王玨玉，范麗莉，王 炎，趙 敏*

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3.哈爾濱工業(yè)大學化學工程與技術(shù)學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

漆酶固定化磁性載體的研究進展

王玨玉1，范麗莉2，王 炎3，趙 敏1*

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；3.哈爾濱工業(yè)大學化學工程與技術(shù)學院，黑龍江 哈爾濱 150001)

漆酶是一種多銅氧化酶，催化效率高且催化反應的唯一副產(chǎn)物是水，是一種綠色環(huán)保的生物催化劑。漆酶催化底物范圍廣，在多個領域都有重要應用潛能。磁性載體固定漆酶可實現(xiàn)漆酶的磁性回收和重復使用、降低漆酶的使用成本、提高漆酶的穩(wěn)定性，近年來已成為漆酶固定化研究的熱點。對不同漆酶固定化磁性載體的制備方法、固定化漆酶的催化性能及應用進行了綜述，比較分析了不同磁性載體的負載量和固定化漆酶的活性回復率，為漆酶固定化磁性載體的開發(fā)應用提供幫助。

漆酶；固定化；磁性載體；負載量；活性回復率

游離漆酶在反應體系中難以回收，因而使用成本較高。漆酶固定化是將漆酶分子固定于載體上，使漆酶分子更加穩(wěn)定并能夠被分離和重復利用的一種技術(shù)。固定化漆酶和游離漆酶相比往往具有更高的熱穩(wěn)定性，并對化學試劑具有更強的抵抗能力。將漆酶固定化，對降低漆酶使用成本、促進漆酶的實際應用具有重要意義[3-4]。

目前，文獻報道的漆酶固定化載體主要有納米材料、介孔材料、殼聚糖、硅膠和親水性微濾膜等[5-7]。Fe3O4納米粒子具有飽和磁化強度高和超順磁性等優(yōu)異的磁學性能，近年來常用其與其它材料結(jié)合用于漆酶的固定，固定化漆酶在磁場作用下可從反應體系中迅速分離，有利于漆酶的回收和重復再利用，同時也降低了漆酶的使用成本[7-8]，具有重要的應用潛能。為尋找價廉且易于回收的磁性載體、提高固定化漆酶的實際應用能力，為磁性載體固定化漆酶的應用研究提供依據(jù)，作者在此對近年來報道的用于漆酶固定化的磁性載體的制備方法以及固定化漆酶的催化性能和應用進行了綜述，并總結(jié)了不同磁性載體的特點，比較分析了不同磁性載體固定化漆酶的負載量和固定化漆酶的活性回復率，擬為漆酶固定化磁性載體的開發(fā)應用提供幫助。

1 磁性納米粒子

尺寸為納米級的磁性粒子可作為漆酶的固定化載體，與其它漆酶固定化載體相比，磁性納米粒子比表面積更大，對漆酶的負載量較大，可與底物充分接觸，具有良好的催化效果[9-10]。目前用于固定漆酶的磁性納米粒子主要是Fe3O4，漆酶可通過共價結(jié)合、親和吸附或交叉聯(lián)合等方法固定于Fe3O4納米粒子(Fe3O4-NPs)表面[11]。

Kumar等[12]利用戊二醛交聯(lián)法將漆酶固定于經(jīng)過3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修飾的Fe3O4-NPs表面。首先利用APTES修飾Fe3O4-NPs，使其表面帶有氨基(Fe3O4-NPs-NH2)，通過戊二醛(GA)將漆酶的交聯(lián)酶聚集體(CLEA-Lac)固定在Fe3O4-NPs-NH2上，GA分子中的一個醛基與Fe3O4-NPs表面的氨基發(fā)生反應形成亞氨基(-N=CH-)，另一個醛基與漆酶的氨基反應[13]。固定漆酶后的磁性納米粒子的直徑介于48～74nm之間，比表面積為552m2·g-1，負載量高達155mg·g-1，但漆酶活性回復率僅為32%，可能是由于交聯(lián)的方式阻礙了漆酶和催化底物的結(jié)合。

酯酶和漆酶的分子大小、結(jié)構(gòu)排列和組成有明顯的差異，Alex等[14]利用共沉淀法合成了直徑介于10～100nm之間的磁性Fe3O4-NPs，以同樣的方式進行氨基化修飾用來固定酯酶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)固定化酯酶的活性回復率為100%。由此可見，酶分子結(jié)構(gòu)也是影響固定化效果的重要因素。

Xia等[15]提出了一種新的固定漆酶方法：利用螯合Cu2+的聚乙烯亞胺(PEI)將漆酶固定在Fe3O4-NPs-NH2上，利用漆酶對Cu2+的吸附作用固定漆酶，如圖1所示。

圖1 Fe3O4-NPs-NH2-PEI-Cu2+固定漆酶示意圖Fig.1 The schematic diagram of laccase immobilizationby Fe3O4-NPs-NH2-PEI-Cu2+

由于PEI含有氨基豐富的支鏈結(jié)構(gòu)，可以通過Cu2+螯合吸附更多的漆酶，通過PEI可以提高對漆酶的固定能力。Fe3O4-NPs-NH2-Cu2+和Fe3O4-NPs-NH2-PEI-Cu2+2種磁性納米粒子在相同條件下對漆酶的負載量分別為85 mg·g-1和150 mg·g-1。

磁性納米粒子的直徑小且比表面積大，合成方法簡單易行，是一種性價比很高的載體。磁性Fe3O4-NPs還具有優(yōu)異的光催化降解性能，可用于有機染料(如亞甲基藍和藏紅T等[16-18])的光催化降解。由此可見，直接以磁性納米粒子為載體的固定漆酶技術(shù)在染料去除中具有很大的發(fā)展空間。

2 磁性納米粒子和有機材料(物)的復合材料

2.1 磁性殼聚糖

2.1.1 磁性殼聚糖微球

磁性高分子微球是一種多組分的功能型微球，由有機高分子材料和無機磁性物質(zhì)復合而成，既具有有機高分子材料可以通過表面改性賦予功能性基團的優(yōu)良特性，又兼具無機磁性物質(zhì)的磁響應性，在外加磁場條件下很容易分離[19-20]。磁性高分子微球具有4種結(jié)構(gòu)，如圖2所示。

a.單個聚合物包裹單個磁性納米粒子 b.單個聚合物中均勻 分布多個磁性納米粒子 c.單個聚合物外部被多個磁性納米 粒子均勻包裹 d.單個磁性納米粒子表面連有多個聚合物配體[21]圖2 磁性高分子微球的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of magnetic polymer microspheres

殼聚糖由于表面含有豐富的氨基和羥基[22]，是制備磁性高分子微球的優(yōu)良材料，近年來在固定化酶領域應用廣泛。Jiang等[23]以Span-80為乳化劑、GA為交聯(lián)劑，利用反相懸浮法將Fe3O4-NPs包裹在殼聚糖中制成磁性殼聚糖微球(呈圖2中b型)，表面呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。殼聚糖是否成球的重要因素是殼聚糖和GA的濃度，殼聚糖濃度過高形狀不好，易粘連，過低不易成球；GA濃度過高微球間相互粘連不易分散，過低交聯(lián)度低，微球機械性能差。當殼聚糖質(zhì)量分數(shù)為2.5%、GA濃度為8%時，得到的微球具有較好的球形形貌，表面平滑，單分散性較好，粒徑分布范圍窄，平均粒徑為0.9 μm，表面呈規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將血紅密孔菌漆酶固定在該微球上，漆酶的活性回復率達100%。

Lin等[24]利用交聯(lián)作用在Fe3O4上負載一層殼聚糖，然后將Cu2+和Mn2+螯合在Fe3O4磁性殼聚糖微球表面；通過調(diào)整溶液的pH值使漆酶帶上負電荷；帶負電荷的漆酶與Fe3O4磁性殼聚糖微球表面上的陽離子結(jié)合，使漆酶固定在磁性微球上。通過這種金屬離子吸附作用固定漆酶的負載量可達到100 mg·g-1，固定化漆酶的活性回復率可達到100%。

當用GA為交聯(lián)劑制備磁性殼聚糖微球固定漆酶時，GA自身易發(fā)生羥醛縮合反應形成不規(guī)則物質(zhì)附著在微球表面，影響磁性殼聚糖微球固定漆酶的數(shù)量。Bayramoglu等[25]將殼聚糖溶液和磁性納米粒子混合，利用相反轉(zhuǎn)技術(shù)制備磁性殼聚糖微球(呈圖2中b型)；以環(huán)氧氯丙烷取代GA，在堿性條件下用環(huán)氧氯丙烷修飾磁性殼聚糖微球固定漆酶，雖然避免了交聯(lián)劑自身反應，但漆酶負載量很低，僅為16.33 mg·g-1。固定過程如圖3所示。

圖3 磁性殼聚糖微球和漆酶的交聯(lián)過程Fig.3 Cross-linking process of magnetic chitosan microsphere and laccase

2.1.2 磁性殼聚糖納米粒子

Aksoy課題組[26]報道了殼聚糖包裹單個磁性納米粒子形成磁性殼聚糖納米粒子(呈圖2中a型)，并分別采用碳化二亞胺(EDAC)和氰脲酰氯(CC)為交聯(lián)劑固定漆酶，與磁性殼聚糖納米粒子固定漆酶進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種方式固定的漆酶的催化效率和游離漆酶相當接近，3種方式固定的漆酶以2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)為底物重復使用30次后的相對酶活仍然達到71%以上。由此可知，磁性殼聚糖納米粒子可使固定化漆酶具有較高的重復利用率。

2.2 磁性海藻酸鈉

海藻酸鈉固定漆酶[27-30]是一種成熟的應用最普遍的漆酶固定方法，其原理是利用海藻酸鈉與氯化鈣乳化反應形成海藻酸鈣凝膠包埋漆酶。該方法固定漆酶酶活力損失少且操作簡單，但不易回收。

趙敏等[31]用海藻酸鈉和磁性Fe3O4-NPs制備磁性海藻酸鈉微粒，將其表面修飾生成酰氯基團，并通過化學共價法固定漆酶。結(jié)果表明，固定化漆酶與底物 ABTS親和力降低，固定化漆酶反復使用10次后，僅保持 50%左右的活性，與其它磁性載體比較，重復利用率較低。

Le等[32]提出了一種新型固定漆酶技術(shù)，他們將漆酶封裝在具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性海藻酸鈉銅珠中，利用海藻酸鈉的乳化作用，將Fe3O4-NPs、Cu2+和漆酶都封裝形成微球，其中Fe3O4-NPs可實現(xiàn)固定化漆酶的磁性回收；Cu2+作為漆酶催化的輔助因子，有利于酶活力的保持。通過該技術(shù)固定漆酶的活性回復率達85%，并將其用于去除實際廢水中的有機污染物。

3 磁性二氧化硅

用SiO2可較簡單地制備孔徑可調(diào)的介孔材料。在固定漆酶的過程中，SiO2孔徑大小很重要，孔徑過大不宜于酶分子固定在SiO2上；孔徑過小易發(fā)生堵塞，影響酶和底物的結(jié)合[33-35]。

3.1 介孔磁性SiO2微球和管狀介孔SiO2

孔徑介于2～50 nm的材料稱為介孔材料，介孔SiO2微球具有開放的孔道結(jié)構(gòu)、合適的孔徑分布、較大的比表面積及可調(diào)的孔徑等特點，有利于酶分子進入孔道[36]，但介孔SiO2微球尺寸較小，不利于回收。介孔磁性SiO2微球在磁場作用下可快速分離，實現(xiàn)固定化酶的回收再利用。

Deng等[37]和Zhang等[38]分別利用水熱合成法和微乳液法制備了具備超順磁性的核殼結(jié)構(gòu)磁性介孔SiO2微球，但均存在顆粒均一性差、磁性粒子與介孔SiO2不易結(jié)合等缺點[39]。用介孔SiO2和Fe3O4納米棒可以制備一種新型的磁性介孔SiO2/Fe3O4中空微球，具有獨特的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖4)。制備方法如下：先將SiO2微球分散于含有Fe2+和F-的酸性溶液中進行預處理，以預處理的SiO2微球為核心，表面包覆β-FeOOH；然后利用NaOH溶液去除SiO2，得到中空的β-FeOOH微球，再利用正硅酸乙酯(TEOS)在堿性條件下水解，以十六烷基三甲基溴化銨(CTAB) 為結(jié)構(gòu)模板對其進行包覆，最終得到中空的磁性介孔SiO2/Fe3O4微球[40-43]。該微球具有較大的比表面積(772 m2·g-1)和孔體積(0.83 cm3·g-1)、較好的磁性 (13.6 emu·g-1)，對漆酶的負載量高達689 mg·g-1。這種由β-FeOOH納米棒構(gòu)建的中空微球，具有三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，漆酶分子可以通過β-FeOOH納米棒間隙擴散進入中空核心，有利于漆酶的負載和儲存。

圖4 介孔SiO2/Fe3O4中空微球的SEM照片F(xiàn)ig.4 SEM images of mesoporous SiO2/Fe3O4hollow microspheres

介孔磁性SiO2作為載體一般呈球型[44-45]。席艷杰等[46]制備了管狀介孔SiO2載體(圖5)，并用吸附和交聯(lián)的方法進行漆酶固定化，制備的固定化漆酶可用于農(nóng)藥甲氧滴滴涕(MXC)的催化降解。這種管狀磁性載體的形貌、尺寸大小都比較均一，但和SiO2微球相比管壁較薄、重復使用性差，固定化漆酶重復使用7次后，對MXC的降解率僅保持20%。

圖5 管狀介孔SiO2的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM image of tubular mesoporous SiO2

3.2 磁性SiO2納米粒子

以磁性納米粒子為核心、SiO2為外殼可制備核殼結(jié)構(gòu)的磁性SiO2納米粒子，對SiO2的表面進行修飾可用于固定漆酶。在堿性條件下，共沉淀法合成Fe3O4-NPs，以TEOS為硅源，磁性分離得到SiO2/ Fe3O4，用APTES修飾SiO2/ Fe3O4使其表面帶有大量的氨基，通過GA的共價結(jié)合固定漆酶[47-48]。

Zheng等[47]合成了直徑介于400～500 nm的磁性SiO2/ Fe3O4復合粒子固定漆酶，最大比活性為224 U，負載量為62.6 mg·g-1。Wang等[48]制備了直徑介于25～30 nm的磁性SiO2/Fe3O4納米粒子固定漆酶，負載量為85 mg·g-1。這是因為，直徑小的磁性SiO2/Fe3O4納米粒子的比表面積更大，有更多的連接位點可以固定漆酶，而且單分散性高增加了與漆酶分子的碰撞機會。Deng等[49]制備了磁性SiO2納米粒子(Fe3O4@SiO2-NPs)，利用多巴胺(DA)在溶解氧的作用下發(fā)生聚合反應形成黏附于固體表面的聚多巴胺(PDA)層[50]，可將漆酶黏附在磁性SiO2表面，如圖6b路線所示。與用APTES修飾Fe3O4@SiO2-NPs，通過GA固定漆酶方法(圖6a)對比發(fā)現(xiàn)，4 ℃放置70 d，F(xiàn)e3O4@SiO2-NPs-PDA-Lac(圖6b)能保持最初活性的80%，而Fe3O4@SiO2-NPs-GA-Lac(圖6a)只能保持35%。這是因為，PDA層可以將漆酶牢牢地包裹在磁性SiO2表面，防止漆酶受影響而失活。表明，DA的生物相容性好，反應條件溫和，聚合速度快，反應可控，是一種較理想的聚合材料，在酶的固定化領域具有廣闊的應用前景。

3.3 表面螯合Cu2+的磁性SiO2

賀芙蓉等[51]研究了磁性SiO2表面接枝的聚丙烯酰胺(PAM)絡合Cu2+制備表面螯合Cu2+的磁性SiO2，通過配位作用固定漆酶，并用于水中2,4-二氯酚(2,4-DCP)的催化降解。Wang等[52-53]對磁性SiO2進行氨基修飾固定漆酶，固定化漆酶的酶活力為234 U·mg-1，但是固定化漆酶的活性和游離漆酶相比更易受pH值的影響，應用時受外界環(huán)境影響較大。孫丹丹等[54]在此基礎上用Cu2+修飾磁性Fe3O4/SiO2固定漆酶并用于酚類染料的降解，結(jié)果表明，漆酶負載量雖低(26 mg·g-1)，但Cu2+修飾后的固定化漆酶的酶活比未修飾的高54%，重復使用13次后降解率仍可達到92%。圖7為Cu2+修飾固定化漆酶的SEM照片。

由圖7可以看出，隨著漆酶固定時間的延長，固定化漆酶從層片狀逐漸變?yōu)榛?。Ge等[55]研究發(fā)現(xiàn)，這種納米花狀的固定化漆酶比表面積大、吸附能力強、對底物脫色能力強。

將表面螯合Cu2+的磁性SiO2固定漆酶與其它工藝相結(jié)合可提高漆酶的催化效率。李麗芳等[56]將電化學工藝和表面螯合Cu2+的磁性SiO2固定漆酶結(jié)合，催化氧化水中的五氯酚。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漆酶酶活和重復利用率均比單獨固定化漆酶高。這是因為，利用電化學預氧化五氯酚，降低了五氯酚的濃度，減少了固定化漆酶酶活的損失。在降解高毒性有機物質(zhì)時電化學降解成本高，固定化漆酶酶活利用率低，通過兩者的結(jié)合，不僅降低了使用成本，同時也減少了漆酶在催化過程中的損失，提高了固定化漆酶的效率，為降解高毒性有機污染物提供了一條新思路。

圖7 Cu2+修飾固定化漆酶的 SEM照片F(xiàn)ig.7 SEM images of immobilized laccase modified by Cu2+

4 磁性碳材料

碳材料是一種比表面積大、孔隙體積大且孔徑可調(diào)的多孔材料，和SiO2及其它材料相比具有高水熱電阻，一直被認為是適合固定酶和分子的材料[57]。以介孔SiO2材料SBA-15[58]為模板、金屬硝酸鹽為合金來源、糠醇為碳源合成的FeNi/C磁性粒子固定的漆酶可用于酚類化合物的去除。FeNi/C磁性粒子為介孔材料，物理吸附漆酶，吸附量為491.7 mg·g-1，活性回復率為91%[59]。

石墨烯是一種二維碳材料，常用的合成方法有機械剝離法、氧化還原法、SiC外延生長法和化學氣相沉積法(CVD)[60]。朱珣之等[61]利用氧化還原法制備了氧化石墨烯，通過水熱共沉淀法制備了Fe3O4納米磁性氧化石墨烯，利用GA為交聯(lián)劑固定果膠酶，固定化酶穩(wěn)定性明顯增強。歐陽科等[35]采用Hummers法[62]和多羥基法[63]制備Fe3O4/石墨烯異質(zhì)結(jié)固定漆酶，用于降解雙酚A(BPA)。氧化石墨烯的比表面積大(726.34 m2·g-1)，增強了漆酶和底物的親和力。重復使用10次后的相對活性依然保持82%，具有良好的重復使用性。通過石墨烯固定的漆酶的耐酸性、耐熱性、貯存穩(wěn)定性都有所提高。

5 結(jié)語

漆酶固定化磁性載體的最大優(yōu)勢是可以利用磁性分離，使漆酶被快速回收利用。總體來看，磁性載體固定的漆酶的溫度穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、重復使用性及操作性能都普遍提高，但固定化漆酶的比活力并不都令人滿意。如何在保證穩(wěn)定性和磁性的基礎上提高固定化漆酶的活性是固定化磁性載體今后的研究方向。

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Research Progress on Magnetic Carrier for Laccase Immobilization

WANG Jue-yu1,FAN Li-li2,WANG Yan3,ZHAO Min1*

(1.CollegeofLifeSciences,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China;2.NortheastInstituteofGeographyandAgroecology,ChineseAcademyofSciences,Harbin150081,China;3.SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150001,China)

Asakindofmulticopperoxidases,laccasehashighcatalyticefficiencyandtheonlyby-productiswater,soitisagreenbiocatalyst.Basedonawidesubstraterange,laccasehasimportantapplicationpotentialinvariousfields.Theimmobilizationoflaccasebymagneticcarriercanachievemagneticrecyclingandreuseoflaccase,reducethecostoflaccase,andincreasethestabilityoflaccase.Inrecentyears，immobilizationoflaccasebymagneticcarrierhasattractedincreasingattention.Thepreparationmethodsofdifferentmagneticcarriers,catalyticpropertiesandapplicationsofimmobilizedlaccasearesummarized.Theloadingcapacityofdifferentmagneticcarriersandactivityrecoveryofimmobilizedlaccasearecompared.Thisstudyprovidesahelpforthedevelopmentandutilizationofmagneticcarrierforlaccaseimmobilization.

laccase;immobilization;magneticcarrier;loadingcapacity;activityrecovery

2016-08-31

Q 814.2

A

1672-5425(2017)01-0015-08

王玨玉，范麗莉，王炎，等.漆酶固定化磁性載體的研究進展[J].化學與生物工程，2017，34(1)：15-22.