阮 濤，曹一丁，劉貝貝，楊 睿，展寶睿，張士堯，馬 龍，翟 蓉，楊忠華*

(1.武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢430081；2.武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

綠木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表達(dá)

阮 濤1，曹一丁1，劉貝貝1，楊 睿1，展寶睿1，張士堯1，馬 龍1，翟 蓉2，楊忠華1*

(1.武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 武漢430081；2.武漢東湖學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430212)

以前期分離篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶菌株TrichodermavirensZY-01的總RNA為模板合成cDNA，經(jīng)PCR克隆得到外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase,CBH)Ⅰ基因；并構(gòu)建了pET-32a-cbh1表達(dá)載體，通過轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中，獲得CBH Ⅰ重組表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)出可溶性CBH Ⅰ蛋白。結(jié)果表明，TrichodermavirensZY-01 CBH Ⅰ堿基序列與TrichodermavirideAS 3.3711 CBHⅠ基因(GenBank：AY368686.1)序列相似度高達(dá)91.95%，氨基酸同源性高達(dá)99.22%；通過SDS-PAGE檢測(cè)，表明該基因在E.coli中得到可溶性表達(dá)，分子量約為53 kDa，與基因翻譯出的氨基酸序列相一致。該研究為CBH Ⅰ基因的工程化及應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

綠木霉；纖維素酶；外切葡聚糖酶；CBH Ⅰ基因；基因重組；原核表達(dá)

纖維素廣泛存在于植物殘?bào)w中，是一種重要的可再生資源，隨著農(nóng)業(yè)的發(fā)展，秸稈類是纖維素生物質(zhì)的主要來源之一。然而在我國(guó)，大多數(shù)秸稈被直接焚燒處理，不僅浪費(fèi)了大量資源，也污染了環(huán)境，若加以有效利用，不僅能有效解決資源問題，也能幫助我們解決大氣污染的問題[1]。纖維素酶是用來水解纖維素的一類復(fù)合酶，主要包括外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase，CBH)、內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。然而，天然纖維素酶的酶活及產(chǎn)量較低等因素限制了纖維素酶的大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。

CBH是降解天然纖維素的主要組分，屬于水解酶第七家族，是存在于真菌中的組成型纖維素酶，主要作用于結(jié)晶纖維素，能從纖維素鏈的非還原末端水解β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖單位，在打開纖維素天然晶體的結(jié)構(gòu)中起到重要作用。因此國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)CBH進(jìn)行了大量的研究，大多在真核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)。如張煜等[2]將TrichodermareeseiCBH Ⅱ基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)；黃時(shí)海等[3]克隆了TrichodermakoningiiCBH Ⅰ基因，并在畢赤酵母中成功表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物酶活24.1 U·L-1；劉澤寰等[4]從綠木霉中克隆得到CBH Ⅱ基因，并在釀酒酵母中成功表達(dá)，培養(yǎng)液中表達(dá)產(chǎn)物的酶活可達(dá)7.7 U·mL-1；Godbole 等[5]將里氏木霉中的CBH Ⅰ基因進(jìn)行了克隆，并在畢赤酵母中成功表達(dá)；丁新麗等[6]構(gòu)建了能夠同時(shí)表達(dá)CBH Ⅰ和EG Ⅰ基因的重組酵母工程菌。而隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，已有80多種纖維素酶的相關(guān)基因被克隆，大多數(shù)都可在E.coli中進(jìn)行原核表達(dá)[7-8]。

綠木霉是高效的纖維素酶產(chǎn)生菌之一。作者從實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的高產(chǎn)纖維素酶菌株TrichodermavirensZY-01中克隆出CBH Ⅰ基因，并將其轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行原核表達(dá)，為構(gòu)建高效纖維素酶工程菌株提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

綠木霉(Trichodermavirens)ZY-01由本實(shí)驗(yàn)室篩選保存，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC No：M 2012205)?？寺【鶨.coliDH5α、表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)、表達(dá)載體質(zhì)粒pET-32a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

RNAprep Pure Plant Kit 植物總RNA提取試劑盒、T4DNA連接酶、DNA Marker，Tiangen公司；Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，F(xiàn)ermentas公司；ePfu mix、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，武漢川流生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、SalⅠ(HF)及相關(guān)試劑，NEB公司。

LB培養(yǎng)基主要用于篩選、誘導(dǎo)過程中E.coli的培養(yǎng)。SOB培養(yǎng)基主要用于Inoue法制備E.coli超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1T.virensZY-01總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

根據(jù)RNAprep Pure Plant Kit 植物總RNA提取試劑盒說明書提取T.virensZY-01的總RNA。以總RNA為模板，根據(jù)Revert Aid First strand cDNA synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-70 ℃，用作PCR模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的與綠木霉(T.virens) ZY-01 CBH Ⅰ同種屬菌含有的CBH Ⅰ基因序列信息，以及質(zhì)粒pET-32a上的多克隆酶切位點(diǎn)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。引物序列分別為：

正向引物：5′-CCGCTCGAGTTACAGGCACTGAGAGTAGT-3′(下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn))；

反向引物：5′-ACGCGTCGACATGTATCGGAAGTTGGCCGT-3′(下劃線部分為SalⅠ 酶切位點(diǎn))。

1.2.3 CBH Ⅰ 基因的擴(kuò)增

以cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出CBH Ⅰ基因片段。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，64 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行回收和純化，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)回收和純化效果，并保存于-20 ℃用于后續(xù)操作。1.2.4 重組質(zhì)粒pET-32a-cbh1的構(gòu)建及測(cè)序鑒定使用質(zhì)粒快速提取試劑盒提取質(zhì)粒pET-32a，采用Inoue法制備E.coli超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞。將回收純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pET-32a分別用XhoⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切后，膠回收并純化。將CBH Ⅰ基因與載體pET-32a經(jīng)T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜后，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α，利用LB/Amp100抗性平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。培養(yǎng)并利用質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖刑崛≠|(zhì)粒。

通過對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序使用的pET-32a通用引物序列為：正向引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；反向引物：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′。測(cè)序結(jié)果與TrichodermavirideAS 3.3711 CBH Ⅰ基因(GenBank：AY368686.1)進(jìn)行堿基序列及氨基酸序列比對(duì)，并根據(jù)軟件分析得到目的基因表達(dá)出的蛋白理論大小。

1.2.5 目標(biāo)蛋白在E.coliBL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET-32a-cbh1用熱激法導(dǎo)入表達(dá)菌E.coliBL21(DE3)中，挑取陽性菌落至LB/Amp100液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h。待OD600為0.4～0.6時(shí)，降溫至30 ℃，加入IPTG誘導(dǎo)CBH Ⅰ基因的表達(dá)。IPTG終濃度0.5 mmol·L-1，誘導(dǎo)時(shí)間6 h，誘導(dǎo)溫度30 ℃。12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖液對(duì)菌體進(jìn)行重懸，反復(fù)凍融后，進(jìn)行超聲破胞，破胞后于4 ℃、10 000 r·min-1離心，收集上清液和沉淀，分別加入50 μL 1×蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置對(duì)照組如下：

實(shí)驗(yàn)組：重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，加IPTG誘導(dǎo)。

對(duì)照組1：導(dǎo)入質(zhì)粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG誘導(dǎo)。

對(duì)照組2：不含質(zhì)粒pET-32a的E.coliBL21(DE3)，加IPTG誘導(dǎo)。

對(duì)照組3：重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，不加IPTG誘導(dǎo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 T.virens ZY-01總RNA的提取

T.virensZY-01總RNA提取產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.RNA提取產(chǎn)物圖1 RNA提取產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophorogram of RNA extraction

從圖1可以看出，28 s亮度是18 s的兩倍，表明成功提取出總RNA。

2.2 PCR擴(kuò)增CBH Ⅰ基因

以T.virensZY-01的總RNA為模板，通過RT-PCR得到cDNA，再以cDNA為模板克隆得到目的基因CBH Ⅰ，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物回收純化后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.PCR產(chǎn)物圖2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由圖2可以看出，目的條帶大小約1 700 bp，與GenBank公布的CBH Ⅰ基因大小(1 746 bp)基本相符，說明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

2.3 重組質(zhì)粒pET-32a-cbh1的構(gòu)建

分別對(duì)PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET-32a進(jìn)行XhoⅠ和SalⅠ雙酶切，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選后，將陽性轉(zhuǎn)化子于含Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，利用XhoⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。

M.DL5000 markerⅢ 1.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物圖3 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophorogram of recombinant plasmid products by double digestion

由圖3可以看出，圖中出現(xiàn)大小約為1 700 bp和5 900 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，表明重組質(zhì)粒pET-32a-cbh1構(gòu)建成功。

2.4 重組質(zhì)粒pET-32a-cbh1的測(cè)序鑒定

T.virensZY-01 CBH Ⅰ與T.virideAS 3.3711 CHB Ⅰ基因的堿基序列比對(duì)結(jié)果如圖4所示，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果如圖5所示。

圖4 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ與T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ堿基序列比對(duì)結(jié)果Fig.4 CBH Ⅰ gene base sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

圖4比對(duì)結(jié)果表明，T.virensZY-01 CBHⅠ基因與T.virideAS 3.3711 CBHⅠ基因的堿基序列的相似度高達(dá)91.95%。與T.virideAS 3.3711堿基序列相比，T.virensZY-01 CBH Ⅰ基因的序列中有4個(gè)堿基突變，分別為C突變?yōu)門、G突變?yōu)锳、G突變?yōu)锳、G突變?yōu)锳，并且顯示有兩段內(nèi)含子序列，可能是因?yàn)镽NA模板存放時(shí)間較長(zhǎng)，或?qū)嶒?yàn)前沒有加入DNAase進(jìn)行消化，導(dǎo)致模板中混入了基因組DNA。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，分析CBH Ⅰ蛋白分子量約為53 kDa，編碼513個(gè)氨基酸，與T.virideAS 3.3711編碼的514個(gè)氨基酸相比，有4個(gè)編碼氨基酸不同(甘氨酸突變?yōu)楣劝彼?，天冬氨酸突變?yōu)樘於０?，脯氨酸突變?yōu)榫彼?，還有一個(gè)氨基酸缺失)，同源性高達(dá)99.22%(圖5)。此結(jié)果進(jìn)一步說明成功克隆出CBH Ⅰ基因。

圖5 T.virens ZY-01 CBH Ⅰ與T.viride AS 3.3711 CBH Ⅰ氨基酸序列比對(duì)結(jié)果Fig.5 Amino acid sequence alignment results ofT.virens ZY-01 and T.viride AS 3.3711

2.5 目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及分子量鑒定

分別對(duì)重組菌菌體總蛋白、破胞后的上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖6、圖7。

M.protein marker 1.對(duì)照組1 2.對(duì)照組2 3.對(duì)照組3 4.實(shí)驗(yàn)組

圖6 菌體總蛋白SDS-PAGE電泳

Fig.6 SDS-PAGE electrophorogram of total bacterial protein

從圖6可以看出，全蛋白中有約為53 kDa的蛋白條帶。

M.protein marker 1.對(duì)照組1沉淀 2.對(duì)照組2沉淀 3.對(duì)照組3沉淀 4.實(shí)驗(yàn)組沉淀 5.對(duì)照組1上清液 6.對(duì)照組2上清液 7.對(duì)照組3上清液 8.實(shí)驗(yàn)組上清液

圖7 CBH Ⅰ蛋白的SDS-PAGE電泳

Fig.7 SDS-PAGE electrophorogram of CBH Ⅰ protein

從圖7可以看出，破胞上清液及沉淀中均有53 kDa的蛋白條帶，這與利用DNA測(cè)序預(yù)測(cè)的蛋白分子量相符合，說明CBH Ⅰ基因成功在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)，一部分為可溶性蛋白，一部分可能以包涵體的形式存在。

2.6 討論

到目前為止，人們已從近百個(gè)物種中克隆到纖維素酶基因，主要來自細(xì)菌和真菌[9]，而大多數(shù)真菌都能夠合成纖維素酶，綠木霉就是木霉屬中纖維素酶表達(dá)量較高的菌株之一。纖維素酶作為生物降解纖維素過程中的一個(gè)復(fù)合酶，其組分相互協(xié)作，有序作用，各組分的比例由微生物內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行調(diào)控[1]。因此，將產(chǎn)纖維素酶菌株中某種纖維素酶單一組分的基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，對(duì)研究纖維素酶降解纖維素的機(jī)制以及尋找合適纖維素酶的組合比例有重要的意義。

考慮到真核基因在原核中表達(dá)普遍存在表達(dá)量低的現(xiàn)象，所以本研究利用具有T7 lac強(qiáng)啟動(dòng)子的pET-32a質(zhì)粒作為表達(dá)載體，克隆T.virensZY-01中的CBH Ⅰ基因，并在E.coliBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)在破胞后的上清液和沉淀中均有目標(biāo)蛋白條帶，可能是因?yàn)檎婧嘶蛟谠酥斜磉_(dá)時(shí)一部分蛋白以包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)。該蛋白的酶學(xué)性質(zhì)，探究pH值、溫度、金屬離子種類及濃度等對(duì)酶催化效率的影響，優(yōu)化蛋白表達(dá)的條件，提高蛋白表達(dá)量以及更換為真核表達(dá)系統(tǒng)的工作還在進(jìn)一步研究之中。

3 結(jié)論

成功克隆得到了綠木霉(T.virens) ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因，其開放閱讀框?yàn)? 700 bp，編碼513個(gè)氨基酸，與GenBank編號(hào)為AY368686.1的T.virideAS 3.3711 CBH Ⅰ 基因進(jìn)行序列比對(duì)，其堿基序列相似度為91.95%，氨基酸序列的同源性高達(dá)99.22%。同時(shí)，利用pET-32a質(zhì)粒構(gòu)建了重組菌E.coliBL21(DE3)(pET-32a-cbh1)，使目的基因CBH Ⅰ得以在E.coliBL21(DE3)中初步表達(dá)，對(duì)破胞前菌體總蛋白和破胞后的上清液、沉淀分別進(jìn)行了SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示，目的蛋白CBH Ⅰ是胞內(nèi)蛋白，并且一部分以可溶性蛋白的方式存在于菌體內(nèi)，還有一部分可能以包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，其蛋白分子量約為53 kDa。

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Cloning of CBH Ⅰ Gene fromTrichodermavirensZY-01 and Its Expression inE.coli

RUAN Tao1，CAO Yi-ding1，LIU Bei-bei1,YANG Rui1，ZHAN Bao-rui1，ZHANG Shi-yao1，MA Long1,ZHAI Rong2,YANG Zhong-hua1*

(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430081,China；2.CellegeofLifeScienceandChemistry,WuhanDonghuUniversity,Wuhan430212,China)

CBHⅠgenewasclonedbyPCRwithsyntheticcDNAusingthetotalRNAofTrichoderma virensZY-01,whichisahigh-yieldcellulasestrainandscreenedinourpreviouswork,asatemplate.TheexpressionvectorpET-32a-cbh1wasconstructedandtransformedintoE.coliBL21(DE3)toobtaintheCBHⅠrecombinantexpressionsystem.AndthesolubleCBHⅠproteinwassuccessfullyexpressed.Theresultsshowedthat,thebasesequencesimilarityofCBHⅠtoTrichoderma virideAS3.3711CBHIgene(GenBank:AY368686.1)wasashighas91.95%andtheaminoacidhomologywas99.22%.TheresultofSDS-PAGEindicatedthattheexpressedproteinwassolubleinE.coliandhadamolecularweightofabout53kDa,whichwasconsistentwiththeaminoacidsequencetranslatedfromthegene.ThisworkprovidesthebasisfortheindustrialapplicationofcellobiohydrolaseCBHⅠgene.

Trichoderma virens;cellulase;cellobiohydrolase;CBHⅠgene;generecombination;prokaryoticexpression

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21376184)，教育部回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目，湖北省教育廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目(D20121108)，生物強(qiáng)化技術(shù)與新進(jìn)冶金工業(yè)廢水創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

Q 786 Q 556.5

A

1672-5425(2017)01-0027-05

阮濤，曹一丁，劉貝貝，等.綠木霉ZY-01的外切葡聚糖酶CBH Ⅰ基因的克隆及在E.coli中的表達(dá)[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(1)：27-31.