張曦 韓黎

(中國人民解放軍疾病預防控制所醫(yī)院感染監(jiān)控中心，北京 100071)

·綜述·

煙曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶在分子調(diào)控及真菌感染中的作用

張曦 韓黎

(中國人民解放軍疾病預防控制所醫(yī)院感染監(jiān)控中心，北京 100071)

煙曲霉是最為常見的重要病原真菌之一，可引起侵襲性曲霉病、變應性支氣管肺曲霉病、曲霉腫以及嚴重過敏性哮喘等多種疾病，病死率高。β-1,3-葡聚糖是煙曲霉細胞壁的主要骨架成份，也是重要免疫原性因子，由β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，該酶主要由催化亞基Fks蛋白和調(diào)節(jié)亞基Rho1蛋白組成，Rho1可利用自身活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化和修飾調(diào)控β-1,3-葡聚糖的合成，也可能通過控制肌動蛋白骨架重排影響Fks胞內(nèi)轉(zhuǎn)位和功能。該文對β-1,3-葡聚糖的合成的分子調(diào)控機制與煙曲霉及其他病原真菌感染進行綜述。

煙曲霉;β-1,3-葡聚糖;天然免疫應答;Rho蛋白

煙曲霉是最為常見的重要病原真菌之一，可引起侵襲性曲霉病、變應性支氣管肺曲霉病、曲霉腫以及嚴重過敏性哮喘等多種疾病，每年患病人群約千萬，其中侵襲性曲霉感染，嚴重破壞肺組織，病情進展迅速，目前缺乏有效治療策略，病死率高 (可高達90%)[1]。細胞壁是煙曲霉細胞外骨架，其主要功能是維持細胞形態(tài)和構(gòu)成首要物理屏障，同時在誘導宿主天然免疫應答過程中發(fā)揮重要作用[2]。β-1,3-葡聚糖是煙曲霉細胞壁的主要骨架成份，也是重要的免疫原性因子，可通過宿主細胞表面dectin-1等受體誘發(fā)吞噬和炎癥因子釋放等天然免疫應答[3]。煙曲霉β-1,3-葡聚糖由一種β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，該酶主要由催化亞基Fks蛋白和調(diào)節(jié)亞基Rho1蛋白組成[4]。另外，由于哺乳動物細胞沒有細胞壁，也沒有β-1,3-葡聚糖合成酶，因此該酶是很好的抗真菌藥作用靶點，如棘白菌素類藥物 (卡泊芬凈等)，然而遺憾的是，目前真菌對該類藥物的耐藥性正在上升而且此類藥物存在高濃度時療效卻不佳等問題[5]。因此，研究解析β-1,3-葡聚糖合成的分子調(diào)控機制對有效應對煙曲霉及其他病原真菌感染十分重要。

1 Fks蛋白是煙曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶的催化亞基

煙曲霉細胞壁的90%是由多糖組成，核心骨架是β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)，在此基礎(chǔ)上鏈接α-1,3-葡聚糖、半乳甘露聚糖 (Galactomannan，GM)以及相關(guān)蛋白組成了煙曲霉細胞壁的三維立體結(jié)構(gòu)[6]。已有研究表明，β-1,3-葡聚糖是煙曲霉重要免疫原性因子，能夠與宿主細胞表面dectin-1、TLR2等受體結(jié)合，激活宿主細胞內(nèi)炎癥信號通路，如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB通路等，進而調(diào)控細胞吞噬、炎癥因子表達與釋放，在煙曲霉感染宿主過程中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用[3]。

目前公認β-1,3-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖合成酶催化生成，該酶主要由催化亞基Fks和調(diào)節(jié)亞基Rho1組成，但也可能有其他蛋白的參與[6]。酵母樣真菌，如釀酒酵母、念珠菌等的Fks蛋白一般有3種亞型，功能有交叉和冗余[7]；而大多數(shù)絲狀真菌，如煙曲霉只含有1個Fks蛋白。該蛋白嵌合于細胞膜 (16次跨膜)，大小為218 kD，其可利用細胞膜內(nèi)的尿核苷二磷酸葡萄糖 (UDP-Glucose，UDPG)為底物合成鏈狀的β-1,3-葡聚糖，并將其送入膜外的細胞壁空間中[8]。

煙曲霉Fks蛋白中心區(qū)域是一個位于胞漿一側(cè)的包含約580氨基酸的較為保守的親水區(qū)，人們推測這可能是β-1,3-葡聚糖合成的重要功能位點，但有趣的是這一區(qū)域并不包含公認的UDPG結(jié)合位點[9]；Fks蛋白的C末端則可能是與Rho1或其他因子相互作用的區(qū)域；另外，F(xiàn)ks蛋白的S678P突變可能導致煙曲霉對棘白菌素藥物產(chǎn)生耐藥，提示該位點可能在調(diào)控β-1,3-葡聚糖合成功能中發(fā)揮重要作用[10]。

另外，真菌細胞內(nèi)Fks分布變化較為復雜且影響其催化活性。在白念珠菌中，F(xiàn)ks多位于細胞極性生長點附近，且與肌動蛋白斑塊共定位在一起[11]；釀酒酵母Fks以無活性狀態(tài)從高爾基體被轉(zhuǎn)運至細胞膜上與Rho1相結(jié)合時，才被激活；還有細胞壁應激條件，如溫度、滲透壓、去垢劑SDS以及細胞壁干擾劑等可能通過釀酒酵母細胞壁感應受體Wsc及其下游通路調(diào)控Fks的分布和活性，如當細胞壁破損時，F(xiàn)ks可從細胞生長點向細胞壁損傷區(qū)域轉(zhuǎn)位[12]。

2 Rho1蛋白是煙曲霉β-1,3-葡聚糖合成酶的調(diào)節(jié)亞基

多種因子可能參與調(diào)控Fks催化合成β-1,3-葡聚糖，其中最為重要的是β-1,3-葡聚糖合成酶的調(diào)節(jié)亞基Rho1[6]。它是小G蛋白Rho家族成員之一，鳥苷酸交換因子GEF蛋白可促進其活化 (結(jié)合GTP)，GTP水解酶GAP可促進其失活 (結(jié)合GDP)；Rho-GDI分子可使其保持在結(jié)合GDP的非活性狀態(tài)。在哺乳動物中Rho家族有Rho、Rac、Cdc42 3個亞家族，是細胞形態(tài)變化、細胞運動、囊泡運輸?shù)戎匾磉^程的調(diào)控核心；而煙曲霉有6個亞型，Rho1-4，Rac1 (僅在絲狀真菌中)和Cdc42。Rho1蛋白既是真菌極性生長和形態(tài)變化的調(diào)節(jié)核心，又調(diào)控Fks活性影響細胞壁β-1,3-葡聚糖合成。首先，它直接與Fks結(jié)合，利用自身活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化和修飾調(diào)控β-1,3-葡聚糖的合成[13]。粟酒裂殖酵母細胞膜上的Rho1可以被Rgf (一種Rho-GEF蛋白)激活，促進與Fks的結(jié)合和β-1,3-葡聚糖合成[14]；而釀酒酵母中Lrg1P (一種Rho-GAP蛋白)則抑制Rho活性進而抑制Fks功能[15]；釀酒酵母Rho1的異戊烯基化對其經(jīng)囊泡運輸轉(zhuǎn)運至細胞膜并與Fks結(jié)合至關(guān)重要[16]；但是煙曲霉中Rho-GAP以及GDI蛋白對β-1,3-葡聚糖合成的影響尚未見報道。其次，Rho可激活蛋白激酶C (PKC)，進而激活有絲分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)調(diào)節(jié)細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，從而影響煙曲霉細胞壁完整性。再者，SDS去垢劑處理釀酒酵母，可通過細胞壁感應受體引發(fā)Rho1激活，進而誘發(fā)肌動蛋白骨架重排和β-1,3-葡聚糖的合成[17]。具體到煙曲霉，其Rho1蛋白大小約21 kD，與釀酒酵母Rho1同源性為85%。與酵母Rho1不同，煙曲霉Rho1蛋白的異戊烯基化位點中的異亮氨酸被極性蘇氨酸代替[8]。

3 Rho1控制的肌動蛋白骨架重排可能影響Fks胞內(nèi)轉(zhuǎn)位和功能

在釀酒酵母中，F(xiàn)ks的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位取決于肌動蛋白骨架的重排[18]。比如，熱應激可導致Fks的去極性化分布 (由細胞極性生長點附近的肌動蛋白皮質(zhì)斑塊分散入細胞漿中)，而這種分布變化受控于細胞內(nèi)肌動蛋白骨架重排，且與細胞膜上的細胞壁應激感應受體Wsc有關(guān)[12]。更進一步，人們已知哺乳動物細胞肌動蛋白骨架的重排直接受控于一種肌動蛋白骨架解聚因子-Cofilin蛋白[19]。該蛋白廣泛分布于各類真核細胞中，作為Rho家族蛋白下游信號蛋白，其可直接與單體肌動蛋白或肌動蛋白絲結(jié)合，解聚肌動蛋白骨架，控制其組裝與重排。Cofilin的N末端首位絲氨酸的磷酸化循環(huán) (被LIM激酶磷酸化而失活，被磷酸水解酶Slingshot去磷酸化而恢復活性)是其主要功能開關(guān)。在裂殖酵母中，Cofilin功能缺陷可引起細胞膜下肌動蛋白斑的組裝和解聚明顯減慢，導致胞吞過程受到抑制[20]；釀酒酵母Cofilin可以調(diào)節(jié)高爾基體囊泡運輸貨物的分選和輸出等[21]。另外，我們前期發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細胞中Cofilin可以結(jié)合并激活另一種重要胞內(nèi)信號蛋白-磷脂酶D (PLD)，介導Rho蛋白調(diào)控的肌動蛋白骨架重排[22]；哺乳動物細胞中，磷脂酶D (PLD)可水解細胞膜磷脂的重要組成成分-磷脂酰膽堿 (phosphatidylcholine，PC)，生成磷脂酸 (phosphotidicacid,PA)和膽堿，參與調(diào)控囊泡運輸、細胞形態(tài)變化、胞吞與胞吐、呼吸暴發(fā)和炎癥因子釋放等重要生理過程[23]；在粟酒裂殖酵母中，PLD可調(diào)控肌動蛋白骨架重排進而控制出芽形成和減數(shù)分裂[24]；另一類重要病原真菌白色念珠菌的PLD是其雙相性轉(zhuǎn)化的毒力決定因子，可促進其菌絲形成[25]。值得注意的是，外源加入磷脂酶類蛋白會明顯抑制植物中β-1,3-葡聚糖 (Callose,胼胝質(zhì))的合成[26]。因此，煙曲霉PLD可能直接與Fks結(jié)合并影響β-1,3-葡聚糖合成，也有可能通過調(diào)控肌動蛋白骨架重排參與調(diào)控Fks功能。

4 β-1,3-葡聚糖合成與抗真菌藥物

已有臨床研究顯示，應用棘白菌素類藥物 (卡泊芬凈)治療曲霉感染患者會導致血清中GM含量升高，且給藥濃度高時治療效果卻不佳[27]。最新研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)觀點相反，F(xiàn)ks完全敲除的煙曲霉仍可存活，并且其細胞壁中幾丁質(zhì)含量顯著升高，半乳糖甘露聚糖從細胞壁上的解離也顯著增多[28]。這一結(jié)果從一定程度上解釋了前面的臨床現(xiàn)象。另一方面，幾丁質(zhì)和半乳糖甘露聚糖也是重要病原模式相關(guān)分子[29]。粗糙脈胞菌中，具有抑菌特性的殼聚糖能導致β-1,3-葡聚糖合成 (fks)與延伸 (gel-1)相關(guān)基因表達的顯著降低，同時缺陷株 (Δgel-1與Δgel-2)對殼聚糖敏感性升高，而幾丁質(zhì)缺陷株 (Δchs-1)則沒有[30]。念珠菌中對生物膜形成的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ks突變株雖然對棘白菌素藥物產(chǎn)生耐藥，但并不影響生物膜的形成。而兩性霉素B則能顯著影響Fks突變株生物膜的形成，卻并不影響其他本質(zhì)上對棘白菌素藥物產(chǎn)生耐藥的菌株[31]。

5 展 望

目前β-1,3-葡聚糖合成的調(diào)控機制已有較多研究，尤其在釀酒酵母和粟酒裂殖酵母中人們對Rho-GEF蛋白調(diào)控Rho活性和影響β-1,3-葡聚糖合成的現(xiàn)象有較多報道，但對Rho1自身到底如何與Fks結(jié)合，在哪個區(qū)域結(jié)合，如何調(diào)控的具體分子機制仍不清楚。且煙曲霉Rho1的GAP蛋白和Rho-GDI等抑制因子對β-1,3-葡聚糖合成的影響也不清楚。這些問題的解答將為尋找可能的藥物靶點奠定重要基礎(chǔ)。另外，煙曲霉β-1,3-葡聚糖合成的改變，不僅僅影響細胞壁β-1,3-葡聚糖的含量，還有可能改變細胞壁其他多糖組成，引起不同于β-1,3-葡聚糖的宿主天然免疫應答的變化。這些變化在整體水平 (動物)上意義如何，都是非常值得研究探索的問題。

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Molecularregulationonbiosynthesisofβ-1,3-glucanoncellwallofAspergillusfumigatus

ZHANG Xi,HAN Li

(DepartmentofHospitalInfectionControlandResearch,InstituteofDiseaseControlandPreventionofPLA,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100071,China)

As a major pathogenic fungus,Aspergillusfumigatusis able to cause the invasive pulmonary aspergilosis with high mortality,or chronic infection and allergic disease.β-1,3-glucan is not only the back-bone of cell wall ofA.fumigatus,but also an essential immunogenic factor.β-1,3-glucan synthase is composed of a catalytic subunit,Fks and regulatory subunit,Rho1.Rho1 can bind to Fks and regulate the synthesis of β-1,3-glucan through the transformation and modification of its active state.It also may affect cellular translocation and function of Fks by controlling the actin cytoskeleton rearrangement.

Aspergillusfumigatus;β-1,3-glucan;innate immune response;Rho-GTPase

[Chin J Mycol，2017，12(5):309-311]

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0309-03

國家自然科學基金 (31400134)

張曦，男 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:zhangxi0820@126.com

韓黎,E-mail:hanlicdc@163.com

2017-02-13

[本文編輯] 施 慧