p-GP和p-GS蛋白表達(dá)上調(diào)，說明，心衰時糖原合成減少、分解增加。在不同方式運(yùn)動后，GS活性（-G-6-P/+G-6-P）增加，GP活性（-AMP/+AMP）、p-GP和p-GS蛋白表達(dá)量下調(diào)，且不同肌纖維類型的變化規(guī)律基本一致，提示，長期運(yùn)動可促進(jìn)糖原合成并降低其利用。其機(jī)制可能與上游的信號分子——糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK-3，可使GS磷酸化而失活）活性下調(diào)［5］、交感激活得到抑制［18］、兒茶酚胺分泌減少［27］等因素有關(guān)。

需要指出的是，雖然間歇運(yùn)動和持續(xù)運(yùn)動在改善肌纖維類型、增強(qiáng)心功能、提高心衰大鼠骨骼肌糖原含量及相關(guān)機(jī)制等方面并無顯著性差異，但間歇運(yùn)動對于運(yùn)動耐力的改善作用優(yōu)于持續(xù)運(yùn)動，提示，還存在影響運(yùn)動能力的其他重要因素，如線粒體生物合成、有氧氧化關(guān)鍵酶的活性和表達(dá)量等［9］。Cochran等［13］發(fā)現(xiàn)，間歇運(yùn)動后過氧化物酶體增殖物活化受體γ輔活化蛋白1（peroxisome proliferator-activated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α，調(diào)節(jié)線粒體生物合成的關(guān)鍵性信號分子）表達(dá)量顯著高于持續(xù)運(yùn)動。因此，還要進(jìn)一步探討不同有氧運(yùn)動形式的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

1.心衰時，心臟重塑、心功能下降，骨骼肌快肌和慢肌均發(fā)生I型肌纖維向II型肌纖維轉(zhuǎn)換，肌纖維橫截面積減少（肌萎縮）；長期間歇有氧運(yùn)動和持續(xù)有氧運(yùn)動均能夠抑制心衰大鼠心臟重塑、改善心功能，增加骨骼肌快肌和慢肌I型肌纖維含量。

2.心衰時，由于胰島素抵抗、骨骼肌攝取葡萄糖減少、糖原合成減少、糖原分解增多，骨骼肌糖原含量下降、運(yùn)動能力降低；長期間歇有氧運(yùn)動和持續(xù)有氧運(yùn)動均可提高心衰大鼠快肌和慢肌糖原含量，其機(jī)制可能與改善胰島素抵抗、增加葡萄糖攝取、促進(jìn)糖原合成、減少糖原分解有關(guān)，且兩種運(yùn)動方式對肌糖原代謝的作用與機(jī)制是等效的。

3.間歇運(yùn)動對于心衰大鼠運(yùn)動耐力的改善作用優(yōu)于持續(xù)運(yùn)動，其機(jī)制與心功能、肌糖原的變化以及肌纖維類型轉(zhuǎn)換無關(guān)。

［1］賽慶彬，馬延超，朱榮.有氧運(yùn)動抑制心力衰竭大鼠心臟脂質(zhì)沉積：AMPK-PPARa信號通路的作用［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2012，31（12）:1081-1086，1108.

［2］施曼莉，朱榮.高強(qiáng)度間歇運(yùn)動對骨骼肌糖原含量的影響及機(jī)制研究［J］.體育科學(xué)，2015，35（4）:66-71.

［3］許紹哲，朱榮.長期運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)sd大鼠骨骼肌糖原含量上調(diào)的分子機(jī)制［J］.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2015，34（1）:42-49.

［4］甄潔，朱榮.有氧運(yùn)動對慢性心力衰竭大鼠骨骼肌糖原和運(yùn)動耐力的影響［J］.中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2015，（4）:426-431.

［5］AHMAD F，LAL H，ZHOU J，et al.Cardiomyocyte-specific deletion of Gsk3alpha mitigates post-myocardial infarction remodeling，contractile dysfunction，and heart failure［J］.JAm Coll Cardiol，2014，64（7）:696-706.

［6］AZEVEDO P S，MINICUCCI M F，SANTOS P P，et al.Energy metabolism in cardiac remodeling and heart failure［J］.Cardiol Rev，2013，21（3）:135-140.

［7］BARTLETT J D，HWA J C，JEONG T S，et al.Matched work high-intensity interval and continuous running induce similar increases in PGC-1alpha mRNA，AMPK，p38，and p53 phosphorylation in human skeletal muscle［J］.JAppl Physiol（1985），2012，112（7）:1135-1143.

［8］BORGES J P，MASSON G S，TIBIRICAE，et al.Aerobic interval exercise training induces greater reduction in cardiac workload in the recovery period in rats［J］.Arq Bras Cardiol，2014，102（1）: 47-53.

［9］BROSKEY N T，GREGGIO C，BOSS A，et al.Skeletal muscle mitochondria in the elderly:Effects of physical fitness and exercise training［J］.J Clin Endocrinol Metab，2014，99（5）:1852-1861.

［10］BRUM PC，BACURAUAV，CUNHAT F，et al.Skeletal myopathy in heart failure:effects of aerobic exercise training［J］.Exp Physiol，2014，99（4）:616-620.

［11］CHANDRAMOULI C，VARMAU，STEVENS E M，et al.Myocardial glycogen dynamics:New perspectives on disease mechanisms［J］.ClinExpPharmacolPhysiol，2015，42（4）:415-425.

［12］CHAPLEAU M W.Contributions of skeletal muscle myopathy to heart failure:Novel mechanisms and therapies［J］.Exp Physiol，2014，99（4）:607-608.

［13］COCHRAN A J，PERCIVAL M E，TRICARICO S，et al.Intermittent and continuous high-intensity exercise training induce similar acute but different chronic muscle adaptations［J］.Exp Physiol，2014，99（5）:782-791.

［14］DOEHNER W，GATHERCOLE D，CICOIRAM，et al.Reduced glucose transporter GLUT4 in skeletal muscle predicts insulin resistance in non-diabetic chronic heart failure patients independentlyof bodycomposition［J］.IntJ Cardiol，2010，138（1）:19-24.

［15］FERREIRA J C，ROLIM N P，BARTHOLOMEU J B，et al. Maximal lactate steady state in running mice:Effect of exercise training［J］.ClinExpPharmacolPhysiol，2007，34（8）:760-765.

［16］FRANCH J，ASLESEN R，JENSEN J.Regulation of glycogen synthesis in rat skeletal muscle after glycogen-depleting contractile activity:Effects of adrenaline on glycogen synthesis and activation of glycogen synthase and glycogen phosphorylase［J］.BiochemJ，1999，344（Pt 1）:231-235.

［17］HOYDAL M A，WISLOFF U，KEMI O J，et al.Running speed and maximal oxygen uptake in rats and mice:Practical implications for exercise training［J］.Eur J Cardiovasc Prev Rehabil，2007，14（6）:753-760.

［18］IELLAMO F，MANZI V，CAMINITI G，et al.Validation of rate of perceived exertion-based exercise training in patients with heart failure:Insights from autonomic nervous system adaptations［J］. IntJ Cardiol，2014，176（2）:394-398.

［19］KITZMAN D W，NICKLAS B，KRAUS W E，et al.Skeletal muscle abnormalities and exercise intolerance in older patients with heart failure and preserved ejection fraction［J］.Am J Physiol HeartCircPhysiol，2014，306（9）:H1364-1370.

［20］KOUFAKI P，MERCER T H，GEORGE K P，et al.Low-volume high-intensityintervaltrainingvs continuousaerobiccyclinginpatients with chronic heart failure:A pragmatic randomised clinical trial of feasibility and effectiveness［J］.J Rehabil Med，2014，46（4）:348-356.

［21］MANCINI D，BENAMINOVITZ A，CORDISCO M E，et al. Slowed glycogen utilization enhances exercise endurance in patients with heart failure［J］.JAm Coll Cardiol，1999，34（6）:1807-1812.

［22］MOHOLDTT，AAMOT I L，GRANOIEN I，et al.Aerobic interval training increases peak oxygen uptake more than usual care exercise training in myocardial infarction patients:A randomized controlledstudy［J］.ClinRehabil，2012，26（1）:33-44.

［23］NIELSEN J，ORTENBLAD N.Physiological aspects of the subcellular localization of glycogen in skeletal muscle［J］.Appl PhysiolNutr Metab，2013，38（2）:91-99.

［24］ORTENBLAD N，WESTERBLAD H，NIELSEN J.Muscle glycogen stores and fatigue［J］.J Physiol，2013，591（Pt 18）:4405-4413.

［25］PEAKE J M，TAN S J，MARKWORTH J F，et al.Metabolic and hormonal responses to isoenergetic high-intensity interval exercise and continuous moderate-intensity exercise［J］.Am J Physiol EndocrinolMetab，2014，307（7）:E539-552.

［26］PHILPA，HARGREAVES M，BAAR K.More than a store:Regulatory roles for glycogen in skeletal muscle adaptation to exercise［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2012，302（11）:E1343-1351.

［27］RENGO G，PAGANO G，PARISI V，et al.Changes of plasma norepinephrine and serum N-terminal pro-brain natriuretic peptide after exercise training predict survival in patients with heart failure［J］.IntJ Cardiol，2014，171（3）:384-389.

［28］SYLOW L，KLEINERT M，PEHMOLLER C，et al.Akt and Rac1 signaling are jointly required for insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle and downregulated in insulin resistance［J］.CellSignal，2014，26（2）:323-331.

［29］TABET J Y，MEURIN P，BENZIDI Y，et al.Greater prognostic value of peak VO2 after exercise training program completion in heartfailurepatients［J］.IntJ Cardiol，2013，168（4）:4139-4144.

［30］TURBAN S，BEARDMORE V A，CARR J M，et al.Insulinstimulated glucose uptake does not require p38 mitogen-activated protein kinase in adipose tissue or skeletal muscle［J］.Diabetes，2005，54（11）:3161-3168.

［31］WISLOFF U，STOYLEN A，LOENNECHEN J P，et al.Superior cardiovascular effect of aerobic interval training versus moderate continuous training in heart failure patients:A randomized study［J］.Circulation，2007，115（24）:3086-3094.

The Improvement of Interval and Continuous Aerobic Exercise on Skeletal Muscle Glycogen Metabolism in Rats with Chronic Heart Failure

目的：對比不同有氧運(yùn)動方式（間歇有氧運(yùn)動、持續(xù)有氧運(yùn)動）對慢性心力衰竭（心衰）大鼠不同類型肌纖維糖原代謝的影響及機(jī)制探討。方法：4400只SSDD大鼠隨機(jī)分為心衰安靜組（HHFF--SS）、心衰間歇運(yùn)動組（HHFF--IIEE）、心衰持續(xù)運(yùn)動組（HHFF--CCEE）和假手術(shù)組（SSHHAAMM），每組各1100只。心衰造模采用冠狀動脈結(jié)扎術(shù)。HHFF--IIEE組進(jìn)行 88周高強(qiáng)度間歇跑臺訓(xùn)練，HHFF--CCEE進(jìn)行 88周中等強(qiáng)度持續(xù)跑臺訓(xùn)練。測試指標(biāo)：利用遞增負(fù)荷力竭運(yùn)動實(shí)驗(yàn)測定運(yùn)動耐力（力竭時間），超聲心動圖檢測心臟結(jié)構(gòu)與功能，分離脛骨前?。旒橹鳎┖捅饶眶~肌（慢肌為主），利用AATTPP酶染色法鑒定肌纖維類型分布，蒽酮法測定骨骼肌糖原含量，放射性同位素法測定葡萄糖攝取率以及骨骼肌糖原合酶（GGSS）和糖原磷酸化酶（GGPP）活性，Western BBlloott法測定總GGSS、磷酸化GGSS（ PP--GGSS）、總GGPP以及磷酸化GGPP（ PP--GGPP）蛋白表達(dá)量。結(jié)果：與SSHHAAMM組比較，HHFF--SS組力竭時間、心功能下降（ PP＜ 00..0055），血胰島素升高（ PP＜ 00..0055），比目魚肌和脛骨前肌 II型肌纖維比例減少（ PP＜ 00..0055）， IIII型肌纖維比例增加（ PP＜ 00..0055），肌糖原含量、胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取率和GGSS活性降低（ PP＜ 00..0055），GGPP活性、pp--GGSS蛋白和 PP--GGPP蛋白表達(dá)量升高（ PP＜ 00..0055）。與HHFF--SS組比較，HHFF--CCEE和HHFF--IIEE組力竭時間升高（ PP＜ 00..0055），心功能增強(qiáng)（ PP＜ 00..0055），血胰島素降低（ PP＜ 00..0055），比目魚肌和脛骨前肌 II型肌纖維比例增加（ PP＜ 00..0055）， IIII型肌纖維比例減少（ PP＜ 00..0055），肌糖原含量、胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取率、GGSS活性升高（ PP＜ 00..0055），GGPP活性、 PP--GGSS蛋白和 PP--GGPP蛋白表達(dá)量降低（ PP＜ 00..0055）。與HHFF--CCEE組比較，HHFF--IIEE組力竭時間升高（ PP＜ 00..0055），其他指標(biāo)在兩組間均無顯著性差異（ PP＞ 00..0055）。結(jié)論： 11）長期間歇有氧運(yùn)動和持續(xù)有氧運(yùn)動均能夠抑制心衰大鼠心臟重塑、改善心功能，并增加骨骼肌快肌和慢肌 II型肌纖維含量； 22）運(yùn)動可提高快肌和慢肌糖原含量，其機(jī)制可能與改善胰島素抵抗、增加葡萄糖攝取、促進(jìn)糖原合成、減少糖原分解有關(guān)，且兩種運(yùn)動方式對肌糖原代謝的作用與機(jī)制是等效的； 33）間歇運(yùn)動對于心衰大鼠運(yùn)動耐力的改善作用優(yōu)于持續(xù)運(yùn)動，但心功能、肌糖原的變化以及肌纖維類型轉(zhuǎn)換沒有支持其機(jī)制。

有氧運(yùn)動；間歇運(yùn)動；慢性心力衰竭；骨骼肌；糖原代謝

Objective:To compare the effects of different exercise mode（interval aerobic exercise vs continuous aerobic exercise）on glycogen metabolism of distinct muscle fiber type in rats with heart failure and investigate the possible mechanism.Methods:Forty SD rats were divided into heart failure sedentary（HF-S）group，heart failure interval exercise（HF-IE）group，heart failure continuous（HF-CE）group or sham-operated（SHAM）group and heart failure model was established by coronary artery ligation.Animals in HF-IE group performed an eight weeks high-intensity interval treadmill running while those of HF-CE group conducted moderate-intensity continuous aerobic exercise. Exercise endurance（exhaust duration）was determined by graded exhausted exercise test；cardiac structure and function by echocardiogram；tibialis anterior（mainly fast muscle）as well as soleus muscle（mainly slow muscle）isolated for identification of muscle fiber type distribution by ATPase staining，muscle glycogen content was measured by anthracenone method，glucose uptake rate，activity of glycogen synthase（GS）and glycogen phosphorylase（GP）by radicisotope method，protein expression level of total GS，phospho-GS（p-GS），total GP and phospho-GP（p-GP）by Western Blot.Results:Compared with SHAM group，exhaust duration and cardiac function reduced（P＜0.05），blood insulin raised（P＜0.05），type I muscle fibers decreased while type II increased in tibialis anterior and soleus muscles（P＜0.05），muscle glycogen content，insulin mediated glucose uptake rate and GS activity lowered（P＜0.05），GPactivity，p-GS and p-GPprotein expression heightened（P＜0.05）in HF-S group；compared with HF-S group，exhaust duration and cardiac function improved（P＜0.05），blood insulin reduced（P＜0.05），type I muscle fibers increased while type II decreased in tibialis anterior and soleus muscles（P＜0.05），muscle glycogen content，insulin mediated glucose uptake rate and GS activity heightened（P＜0.05），GPactivity，p-GS and p-GPprotein expression lowered（P＜0.05）in HF-CE and HF-IE group；compared with HF-CE group，exhaust duration increased in HF-IE group（P＜0.05），there was no difference of other indications between groups.Conclusion:1）Both long-term aerobic interval exercise and aerobic continuous exercise inhibited cardiac remodelling，improved cardiac function and promoted switch from II fiber type to I type of fast and slow muscle in rats with heart failure.2）Exercise enhanced glycogen content of fast and slow muscle and the possible mechanism was related to improvement of insulin resistance，augmentation in muscle glucose uptake，increase of glycogen synthesis and decrease of glycogen breakdown，which was equipotent of the two exercise mode on glycogen metabolism and related mechanism.3）Aerobic interval exercise promoted superior improvements in exercise capacity than continuous exercise，which was independence of cardiac function，muscle fiber type switch and muscle glycogenvariation.

aerobic exercise；interval training；chronic heart failure；skeletal muscle；glycogen metabolism

1002-9826（2017）01-0063-10

10.16470/j.csst.201701008

G804.2

：A

2016-04-11；

：2016-11-13

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2014C33262）。

朱榮，女，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動與骨骼肌代謝，E-mail：zhurong@wmu.edu.cn。

溫州醫(yī)科大學(xué)，浙江 溫州 325035

Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.