汪鐵林，張志忍，王成成，王為國，王存文

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430073)

模擬微重力與普通環(huán)境下小球藻耐酚性能比較與馴化研究

汪鐵林，張志忍，王成成，王為國，王存文

(武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430073)

為探究小球藻在普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下對(duì)苯酚耐受性能的變化幅度以及馴化培養(yǎng)對(duì)小球藻耐酚及降酚能力的影響，從而明確在微重力環(huán)境下利用含酚廢水大規(guī)模培養(yǎng)小球藻的可行性，比較了小球藻在普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下的耐酚與降酚能力，并對(duì)其進(jìn)行了馴化培養(yǎng)。結(jié)果表明，普通環(huán)境下小球藻最大苯酚耐受濃度為600 mg·L-1，而在模擬微重力環(huán)境下的最大苯酚耐受濃度提高到700 mg·L-1，且苯酚完全降解所需時(shí)間也明顯縮短。通過馴化培養(yǎng)得到的小球藻耐酚性能提高，馴化后的小球藻在普通環(huán)境下最大苯酚耐受濃度為800 mg·L-1，在模擬微重力環(huán)境下最大苯酚耐受濃度達(dá)1 000 mg·L-1，同時(shí)小球藻在模擬微重力環(huán)境下降酚能力也顯著提高。

模擬微重力；小球藻；苯酚；馴化

苯酚及其衍生物是水體中最常見的有機(jī)污染物之一，主要來源于煉油、農(nóng)藥、印染以及酚醛樹脂等工業(yè)廢水[1-4]，對(duì)人體、動(dòng)植物以及微生物均有毒害作用。目前，對(duì)含酚廢水的處理主要有吸附、萃取、離子交換等物理化學(xué)法和生物降解法，相對(duì)于前者，生物降解法由于具有成本低、操作簡(jiǎn)便、不造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)而得到了廣泛應(yīng)用[5-8]。雖然苯酚對(duì)生物的生長具有一定毒害作用，但有一些生物卻對(duì)苯酚表現(xiàn)出一定耐受性并可將酚類物質(zhì)加以降解[9]，如某些細(xì)菌[10]、真菌[11]、酵母[12]以及微藻[13]均表現(xiàn)出一定的耐酚能力。

微藻生物質(zhì)由于具有光合作用效率高、油脂含量高、生長周期短、生長速度快、生態(tài)分布廣、不占耕地等優(yōu)勢(shì)，作為生物質(zhì)能源原料倍受關(guān)注。采用含酚廢水培養(yǎng)富油微藻，一方面利于環(huán)境保護(hù)，另一方面可以收獲生物質(zhì)能源原料。而苯酚分子的疏水作用會(huì)破壞微藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致微藻生長受到抑制，因此關(guān)于耐酚藻種的篩選與馴化是利用微藻降解含酚廢水的關(guān)鍵[1]。雖然多種微藻均能在含酚溶液中生長，但僅有Chlorellaspp.、Scenedesmus obliquus 和 Spirulina maxima等數(shù)種微藻對(duì)苯酚具有良好的降解能力[14-16]，且經(jīng)過馴化后的微藻對(duì)苯酚的耐受和降解能力均能得到較大幅度的提高[5]。

微重力環(huán)境可能會(huì)對(duì)輪藻、杜氏鹽藻等微藻的代謝、發(fā)育、生殖、衰老等生理生化過程產(chǎn)生影響，使微藻的生長加快[17-19]。太空飛行和地面回轉(zhuǎn)器的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，微重力改變了微藻機(jī)體與介質(zhì)環(huán)境的相互聯(lián)系，從而影響微藻的代謝。為探索在微重力環(huán)境下利用含酚廢水高密度、短耗時(shí)的大規(guī)模培養(yǎng)微藻的可行性，作者以小球藻為研究對(duì)象，比較了在普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下小球藻的耐酚與降酚能力，并對(duì)小球藻進(jìn)行了耐酚馴化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中使用的藻種為小球藻(Chlorellasp.)，其編號(hào)為FACHB-9，由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。采用BG-11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。所用試劑均為分析純。

UV-6000型紫外可見分光光度儀，上海元析儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，美國Synthecon INC公司；LRH-300-GSIT型二氧化碳人工氣候箱，上海銀澤儀器設(shè)備有限公司；托馬細(xì)胞計(jì)數(shù)器，上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養(yǎng)

用經(jīng)過高壓滅菌后的BG-11培養(yǎng)基將處于成熟期的小球藻藻液稀釋10倍，再將藻液均分為多個(gè)組別，分別向其中添加不同濃度苯酚后用于實(shí)驗(yàn)。

將預(yù)處理后含不同濃度苯酚的藻液分別注入RCCS的回轉(zhuǎn)器中作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將等體積藻液注入100 mL錐形瓶中作為對(duì)照組。將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組置于人工氣候箱中培養(yǎng)，每24 h測(cè)定一次細(xì)胞密度和苯酚濃度。

根據(jù)初次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別在普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下對(duì)小球藻進(jìn)行耐酚馴化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

以上實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件均為：溫度(25±2) ℃、冷白熒光光照強(qiáng)度4 000 lx·cm-2、光照時(shí)間比12 h∶12 h。

1.2.2 苯酚濃度的測(cè)定

采用4-氨基安替比林顯色法[20]測(cè)定苯酚濃度。

1.2.3 苯酚降解率的計(jì)算

測(cè)定苯酚濃度后，按式(1)計(jì)算特定時(shí)間內(nèi)的苯酚降解率。

(1)

式中：D為苯酚降解率；ct、c0分別為時(shí)間t時(shí)刻和起始時(shí)刻的苯酚濃度，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 普通環(huán)境下苯酚對(duì)小球藻生長的影響

研究表明，在普通環(huán)境下未馴化的小球藻的最大苯酚耐受濃度為600mg·L-1，并且苯酚濃度為100～200mg·L-1時(shí)，苯酚對(duì)小球藻的生長起到輕微的刺激作用[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)在普通環(huán)境下分別在培養(yǎng)基中添加濃度為0～600mg·L-1的苯酚對(duì)小球藻進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 普通環(huán)境下小球藻在含不同濃度苯酚 培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with differentconcentrations of phenol under general condition

由圖1可知,當(dāng)苯酚濃度低于600 mg· L-1時(shí)，小球藻能正常生長，生長前2 d為適應(yīng)期，生長速度緩慢。相對(duì)于對(duì)照組，苯酚濃度為200 mg· L-1時(shí)，小球藻的生長表現(xiàn)出輕微的刺激作用，在第4 d時(shí)生物量超過對(duì)照組，這與文獻(xiàn)[5]報(bào)道結(jié)果基本一致。隨著苯酚濃度的增大，小球藻的生長速度逐漸減緩。當(dāng)苯酚濃度過高，達(dá)到600 mg· L-1時(shí)，小球藻細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)迅速減少，直至生長停止，藻細(xì)胞全部死亡。

圖2 普通環(huán)境下小球藻培養(yǎng)液中苯酚濃度的變化Fig.2 Phenol concentration changes of Chlorella sp. culture medium under general condition

由圖2可知，當(dāng)苯酚濃度低于600 mg· L-1時(shí)，培養(yǎng)基中的苯酚均能在9 d內(nèi)被小球藻幾乎完全降解。值得指出的是，在長時(shí)間觀測(cè)過程中由于苯酚揮發(fā)擴(kuò)散到空氣中從而導(dǎo)致其濃度下降，但考慮到在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)苯酚揮發(fā)量相對(duì)于生物降解量較小，因此在本實(shí)驗(yàn)中未考慮自然揮發(fā)的苯酚量。

2.2 模擬微重力環(huán)境下苯酚對(duì)小球藻生長的影響

研究表明，在微重力環(huán)境下，植物細(xì)胞的生長代謝、形態(tài)結(jié)構(gòu)等多種特性均會(huì)發(fā)生改變，尤其是藻細(xì)胞的生長速率會(huì)明顯加快[21]。圖3為模擬微重力環(huán)境下小球藻在含不同濃度苯酚培養(yǎng)基中的生長曲線。

圖3 模擬微重力環(huán)境下小球藻在含不同 濃度苯酚培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.3 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

由圖3可知，與普通環(huán)境相比，在模擬微重力環(huán)境下小球藻對(duì)苯酚的耐受性明顯提高，小球藻的最大耐受苯酚濃度由600 mg·L-1提高到700 mg·L-1，說明微重力環(huán)境對(duì)小球藻的耐酚能力起到了促進(jìn)作用。

圖4為模擬微重力環(huán)境下小球藻培養(yǎng)液中苯酚濃度的變化。

圖4 模擬微重力環(huán)境下小球藻培養(yǎng)液中苯酚濃度的變化Fig.4 Phenol concentration changes of Chlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

由圖4可知，模擬微重力環(huán)境對(duì)小球藻的苯酚降解速率也產(chǎn)生了明顯的影響，培養(yǎng)液中不同濃度的苯酚被完全降解所需時(shí)間比在普通環(huán)境下明顯縮短。當(dāng)苯酚濃度為500 mg·L-1時(shí)，完全降解時(shí)間由普通環(huán)境下的9 d縮短為模擬微重力環(huán)境下的6 d。原因可能是，模擬微重力環(huán)境下小球藻生長代謝加快，培養(yǎng)液中碳源消耗加速，從而加快苯酚的降解。

2.3 不同環(huán)境下苯酚對(duì)馴化后小球藻生長的影響

為探究馴化過程對(duì)小球藻耐酚及降酚能力的影響，根據(jù)初次培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)小球藻進(jìn)行了耐酚馴化培養(yǎng)。分別對(duì)初次實(shí)驗(yàn)中普通環(huán)境下苯酚濃度為400 mg·L-1及微重力環(huán)境下苯酚濃度為500 mg·L-1的條件下生長到對(duì)數(shù)期的兩種小球藻進(jìn)行馴化培養(yǎng)。

2.3.1 普通環(huán)境下苯酚對(duì)馴化后小球藻生長的影響

普通環(huán)境下的小球藻馴化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 普通環(huán)境下馴化后的小球藻在含不同 濃度苯酚培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.5 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under general condition

對(duì)比圖1和圖5可知，在普通環(huán)境下，在含不同濃度苯酚的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的小球藻最大細(xì)胞密度在馴化前后變化不大，如苯酚濃度為400 mg·L-1時(shí)，最大藻細(xì)胞密度在馴化前后均約為1.2×107cell·mL-1。在普通環(huán)境下馴化后的小球藻在苯酚濃度為0～500mg·L-1的培養(yǎng)基中生長速率基本與馴化前保持一致，均經(jīng)過2 d的適應(yīng)期后生長速度加快。而馴化后小球藻的最大苯酚耐受濃度明顯提高，未經(jīng)馴化的小球藻在苯酚濃度達(dá)到600 mg·L-1時(shí)生長受到完全抑制，在第9 d全部死亡，而經(jīng)過馴化的小球藻在苯酚濃度達(dá)到800 mg·L-1時(shí)生長才表現(xiàn)出完全抑制，于培養(yǎng)第6 d才全部死亡。小球藻的最大苯酚耐受濃度較未馴化時(shí)提高了約三分之一，說明馴化過程雖未改變低濃度苯酚中小球藻的生長速率，但能顯著提高其對(duì)苯酚的耐受能力。

圖6 普通環(huán)境下馴化后小球藻培養(yǎng)液中苯酚濃度的變化Fig.6 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under general condition

對(duì)比圖2和圖6可知，馴化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中苯酚的降解速率明顯增大。普通環(huán)境下未馴化的小球藻在苯酚濃度分別為400 mg·L-1、500 mg·L-1、600 mg·L-1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后，培養(yǎng)基中的苯酚濃度分別為128 mg·L-1、298 mg·L-1、365 mg·L-1，苯酚降解率分別為68.0%、40.4%和39.2%；而經(jīng)過馴化的小球藻在對(duì)應(yīng)的第4 d苯酚降解率分別達(dá)到74%、65%和62%。表明馴化過程不僅增強(qiáng)了小球藻的耐酚能力，同時(shí)也增強(qiáng)了其降酚能力。藻類對(duì)苯酚的降解可能是由于在苯酚的誘導(dǎo)下形成酶的作用，因此經(jīng)過馴化后藻體降解苯酚的能力有所提高[5]。

2.3.2 模擬微重力環(huán)境下苯酚對(duì)馴化后小球藻生長的影響

模擬微重力環(huán)境下的小球藻耐酚馴化培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7和圖8所示。

對(duì)比圖3和圖7可知，模擬微重力環(huán)境下，小球藻在含不同濃度苯酚的培養(yǎng)基中馴化后最大細(xì)胞密度較馴化前均有一定提升，在苯酚濃度為600 mg· L-1的培養(yǎng)基中，馴化后的小球藻最大細(xì)胞密度從馴化前的9.8×107cell·mL-1增長到1.29×108cell·mL-1，增長了31.6%。表明在模擬微重力環(huán)境下，馴化過程不僅改變了小球藻對(duì)苯酚的耐受性，同時(shí)也加快了小球藻的生長速率。但隨著苯酚濃度的進(jìn)一步增大，小球藻生長速率逐漸減緩。當(dāng)苯酚濃度達(dá)到1 000 mg· L-1時(shí)，小球藻生長受到完全抑制，與未馴化的小球藻相比，最大苯酚耐受濃度提高了300 mg· L-1。微重力環(huán)境下馴化過程對(duì)小球藻耐酚能力的提高和生長代謝的加速要比普通環(huán)境下更為顯著。

圖7 模擬微重力環(huán)境下馴化后的小球藻在含不同 濃度苯酚培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.7 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

圖8 模擬微重力環(huán)境下馴化后小球藻培養(yǎng)液中苯酚濃度的變化Fig.8 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

對(duì)比圖2和圖8可知，當(dāng)苯酚濃度為400 mg·L-1、500 mg·L-1時(shí)，模擬微重力環(huán)境下經(jīng)過馴化的小球藻在第4 d苯酚降解率分別為75%和 67%,說明小球藻馴化后在模擬微重力環(huán)境下的苯酚降解速率較普通環(huán)境下亦有所提高。模擬微重力環(huán)境下苯酚降解速率提高的原因在于，一方面小球藻生長速率加快導(dǎo)致碳源消耗速率加快，另一方面由于模擬微重力下細(xì)胞膜脂質(zhì)層分子之間的距離有所增大，提高了膜的流動(dòng)性和通透性[22]，導(dǎo)致苯酚能夠更快地滲透入細(xì)胞內(nèi)部，從而加快了苯酚的降解。

3 結(jié)論

比較了小球藻在普通環(huán)境和模擬微重力環(huán)境下的耐酚與降酚能力，并對(duì)其進(jìn)行了馴化培養(yǎng)。結(jié)果表明，普通環(huán)境下小球藻最大苯酚耐受濃度為600 mg· L-1，而在模擬微重力環(huán)境下的最大苯酚耐受濃度提高到700 mg· L-1，且苯酚完全降解所需時(shí)間也明顯縮短。通過馴化培養(yǎng)后的小球藻耐酚能力明顯提高，馴化后的小球藻在普通環(huán)境下最大苯酚耐受濃度為800 mg· L-1，而在模擬微重力環(huán)境下最大苯酚耐受濃度達(dá)1 000 mg· L-1。同時(shí)小球藻在模擬微重力環(huán)境下降酚能力也顯著提高，馴化后的小球藻在苯酚濃度為600 mg· L-1的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，其最大細(xì)胞密度比未馴化時(shí)增長了31.6%。馴化過程能有效增強(qiáng)小球藻的耐酚與降酚能力，但其具體機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

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Phenol-Tolerant Characteristic and Domestication ofChlorellasp.under Simulated Microgravity and General Conditions

WANG Tie-lin，ZHANG Zhi-ren，WANG Cheng-cheng，WANG Wei-guo，WANG Cun-wen

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

InordertomakeclearthefeasibilityofcultivationofChlorellasp.onalargescaleusingphenolicwastewaterundermicrogravitycondition,thevariationrangeofphenoltoleranceofChlorellasp.aswellasthepotentialinimprovingthephenol-tolerantandphenol-degradingabilitiesbydomesticationcultureundergeneralconditionandsimulatedmicrogravityconditionwereinvestigated.Theresultsshowedthat,themaximumphenoltoleranceconcentrationwas600mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationincreasedto700mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition,andthecompletedegradationtimeofphenolshortenedobviously.Thephenol-tolerantabilityofChlorellasp.improvedbydomesticationculture.ThemaximumphenoltoleranceconcentrationofChlorellasp.was800mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationreachedupto1 000mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition.Meanwhile,thephenol-degradingabilityofChlorellasp.improvedsignificantlyundersimulatedmicrogravitycondition.

simulatedmicrogravity;Chlorellasp.;phenol;domestication

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015CFB580)，湖北省科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013BHE001)

Q 949.217

A

1672-5425(2017)01-0039-05

汪鐵林，張志忍，王成成，等.模擬微重力與普通環(huán)境下小球藻耐酚性能比較與馴化研究[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(1)：39-43.