張銘真,李曉輝,王 袁,楊鐵釗,徐世曉

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002)

81份煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

張銘真,李曉輝,王 袁,楊鐵釗,徐世曉*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院,河南 鄭州 450002)

從250對引物中篩選出64對SSR引物,分析了81份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性。結(jié)果表明：64對SSR引物在81份煙草種質(zhì)材料中共擴增出269個基因位點,觀測雜合度(Ho)平均值為0.3545,預(yù)期雜合度(He)的平均值為0.5425，Shannon’s信息指數(shù)(I=0.997)和Nei’s多樣性指數(shù)(H=0.5391)較高，遺傳分化系數(shù)(Fst=0.1454)較高，基因流(Nm=1.4699)較小，遺傳相似系數(shù)較小(0.53～0.90)。說明81份煙草種質(zhì)的遺傳多樣性較高,居群間的遺傳分化水平較高,大部分位點表現(xiàn)出偏離Hardy-Weinberg平衡,雜合度不足,居群間有較小的基因流。

煙草;種質(zhì)資源;熒光SSR;遺傳多樣性

煙草是我國的一大經(jīng)濟(jì)作物,種植面積較大;但煙草育種面臨親本匱乏、集中,育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄等問題，因此拓寬栽培品種的遺傳基礎(chǔ)是今后穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆煙草新品種育種工作的關(guān)鍵。種質(zhì)資源多樣性高有利于挑選適合新環(huán)境的種類和品種,可為培育適應(yīng)新環(huán)境的新品種提供親本材料[1]。煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性是煙草生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)保障[2]。傳統(tǒng)的煙草育種主要依賴于植物表型選擇和抗性鑒定,育種周期長，經(jīng)驗要求較高,且極易受到病蟲以及氣候條件的限制,選擇效率較低[3]。分子標(biāo)記輔助選擇利用與目標(biāo)性狀相連鎖的分子標(biāo)記，可以對育種材料從DNA水平上進(jìn)行高效選擇。SSR分子標(biāo)記輔助選擇近年來在煙草上得到了較多應(yīng)用，例如：2007年Bindler等[4-5]和Tong等[6]利用SSR標(biāo)記分別在煙草類型間(烤煙與曬煙)和類型內(nèi)(烤煙與烤煙)構(gòu)建了高密度的分子標(biāo)記圖譜; Johnson等[7]利用與烤煙Coker371-Gold中黑脛病抗性基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記對K326進(jìn)行了分子標(biāo)記輔助育種; Moon等[8]利用46對SSR引物分析了54份煙草屬、3種類型材料的遺傳多樣性；童治軍等[9]利用普通煙草(K326)及其2個祖先中基因組序列數(shù)據(jù),探索了基因組SSR位點分布情況,為SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用提供了參考；文軻等[10]利用SSR技術(shù),挖掘了煙草抗CMV基因,并找到了1個與抗性基因遺傳距離較近的分子標(biāo)記。在上述研究的基礎(chǔ)上，我們采用熒光SSR分子標(biāo)記法和ABI-3500xl遺傳分析儀對81份煙草種質(zhì)材料(包括烤煙、曬煙、白肋煙、雪茄煙、香料煙五種類型)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行了檢測，以期確定煙草種質(zhì)材料間的遺傳背景差異,為建立煙草分子標(biāo)記輔助育種體系以及拓寬煙草育種遺傳基礎(chǔ)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

共81份,包含5種煙草類型,分別來自美國、中國、日本、古巴、波蘭等國家;其中烤煙50份,曬煙11份,白肋煙10份,香料煙5份,雪茄煙5份(表1)。將各供試材料的種子播于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗園區(qū)大棚；以品種為單位采集煙草苗期幼嫩葉片于2 mL離心管中,并迅速放入液氮罐中冷凍,帶回實驗室置于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試的煙草種質(zhì)資源材料

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 將采集到的煙草幼葉用液氮冷凍后,置于磨樣機上研磨;待葉片磨碎后用TaKaRa新型植物基因組DNA提取試劑盒[由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)]提取基因組DNA。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后,用紫外分光光度計檢測提取到的DNA的純度與濃度,將其稀釋至10 ng/μL,在-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增與引物篩選 采用Bindler等[4-5]公開發(fā)表的引物及童治軍[12]設(shè)計的SSR引物,引物合成由蘇州金唯智生物有限公司完成。

SSR-PCR反應(yīng)體系為10 μL,包括:2 μL基因組DNA、0.6 μL Mg2+、1 μL 10×Buffer、0.15 μL dNTP、0.1 μL rTaq酶、帶熒光標(biāo)記的M13正向引物0.1 μL、正向引物0.05 μL、反向引物0.15 μL。PCR程序如下:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃模板變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃ 延伸30 s,共30個循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。退火溫度各引物不同。進(jìn)而以不同品種的8個煙草種質(zhì)材料進(jìn)行引物篩選,最終選出條帶清晰、多態(tài)性高的SSR引物，對所有材料進(jìn)行遺傳多樣性分析。

1.2.3 毛細(xì)管電泳檢測及數(shù)據(jù)分析 吸取2 μL PCR產(chǎn)物，將其加入到有6 μL變性劑的384孔板中,95 ℃變性5 min。用ABI-3500xl自動分析儀對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。用Genographer軟件進(jìn)行試驗條帶讀取。在不同位點上將有條帶的記錄為1,無條帶的記為0。根據(jù)分子量大小對擴增結(jié)果讀帶,從大到小依次記為A、B、C、…；只有1條帶的為純合子,記為AA、BB、CC、...;兩條帶的為雜合子,記為AB、BC、AC、…。統(tǒng)計每個引物在不同個體中的擴增情況。利用Popgene 3.2軟件計算遺傳多樣性指標(biāo);用NTSYS-pc Version 2.10e對81份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增與引物篩選結(jié)果

本實驗從250對SSR引物中篩選出64對條帶清晰、雜帶少且多態(tài)性高的引物。圖1為其中部分引物的篩選結(jié)果。

圖1 部分引物篩選結(jié)果

2.2 SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析

由81份煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果(表2)可知：64對SSR引物共檢測出401個基因位點；等位基因數(shù)(Na)的平均值為4.1719個，其中位點TM10912及TM10606的等位基因數(shù)最多，為12個；有效等位基因數(shù)(Ne)的平均值為2.5322個,其中TM10285的有效等位基因數(shù)最少(1.131)，而位點PT30173的有效等位基因數(shù)最多,為6.3208；觀測雜合度(Ho)的變化范圍為0.0123～0.9753,平均值為0.3545;預(yù)期雜合度(He)的變化范圍為0.1166～0.847,平均值為0.5425；平均Nei’s多樣性指數(shù)(H)為0.5391；平均Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.997。不同位點間遺傳參數(shù)存在差別,He的平均值大于0.5,表明煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性較高。

2.3 基于SSR標(biāo)記的煙草遺傳多樣性的聚類分析及主成分分析

根據(jù)64對SSR引物擴增數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,利用NTSYSpc Version 2.10e軟件,采用UPGMA法聚類得到81份煙草種質(zhì)的聚類樹狀圖(見圖2)。在相似系數(shù)(GS)0.643處可劃分為兩個類群，其中豫煙12號與豫煙12號×K346的相似系數(shù)最大,為0.90,遺傳差異較小,親緣關(guān)系較近; Vranjska Jaka與K326的相似系數(shù)最小,為0.53,遺傳差異明顯,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。對81份煙草種質(zhì)材料進(jìn)行基于0、1數(shù)據(jù)矩陣的PCA分析,結(jié)果如圖3所示。根據(jù)位置近則親緣關(guān)系近,位置遠(yuǎn)則親緣關(guān)系遠(yuǎn)的原則[13],將81份煙草種質(zhì)材料劃分為3個類群，其中類群a包含11份種質(zhì),其中有2份烤煙種質(zhì);類群b共有12份煙草種質(zhì),都為晾曬煙類型;類型c共有58份煙草種質(zhì),其中包括10份晾曬煙種質(zhì)、48份烤煙類型種質(zhì)。

2.4 煙草種質(zhì)的遺傳分化

由81份煙草種質(zhì)的遺傳分化結(jié)果(見表3)可知：其遺傳分化系數(shù)(Fst)的變化范圍為0.015～0.5398,平均值為0.1454,即有14.54%的遺傳變異存在于居群間,85.46%的變異存在于居群內(nèi)。煙草居群間的基因流(Nm)的變化范圍為0.2131～16.4481,平均值為1.4699,基因流較小,表明居群間的基因交流程度較弱,以TM10051位點的基因流最大。居群內(nèi)偏離H-W平衡的程度(Fis)為-1～1,其中以PT30186位點的Fis值最高,說明該位點在各居群內(nèi)偏離H-W平衡的程度最大,純合度高;以TM10081及TM10286位點的Fis值最低,說明這2個位點偏離H-W平衡的程度最小,雜合度偏高;偏離H-W平衡的程度的平均值為0.2,多數(shù)位點表現(xiàn)為純合度偏高?？偩尤浩xH-W平衡的程度(Fit)為-0.809～0.984,其中以PT30186位點的Fit值最大,表明該位點在總居群純合度偏高;以TM10268位點的Fit值最小,表明該位點雜合度偏高。Fit的平均值為0.3411,說明總居群雜合子較少。

2.5 居群間遺傳距離、遺傳一致度及不同居群UPGMA聚類分析

為了進(jìn)一步分析煙草種質(zhì)資源居群間的遺傳關(guān)系,根據(jù)煙草種質(zhì)類型，將其分為5個居群,即烤煙、曬煙、白肋煙、香料煙、雪茄煙類型。計算了5個居群間的遺傳距離(GD)和遺傳一致度(GI),結(jié)果(表4)表明：烤煙與曬煙的遺傳距離最高(0.2946),遺傳一致度最低，為0.7448;香料煙與曬煙2個居群的遺傳距離最小(0.1533),遺傳一致度最高，為0.8579。

表2 煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性

圖2 81份煙草種質(zhì)材料SSR標(biāo)記遺傳相似(GS)聚類圖

引物名稱FisFitFstNm引物名稱FisFitFstNmTM100040.72030.73400.04884.8717PT13990.34660.44680.15331.3805TM100510.16700.17950.015016.4481PT30188-0.1127-0.01610.08682.6305TM100530.83930.84810.05534.2676PT30248-0.5491-0.44050.07013.3167TM10081-0.5876-0.55050.023410.4325PT302350.52510.58700.13041.6674TM101750.07500.20410.13951.5415PT20291-0.5518-0.27340.17941.1437TM101020.68900.75200.20240.9853TM105190.41630.56160.24880.7547TM101400.48110.51920.07343.1552TM105300.87780.89480.13901.5489TM10268-0.8383-0.8090.015915.4603TM104010.60910.66500.14301.4977TM10285-0.1591-0.08820.06123.8375PT203760.55530.57930.05404.3790TM102790.20040.23820.04735.0336PT30123-0.1383-0.03010.09512.3798TM103200.94290.95270.17151.2079PT30173-0.1800-0.09060.07583.0500PT541500.84270.87250.18941.0696TM10620-0.5538-0.46280.05864.0179PT203820.64780.68630.10922.0388PT400350.19230.28050.10922.0393TM101790.55380.64710.20910.9457PT301300.27480.33630.08482.6987TM102110.57870.66760.21100.9351PT30245-0.3282-0.23570.06973.3383TM101450.78500.90100.53980.2131PT301560.69340.73950.15031.4131PT303800.75100.86640.46350.2894TM108460.21650.33350.14921.4250PT519260.63490.71620.22280.8721TM108540.90670.92130.15641.3484PT304730.83040.87100.23930.7947TM109120.08320.19110.11761.8754PT301380.73350.78110.17871.1489PT1154-0.3788-0.23720.10272.1840TM101420.40770.47110.10712.0845TM105740.25130.39290.18921.0717TM10255-0.2802-0.18380.07533.0695TM105850.46570.60350.25780.7197TM102470.63530.66070.06963.3442TM109870.73010.79430.23800.8003PT1085-0.2051-0.11740.07273.1867PT300310.41320.50300.15311.3827PT301860.97690.98400.30810.5615PT30036-0.3341-0.27090.04735.0310PT204590.70770.75380.15751.3370PT301710.59760.65550.14391.4870PT302720.56470.64560.18591.0949PT20196-0.2480-0.01230.18891.0736PT202340.55450.69750.32100.5289TM106060.49950.60360.20810.9514PT10466-0.0814-0.02030.05654.1712TM106970.29690.49930.28790.6185PT400050.55630.58880.07323.1650TM11073-0.11280.02810.12661.7245PT202860.59570.64800.12941.6827PT400240.53110.67260.30180.5784PT20211-0.13150.03220.14461.4784PT30231-0.2341-0.20420.024210.0787平均值0.22900.34110.14541.4699

圖3 81份煙草種質(zhì)材料的二維主成分分析結(jié)果

品種烤煙曬煙白肋煙香料煙雪茄煙烤煙0.74480.78890.76220.7573曬煙0.29460.78490.85790.8501白肋煙0.23710.24220.77160.8014香料煙0.27160.15330.25930.8272雪茄煙0.27810.16240.22140.1897

注：表中右上三角數(shù)據(jù)為遺傳一致度，左下三角數(shù)據(jù)為遺傳距離。

根據(jù)DNA擴增統(tǒng)計結(jié)果,采用POPGEN 1.31軟件計算出5個居群的遺傳一致度分布在0.7448～0.8579之間。遺傳聚類圖(圖4)顯示：白肋煙與烤煙聚在一起,這兩類居群的遺傳距離較近；香料煙、曬煙及雪茄煙居群聚集在一起,香料煙與曬煙居群的遺傳距離較近。

圖4 基于遺傳一致度的5個居群的UPGMA聚類圖

3 討論與結(jié)論

3.1 煙草種質(zhì)的遺傳多樣性

遺傳多樣性是指種內(nèi)不同群體和個體間的遺傳多態(tài)性程度,即指種內(nèi)基因的變化,包括種內(nèi)顯著不同的居群間和同一居群內(nèi)的遺傳變異[14]。本研究中81份煙草種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.53～0.90,烤煙種質(zhì)內(nèi)遺傳差異較小,相似性較高,這與以往的研究結(jié)果[15-17]一致。分析其原因,主要為：煙草親本集中,由各個主體親本直接或者間接育成的品種占育成品種總數(shù)的97%以上[18],地方種質(zhì)及特異種質(zhì)在育種中所占比例較小,從而造成烤煙種質(zhì)內(nèi)遺傳背景狹窄；另外,人為選擇壓力使得一些多樣化性狀丟失。本研究的聚類結(jié)果顯示,各個國家的煙草種質(zhì)交織在一起,并沒有以種質(zhì)的地理因素聚類,說明煙草種質(zhì)的遺傳分類與地理因素關(guān)系不大,主要與種質(zhì)的親緣關(guān)系有關(guān)，這與肖炳光等[19]的研究結(jié)果類似。世界主產(chǎn)煙國家的煙草育種基本上是在美國早期育成品種的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,而我國煙草育種也主要利用從美國引進(jìn)的優(yōu)質(zhì)多抗品種作為親本選育品種,故而地理因素對煙草種質(zhì)遺傳多樣性差異的影響不大。

3.2 不同煙草類型種質(zhì)間的遺傳分化

本研究結(jié)果顯示，5個煙草類型種質(zhì)間的遺傳相似性范圍在0.7448～0.8579之間,曬煙、香料煙、雪茄煙居群之間的遺傳距離較小，這3個居群聚為一類,而白肋煙與烤煙居群聚為另一類。該結(jié)果表明,種質(zhì)間的遺傳差異不完全取決于栽培類型間的差異,而與種質(zhì)演化有關(guān)[20]。不同栽培類型的煙草種質(zhì),主要因調(diào)制方式不同導(dǎo)致化學(xué)性質(zhì)有所差異,但是在基因組水平上差異較小。Ren等[21]利用AFLP標(biāo)記分析了煙草屬種內(nèi)種間的遺傳變異程度,聚類分析時同一類群包含不同類型的煙草品種。在本研究中，81份煙草種質(zhì)資源的遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi),且居群間的基因流較小。由于人為劃分煙草類型,不同類型煙草種質(zhì)間較少雜交,故而基因流較小。多數(shù)位點表現(xiàn)偏離H-W平衡,H-W平衡可以用來反映交配系統(tǒng)對基因型頻率的影響程度[22]。煙草種質(zhì)資源大部分位點均表現(xiàn)為偏離H-W平衡,雜合度不足,純合體所占比例較高。因此，在以后的育種工作中,應(yīng)當(dāng)多利用類群間遺傳差異大的親本進(jìn)行雜交,既能夠提高煙草不同類型居群間的基因流,也能夠充分利用雜交優(yōu)勢,選育更多優(yōu)質(zhì)、抗病的煙草新品種。

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(責(zé)任編輯:黃榮華)

Analysis of Genetic Diversity of 81 Tobacco Germplasm Resources

ZHANG Ming-zhen, LI Xiao-hui, WANG Yuan, YANG Tie-zhao, XU Shi-xiao*

(College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The genetic diversities of 81 tobacco germplasm resources were analyzed by using 64 pairs of polymorphic SSR primers screened from 250 pairs of SSR primers. The results revealed that a total of 269 genetic loci were amplified in 81 tobacco materials through 64 pairs of polymorphic SSR primers. The average observed heterozygosity (Ho) was 0.3545 per primer pair, and the average expected heterozygosity (He) was 0.5425 per primer pair. The Shannon’s information index (I=0.997), Nei’s diversity index (H=0.5391) and genetic differentiation coefficient (Fst=0.1454) were relatively high, while the gene flow (Nm=1.4699) and genetic similarity coefficient (0.53～0.90) were relatively low. The above results indicated that the genetic diversities of 81 tobacco germplasm resources were relatively high, the genetic differentiation level among different populations was relatively high, most loci seriously deviated from Hardy-Weinberg equilibrium, their heterozygosity was low, and the gene flow among different populations was less.

Tobacco; Germplasm resources; Fluorescent SSR marker; Genetic diversity

2016-08-05

中國煙草總公司重大項目“高抗根結(jié)線蟲病優(yōu)質(zhì)烤煙新品種選育”(110201402004)。

張銘真(1992─),女,研究生，從事煙草研究工作。*通訊作者:徐世曉。

S572.024

A

1001-8581(2017)01-0062-07