錢明，張留偉，王靜云

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

反應(yīng)激活型酶熒光探針的研究進(jìn)展

錢明，張留偉，王靜云

（大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024）

酶在維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)與生命活動的正常運(yùn)行方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。某些特定酶含量及活性的異常與人類重大疾病的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。因此，生物體內(nèi)特定酶的實(shí)時原位檢測及可視化成像具有重要的意義?；瘜W(xué)熒光探針具有選擇性好、靈敏度高及高時空分辨率可視化成像等優(yōu)點(diǎn)，近年來研究者設(shè)計合成了大量的可用于生物體系內(nèi)酶識別與可視化成像的熒光探針。目前識別酶的熒光探針主要有兩類：（1）基于酶對熒光探針分子中酶抑制劑基團(tuán)的識別引起探針熒光信號的變化；（2）基于酶對熒光探針特異性催化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)識別前后熒光信號的激活，稱為反應(yīng)激活型酶熒光探針。對反應(yīng)激活型酶熒光探針的設(shè)計策略及4種重大疾病相關(guān)的生物標(biāo)志酶（單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶）的識別可視化熒光探針研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，對未來酶識別熒光探針的研究方向進(jìn)行了展望。

熒光；探針；酶；成像；細(xì)胞生物學(xué)

引 言

酶是細(xì)胞內(nèi)一種具有催化效應(yīng)的生物大分子，在維持生命活動的正常運(yùn)行過程中扮演著不可或缺的角色。特定酶含量及活性的異常通常與某些疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1]，如某些癌癥的發(fā)生與 β-半乳糖苷酶的過表達(dá)存在密切關(guān)系[2]，低氧腫瘤內(nèi)硝基還原酶的濃度顯著升高[3-5]，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生通常伴隨著單胺氧化酶的高水平表達(dá)[6]等。因此，開發(fā)高效的檢測手段來實(shí)現(xiàn)對生物體系中特定標(biāo)志酶的活性檢測和可視化成像對深入研究重大疾病的發(fā)病機(jī)制及其早期診斷具有舉足輕重的作用。傳統(tǒng)的酶活性分析檢測手段如比色法[7-8]、電化學(xué)法[9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10]等無法實(shí)現(xiàn)對生物體系內(nèi)特定酶的活性進(jìn)行實(shí)時原位無損傷檢測。基于熒光團(tuán)的熒光探針法具有操作簡便，靈敏度高，選擇性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時快速、原位無損傷檢測、高時空分辨率可視化成像等優(yōu)勢[11]。近年來，熒光探針已廣泛用于活細(xì)胞/亞細(xì)胞水平離子及小分子的識別及可視化成像[12-13]，同時也成為生物體系中酶活性檢測與可視化成像的一種重要手段，是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。根據(jù)探針熒光信號變化的觸發(fā)方式不同，酶熒光探針主要可以分為兩類：（1）基于酶對熒光探針分子中酶抑制劑基團(tuán)的識別引起熒光探針熒光信號的變化[14-16]，可以稱為抑制劑型酶熒光探針。此類探針能夠?qū)崿F(xiàn)較強(qiáng)的酶結(jié)合親和力和良好的選擇性檢測，但存在靈敏度相對不足的局限性；（2）基于酶對熒光探針特異性催化反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)識別前后熒光信號的激活，稱為反應(yīng)激活型酶熒光探針[17-18]，這類探針能夠通過酶的高效催化轉(zhuǎn)化能力實(shí)現(xiàn)熒光信號的放大和高檢測靈敏度。因此，本文就反應(yīng)激活型酶熒光探針的一般設(shè)計策略，4種與疾病相關(guān)的重要生物標(biāo)志酶的反應(yīng)激活型熒光探針的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

圖1 探針1與內(nèi)酰胺酶的響應(yīng)示意圖Fig.1 Proposed sensing mechanism for β-lactamase of probe 1

1 酶活性的檢測歷史

酶活性的檢測最早可以追溯到 1939年，當(dāng)時Gomoki[19]利用磷酸酶催化甘油三磷酸水解釋放出的磷酸能與鈣離子形成不溶于水的磷酸鈣鹽的特性測定了組織切片中磷酸酶的活性。這是首次基于酶的催化能力而設(shè)計的酶活性檢測方法。自此以后，一系列新型檢測方法如比色法[7-8]、電化學(xué)法[9]、酶聯(lián)免疫吸附法[10]、熒光探針法等被開發(fā)出來用于酶活性的檢測，大大地提高了檢測的靈敏度。1998年，Tsien等[20]設(shè)計開發(fā)了首例真正意義上能用于活細(xì)胞中內(nèi)酰胺酶活性檢測的熒光探針1 (圖1)。該探針將香豆素（能量給體）和熒光素（能量受體）用內(nèi)酰胺環(huán)基團(tuán)（可被內(nèi)酰胺酶特異性催化水解斷裂）連接。未與內(nèi)酰胺酶識別前，由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的存在，探針在520 nm 處有最大的熒光發(fā)射（熒光素的熒光發(fā)射峰）；酶識別探針后，內(nèi)酰胺環(huán)斷裂，香豆素與熒光素分離，F(xiàn)RET效應(yīng)被抑制，探針的最大熒光發(fā)射波長藍(lán)移至447 nm（香豆素的熒光發(fā)射峰）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示探針在兩個波長處的熒光強(qiáng)度比 ( I447/ I520)與酶的活性存在良好的線性關(guān)系，且熒光強(qiáng)度比在酶識別前后呈現(xiàn)高達(dá)70倍的增強(qiáng)。而且該探針具有較強(qiáng)的細(xì)胞穿膜能力，能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞內(nèi)酶活性的定性和定量檢測。從此，酶活性檢測熒光探針成為研究細(xì)胞內(nèi)生化過程和功能的一種有效的工具。近年來，得益于熒光檢測儀器特別是激光共聚焦顯微鏡等的發(fā)展，具有優(yōu)良性能的熒光團(tuán)的涌現(xiàn)（熒光素、羅丹明、氟硼二吡咯、萘酰亞胺、香豆素等）和熒光響應(yīng)機(jī)理[光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（photo induced electron transfer, PeT）、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（intramolecular charge transfer, ICT）、螺環(huán)開閉機(jī)理（spirocyclic switch）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等]的發(fā)展，涌現(xiàn)了一批優(yōu)秀的酶熒光探針[14-16,21-33]，使得對各種酶活性進(jìn)行實(shí)時原位檢測和可視化熒光成像成為可能，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的研究和發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2 反應(yīng)激活型酶熒光探針設(shè)計策略

反應(yīng)激活型酶熒光探針的設(shè)計策略通常有3種途徑來實(shí)現(xiàn)[34]。第1種途徑[圖2(a)]是在現(xiàn)有的熒光團(tuán)的基礎(chǔ)上引入一些保護(hù)基團(tuán)，在保護(hù)基團(tuán)的保護(hù)下，熒光團(tuán)處于熒光淬滅狀態(tài)。一旦與酶識別，酶的催化作用使保護(hù)基團(tuán)裂解，熒光團(tuán)的熒光重新恢復(fù)，從而達(dá)到對特定酶熒光響應(yīng)的目的。眾所周知，水解酶是一種具有極強(qiáng)水解能力的酶，因此這種設(shè)計策略特別適合外切型水解酶探針的設(shè)計，如糖苷酶、磷酸酶、肽酶等酶的探針設(shè)計。第2種途徑[圖2(b)]是利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，探針通常由能量供體熒光團(tuán)、受體熒光團(tuán)、連接臂3部分組成。酶的催化作用使得連接臂斷裂，供受體熒光團(tuán)分離，F(xiàn)RET效應(yīng)抑制，熒光信號發(fā)生改變。此種設(shè)計策略適合一些內(nèi)切型水解酶的探針設(shè)計，如β-內(nèi)酰胺酶、蛋白酶、磷酸二酯酶等。第3種途徑[圖 2(c)]是將探針分子的熒光團(tuán)進(jìn)行直接轉(zhuǎn)化，使得熒光團(tuán)的熒光性能發(fā)生變化，從而達(dá)到對酶活性熒光響應(yīng)的目的。此類設(shè)計策略比較適合一些氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶的探針設(shè)計。除了上述探針設(shè)計策略外，一些熒光探針的基本響應(yīng)機(jī)理如光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移[31]、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移[22-24]、螺環(huán)開閉[21,28]等同樣被廣泛用于酶探針的熒光響應(yīng)過程。

圖2 反應(yīng)激活型酶熒光探針的3種常見設(shè)計策略[34]Fig.2 Three common design strategies for reaction-activated probe for enzymes[34]

3 反應(yīng)激活型酶熒光探針的研究進(jìn)展

近年來，得益于熒光探針技術(shù)的日益成熟以及對酶的生化特性的深入理解，多種優(yōu)秀反應(yīng)激活型酶熒光探針被報道[21-33]。其中單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶均在人體內(nèi)生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，是重要的疾病標(biāo)志酶。開發(fā)識別這4種酶的可視化熒光探針一直備受關(guān)注。因此，本文將對近十年來檢測上述 4種疾病標(biāo)志酶的熒光探針的重要研究進(jìn)展分別進(jìn)行評述。

3.1 單胺氧化酶熒光探針的研究進(jìn)展

單胺氧化酶（monoamine oxidase, MAOs, EC 1.4.3.4）是人體內(nèi)一種催化各種胺類物質(zhì)發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)的膜結(jié)合線粒體酶，在人體內(nèi)維持神經(jīng)遞質(zhì)和有機(jī)胺類水平動態(tài)平衡方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[35]。據(jù)文獻(xiàn)報道，單胺氧化酶在腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生命活動過程中扮演著關(guān)鍵的角色，其活性的異常變化與多種神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂引起的神經(jīng)退行性疾病和精神病的發(fā)生有關(guān)[6,36]。近年來單胺氧化酶已經(jīng)成為各種腦紊亂相關(guān)疾病的重要治療靶標(biāo)。因此開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)高靈敏、高選擇性、實(shí)時原位檢測生物體系中單胺氧化酶活性的熒光探針具有十分重要的生物醫(yī)學(xué)意義。近年來，已經(jīng)出現(xiàn)一大批能夠用于生物體系中單胺氧化酶活性檢測的熒光探針[25,27,30,37-46]。2005年，Sames等[37]報道了首例能夠用于線粒體（從細(xì)胞中分離出來）內(nèi)單胺氧化酶活性檢測的熒光探針2 (圖3)。該探針是基于酶促氧化后探針分子發(fā)生環(huán)化反應(yīng)和 PeT機(jī)理設(shè)計而成。探針分子中對香豆素母體具有強(qiáng)PeT效果的氨乙基在單胺氧化酶的催化下，發(fā)生脫氨基作用形成乙醛，接著乙醛再與苯環(huán)上的氨基發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化形成吲哚環(huán)結(jié)構(gòu)，使得PeT效應(yīng)被抑制，從而實(shí)現(xiàn)熒光“OFF-ON”的效果。該探針巧妙地在香豆素母體的6號碳位上引入氨基，7號碳位上引入氨乙基。這種基團(tuán)引入方式不僅能夠防止副產(chǎn)物的產(chǎn)生，而且能夠在短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對單胺氧化酶高達(dá)200倍的熒光響應(yīng)。

圖3 探針2與單胺氧化酶的響應(yīng)示意圖Fig.3 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 2

2007年，Chang等[38]設(shè)計合成了兩例能夠用于活細(xì)胞內(nèi)單胺氧化酶活性檢測的探針3和4 (圖4)。這兩例探針均以具有優(yōu)良光物理性能和良好生物相容性的熒光團(tuán)試鹵靈（resorufin）為母體，在母體基礎(chǔ)上引入丙胺基醚衍生物，使探針處于熒光淬滅狀態(tài)。在單胺氧化酶的催化下，探針分子經(jīng)過氧化、β-消去反應(yīng)釋放出試鹵靈熒光團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)熒光增強(qiáng)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，探針 3和4不僅能在體外實(shí)現(xiàn)對單胺氧化酶高靈敏的熒光響應(yīng)，而且還能在單胺氧化酶過表達(dá)的PC12神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對單胺氧化酶活性的檢測。

圖4 探針3、4與單胺氧化酶的響應(yīng)示意圖Fig. 4 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 3, 4

圖5 探針5、6與單胺氧化酶的響應(yīng)示意圖及探針5的細(xì)胞成像圖Fig.5 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 5,6 and fluorescent images of 5 in living cells

與單光子熒光探針相比，雙光子熒光探針具有較強(qiáng)的組織穿透能力，能夠降低組織自發(fā)熒光的干擾，降低激發(fā)光對細(xì)胞的損傷，避免光致漂白的發(fā)生等優(yōu)點(diǎn)，因此特別適合生物體系中酶活性的檢測[47]。2012年，Kim 等[39]設(shè)計合成了兩例能夠用于活細(xì)胞內(nèi)單胺氧化酶檢測和成像的雙光子熒光探針5和6 (圖5)。探針5和6均以萘的衍生物為熒光團(tuán)母體，分別引入氨丙基和N-甲基氨丙基作為識別基團(tuán)。在單胺氧化酶的催化下，處于熒光淬滅狀態(tài)的探針經(jīng)過氧化反應(yīng)、消去反應(yīng)、分子內(nèi)縮合成環(huán)3個步驟轉(zhuǎn)化成強(qiáng)熒光發(fā)射的產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對單胺氧化酶的熒光響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示探針5和6不僅能夠在體外實(shí)現(xiàn)對單胺氧化酶的快速響應(yīng)，而且還具有較強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力，能夠在嗜鉻細(xì)胞中對高表達(dá)的單胺氧化酶實(shí)現(xiàn)高分辨率的雙光子成像。

人體內(nèi)的單胺氧化酶具有兩種不同的異構(gòu)體，單胺氧化酶A(MAO A)和單胺氧化酶B (MAO B)。這兩種異構(gòu)體不僅具有形狀不同的活性中心、不同的底物選擇性、不同的抑制劑敏感性，而且在人體內(nèi)具有不同的空間分布和生理作用[48]。遺憾的是，很多探針都不能高選擇性地將這兩種異構(gòu)體區(qū)分開來。2012年，Zhu等[40]設(shè)計合成了一例對MAO B具有高度選擇性的熒光探針7 (圖6)。該探針以香豆素為母體，在母體上引入1-甲基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶作為識別基團(tuán)。探針7與MAO B發(fā)生特異性識別后，在酶的催化下，發(fā)生氧化反應(yīng)和水解反應(yīng)釋放出香豆素?zé)晒鈭F(tuán)，實(shí)現(xiàn)對MAO B的熒光響應(yīng)。分子對接表明探針7能夠與MAO B 活性部位中的羥基發(fā)生較強(qiáng)的氫鍵作用，而與 MAO A 活性部位羥基之間沒有顯著的氫鍵作用。因此，探針7能將兩種單胺氧化酶異構(gòu)體區(qū)分開來，實(shí)現(xiàn)對MAO B活性的特異性檢測。

圖6 探針7與單胺氧化酶B的響應(yīng)示意圖Fig. 6 Proposed sensing mechanism for MAO B of probe 7

2014年，Yao等[25]設(shè)計合成了首例能夠用于帕金森疾病模型中MAO B特異性檢測和成像的雙光子熒光探針8 (圖7)。該探針以典型雙光子熒光團(tuán)acedan（2-甲氨基-6-乙酰基萘）為母體，以丙胺作為識別基團(tuán)，母體與識別基團(tuán)之間用氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)單元作為連接結(jié)構(gòu)。具有強(qiáng)拉電子能力的氨基甲酸酯會破壞acedan熒光團(tuán)的推拉電子體系，使探針處于熒光淬滅狀態(tài)。與MAO B識別后，在酶的催化作用下，探針發(fā)生氧化反應(yīng)和β-消去反應(yīng)釋放出acedan熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對MAO B的熒光響應(yīng)。分子對接顯示，該探針能夠與MAO B的活性口袋（長且窄）發(fā)生高親和力的結(jié)合而與MAO A的活性口袋結(jié)合親和力較差。因此該探針能夠很好地將兩種異構(gòu)體區(qū)分開來，實(shí)現(xiàn)對MAO B的特異性檢測。將該探針用于一系列帕金森疾病模型和臨床樣品中MAO B活性的檢測和成像，進(jìn)一步驗(yàn)證了MAO B是帕金森疾病發(fā)展過程的一種重要的生物標(biāo)志酶，探針8具有應(yīng)用于臨床上診斷帕金森疾病的潛能。

與增強(qiáng)型或淬滅型熒光探針相比，比率型熒光探針在生物體系（細(xì)胞、組織、活體等）中酶活性的檢測方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢。這類探針利用兩個波長處的熒光強(qiáng)度比例變化顯示酶活性變化，因此能夠很好地排除探針濃度、生物體系微環(huán)境因素（pH、溫度、極性等）、激發(fā)光源強(qiáng)度、儀器測量誤差等因素的影響，實(shí)現(xiàn)高靈敏度、高精確度的酶活性檢測[49-50]。

圖7 探針8與單胺氧化酶B的響應(yīng)示意圖Fig. 7 Proposed sensing mechanism for MAO B of probe 8

圖8 探針9與單胺氧化酶A的響應(yīng)示意圖及細(xì)胞成像圖Fig. 8 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 9 and fluorescent images in living cells

2016年，Ma等[30]報道了一例能夠選擇性檢測活細(xì)胞內(nèi)MAO A活性的比率型熒光探針9 (圖8)。該探針以1, 8-萘酰亞胺為母體，在母體上引入丙胺作為識別基團(tuán)。未與MAO A識別前，該探針在波長454 nm處具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射。一旦與MAO A發(fā)生特異性識別，探針將發(fā)生氧化反應(yīng)和 1,6-消去反應(yīng)使熒光團(tuán)4-羥基-N-丁基-1,8-萘酰亞胺（最大發(fā)射波長為550 nm）釋放出來。酶促反應(yīng)前后，兩個波長處的熒光強(qiáng)度比（I550/ I454）發(fā)生明顯的變化，實(shí)現(xiàn)對MAO A的比率響應(yīng)。最重要的一點(diǎn)是，該探針對兩種單胺氧化酶異構(gòu)體具有明顯的親和力強(qiáng)弱的差異，其對MAO A的親和力明顯強(qiáng)于MAO B。因此該探針能夠很好地將兩種異構(gòu)體區(qū)分開來，實(shí)現(xiàn)對MAO A活性的特異性檢測。作者將該探針成功地應(yīng)用于MAO A表達(dá)水平存在明顯差異的兩種細(xì)胞中成像。結(jié)果顯示MAO A高水平表達(dá)的HeLa細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度比例顯著地強(qiáng)于MAO A低水平表達(dá)的NIH-3T3細(xì)胞。

3.2 β-半乳糖苷酶探針的研究進(jìn)展

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal，EC 3.2.1.23）是人體內(nèi)一種具有重要生理病理作用的水解酶，其主要生理功能是催化水解糖苷鍵，將乳糖轉(zhuǎn)化成半乳糖。據(jù)文獻(xiàn)報道，該酶的表達(dá)水平與細(xì)胞衰老[22]、某些癌癥的發(fā)生[2]存在密切關(guān)系。因此，β-半乳糖苷酶活性的檢測在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域存在重要的意義。相比其他檢測手段，利用熒光探針技術(shù)來實(shí)現(xiàn)生物體系中β-半乳糖苷酶活性的檢測具有重大優(yōu)勢。最早使用熒光探針來檢測β-半乳糖苷酶活性可以追溯到1963年，Edelstein等[51]開發(fā)了一例β-半乳糖苷酶熒光探針10 (圖9)。遺憾的是，該探針的細(xì)胞穿透能力較差，不能直接用于細(xì)胞或組織成像，只有借助低滲振蕩或細(xì)胞固定的方法將探針傳送到細(xì)胞內(nèi)才能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi) β-半乳糖苷酶活性檢測。但近年來，許多性能優(yōu)異的β-半乳糖苷酶熒光探針[2,21-23,52-57]被設(shè)計合成出來。日本東京大學(xué)的Nagano等十多年來一直致力于 β-半乳糖苷酶探針的研究，設(shè)計合成了一系列β-半乳糖苷酶熒光探針，在β-半乳糖苷酶熒光探針的開發(fā)和理論研究方面做出了卓越的貢獻(xiàn)。

圖9 探針10與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖Fig.9 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 10

圖10 探針11與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖Fig.10 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 11

2005年，Nagano等[52]設(shè)計合成了一例基于熒光素PeT機(jī)理的熒光探針11 (圖10)。該探針的設(shè)計靈感來源于對羧基熒光素PeT機(jī)理的深入理解。他們研究發(fā)現(xiàn)熒光素中位苯環(huán)上的取代基團(tuán)類型（影響電子供體的氧化勢能）和氧蒽雜環(huán)上苯酚基的存在形式（影響電子受體的還原勢能）對熒光素的PeT效果和熒光量子產(chǎn)率具有顯著的影響。通過調(diào)整中位苯環(huán)上基團(tuán)的取代類型以及氧蒽雜環(huán)上苯酚基的存在形式（質(zhì)子化形式或去質(zhì)子化形式）可以實(shí)現(xiàn)對熒光發(fā)射效果的調(diào)控。探針11在羧基熒光素的基礎(chǔ)上，中位苯環(huán) 2號位上的羧基被替換成甲基，4號位引入新的基團(tuán)甲氧基，氧蒽雜環(huán)上的酚羥基被半乳糖取代。探針11未與β-半乳糖苷酶識別之前，由于氧蒽雜環(huán)的酚羥基被半乳糖取代，因此中位苯環(huán)部分對氧蒽雜環(huán)的PeT效應(yīng)足夠強(qiáng)，此時探針的熒光量子產(chǎn)率較低，熒光幾乎處于淬滅狀態(tài)。當(dāng)β-半乳糖苷酶與探針識別后，在酶的催化下，半乳糖從探針分子上斷裂，生成的產(chǎn)物在中性或堿性環(huán)境下以去質(zhì)子化的苯酚離子形式存在，此時中位苯環(huán)部分對氧蒽雜環(huán)的PeT效應(yīng)大大減弱，熒光量子產(chǎn)率升高，熒光發(fā)射得以恢復(fù)。雖然該探針能夠在體外實(shí)現(xiàn)對 β-半乳糖苷酶活性高達(dá) 440倍的熒光響應(yīng)，但是其細(xì)胞成像的效果卻并不十分理想。最大的問題在于該探針被水解后的產(chǎn)物在細(xì)胞中的保留效果較差。

為了解決這個問題，該團(tuán)隊(duì)[53]于 2007年報道了一例新型熒光探針12 (圖11)。該探針在探針 11的基礎(chǔ)上引入乙酰羥甲基酯（acetoxymethyl，AM）以增加其細(xì)胞內(nèi)保留能力。探針進(jìn)入細(xì)胞被β-半乳糖苷酶水解后，緊接著被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解，使得探針以羧酸離子形式存在，親水性大大增強(qiáng)，不容易擴(kuò)散出細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的高分辨率成像。該探針還可對小鼠腫瘤模型中外源性β-半乳糖苷酶活性進(jìn)行檢測和成像（外源性β-半乳糖苷酶通過連接抗生素蛋白而定位于癌細(xì)胞）。但不足的是，該探針需要兩種酶的協(xié)同作用，響應(yīng)時間較慢。而且酯酶在細(xì)胞外區(qū)域普遍存在，可能會使得探針未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)之前就被酯酶水解成水溶性的羧酸鹽形式，影響其進(jìn)入細(xì)胞的能力，使得活體內(nèi)成像效果降低。

為了進(jìn)一步改善此問題，該團(tuán)隊(duì)[54]于 2011年報道了一例新型β-半乳糖苷酶熒光探針13 (圖12)。該探針能夠完美解決細(xì)胞穿透能力限制、細(xì)胞內(nèi)保留能力差等問題，實(shí)現(xiàn)對果蠅組織中β-半乳糖苷酶活性的高分辨率成像。該探針不再以PeT為熒光響應(yīng)機(jī)理，而是以氧蒽雜環(huán)類探針的另一種常見的探針設(shè)計機(jī)理——螺環(huán)開閉機(jī)理設(shè)計而成。未被β-半乳糖苷酶水解前，在生理pH條件下，探針主要以螺環(huán)形式存在，處于熒光淬滅狀態(tài)。一旦被β-半乳糖苷酶水解，生成的產(chǎn)物在生理pH條件主要以螺環(huán)開環(huán)的形式存在，能夠發(fā)射強(qiáng)熒光，從而實(shí)現(xiàn)對β-半乳糖苷酶高達(dá)76倍的熒光響應(yīng)。遺憾的是，該探針不能很好地用于小鼠腫瘤模型內(nèi)β-半乳糖苷酶的成像，主要原因在于該探針存在較高的熒光背景強(qiáng)度。

圖11 探針12與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖Fig.11 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 12

圖12 探針13與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖Fig.12 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 13

為了進(jìn)一步提高探針的成像信噪比，實(shí)現(xiàn)小鼠腫瘤模型內(nèi)β-半乳糖苷酶的識別及高分辨成像，該團(tuán)隊(duì)[21]于 2015年設(shè)計了一例能夠用于小鼠腹膜小轉(zhuǎn)移瘤內(nèi)β-半乳糖苷酶成像的熒光探針14 (圖13)。該探針在探針 13的基礎(chǔ)上，引入強(qiáng)拉電子基團(tuán)亞甲基三氟化碳結(jié)構(gòu)單元（—CH2—CF3）來提高螺環(huán)狀態(tài)的存在比例（未與酶識別之前），從而降低探針分子的背景熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對β-半乳糖苷酶更大的熒光響應(yīng)比例。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針能夠在生理pH條件下實(shí)現(xiàn)對β-半乳糖苷酶高達(dá)1420倍的熒光響應(yīng)。作者不僅將該探針用于7種卵巢癌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶的可視化熒光成像，而且還實(shí)現(xiàn)了卵巢癌小鼠模型內(nèi)窺鏡成像，表明該探針具有應(yīng)用于臨床上診斷卵巢癌轉(zhuǎn)移和熒光指導(dǎo)手術(shù)切除腫瘤的潛能。

2016年，Han等[57]報道了一例基于ICT機(jī)理的雙光子比率型熒光探針15 (圖14)。該探針在具有雙光子發(fā)射性能的 1,8-萘酰亞胺熒光團(tuán)上引入半乳糖，半乳糖的引入使得熒光團(tuán)的ICT程度發(fā)生變化，熒光發(fā)射峰藍(lán)移至 440 nm。與 β-半乳糖苷酶識別后，在酶的水解作用下，探針釋放出1,8-萘酰亞胺熒光團(tuán)（最大發(fā)射波長為545 nm），實(shí)現(xiàn)對β-半乳糖苷酶的熒光比率響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針能夠成功實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞和活體內(nèi)β-半乳糖苷酶的高分辨率雙光子成像。

圖13 探針14與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖及細(xì)胞成像圖Fig.13 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 14 and fluorescent images in living cells

圖14 探針15與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖Fig.14 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 15

圖15 探針16與β-半乳糖苷酶的響應(yīng)示意圖及細(xì)胞成像圖Fig.15 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 16 and fluorescent images in living cells

同年，Zhu等[23]報道了一例近紅外比率型熒光探針16 (圖15)。該探針以苯并吡喃腈的衍生物為母體，在母體上引入半乳糖單元作為識別基團(tuán)。苯并吡喃腈的衍生物具有典型的D-π-A電子推拉體系、光穩(wěn)定性極好、發(fā)射波長位于近紅外區(qū)域而且具有約150 nm的斯托克斯位移，是一種具有優(yōu)良光物理性能的近紅外熒光團(tuán)。該探針同樣利用典型的ICT機(jī)理設(shè)計而成，β-半乳糖苷酶水解前后，探針的ICT程度發(fā)生明顯變化，熒光最大發(fā)射波長紅移（從500 nm紅移至685 nm），實(shí)現(xiàn)對β-半乳糖苷酶的比率型熒光響應(yīng)?；诒讲⑦拎嫜苌锪己玫臒晒庑阅芤约疤结樀谋嚷薯憫?yīng)效果，該探針被成功應(yīng)用于卵巢癌細(xì)胞內(nèi)熒光成像和結(jié)腸癌小鼠模型內(nèi)β-半乳糖苷酶活性的高分辨率三維成像。

3.3 硝基還原酶探針的研究進(jìn)展

硝基還原酶（nitroreductase, NTR, EC 1.7.99.4）是人體內(nèi)一種代謝芳香族硝基化合物或者硝基取代的雜環(huán)化合物的還原酶。據(jù)文獻(xiàn)報道，硝基還原酶濃度的升高與缺氧腫瘤的發(fā)生、侵襲和遷移存在密切的關(guān)系[3-5]。腫瘤的低氧通常伴隨著微脈管的異常增生，因此會限制化療藥物擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤內(nèi)部，使治療效果大大降低[58]。因此檢測腫瘤內(nèi)硝基還原酶的活性可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷和化療藥物的抗癌效果的評估。近年來，一系列性能優(yōu)良的小分子熒光探針[3-5, 24, 26, 31-32, 59-61]被開發(fā)出來用于缺氧腫瘤內(nèi)硝基還原酶活性的實(shí)時原位監(jiān)控和可視化熒光成像。

硝基還原酶熒光探針的設(shè)計原理大致可以分為兩類，即基于多米諾反應(yīng)機(jī)理和基于硝基直接還原成氨的反應(yīng)機(jī)理實(shí)現(xiàn)在硝基還原酶識別前后熒光信號的改變[62]。所謂的多米諾反應(yīng)機(jī)理是指探針上硝基還原酶識別基團(tuán)硝基被酶還原成羥胺或氨基后電子重新排列而誘導(dǎo)碳氧鍵斷裂反應(yīng)（電子重排和1, 6-消去反應(yīng)），釋放出熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)熒光信號的改變?；诖朔磻?yīng)機(jī)理，Qian等[24]于2011年報道了一例能夠?qū)崿F(xiàn)硝基還原酶比率型檢測的熒光探針17 (圖16)。該探針以萘酰亞胺衍生物為熒光團(tuán)，在熒光團(tuán)上引入硝基芐基單元作為識別基團(tuán)，識別基團(tuán)與熒光團(tuán)之間通過對氨基甲酸酯結(jié)構(gòu)單元連接。具有強(qiáng)吸電子能力的氨基甲酸酯的存在削弱了萘酰亞胺分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移程度，使熒光探針發(fā)射波長藍(lán)移至475 nm。一旦硝基還原酶識別探針，探針通過多米諾反應(yīng)將萘酰亞胺（最大發(fā)射波長為550 nm）釋放，從而實(shí)現(xiàn)對硝基還原酶的比率型熒光響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針具有較好的生物相容性和細(xì)胞穿膜能力，能夠用于不同缺氧狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)硝基還原酶活性的監(jiān)測以及體外腫瘤內(nèi)硝基還原酶的成像研究。

圖16 探針17與硝基還原酶的響應(yīng)示意圖Fig.16 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 17

2013年，基于上述同樣的機(jī)理，Ma等[59]設(shè)計合成了一例高靈敏的硝基還原酶熒光探針 18 (圖17)。該探針以試鹵靈為熒光團(tuán)，在熒光團(tuán)上引入5-硝基呋喃作為識別基團(tuán)。未與硝基還原酶識別前，5-硝基呋喃的引入使探針處于熒光淬滅狀態(tài)。一旦與硝基還原酶發(fā)生特異性識別，探針發(fā)生多米諾分解反應(yīng)釋放出試鹵靈熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)熒光響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針可用于缺氧腫瘤細(xì)胞中硝基還原酶活性的檢測和可視化成像研究。

2015年，Zhang等[32]報道了一例能夠用于腫瘤細(xì)胞和組織內(nèi)硝基還原酶檢測和可視化成像的雙光子熒光探針19 (圖18)。該探針以具有優(yōu)良雙光子發(fā)射性能的萘衍生物作為熒光團(tuán)，引入對硝基芐基作為識別基團(tuán)。硝基還原酶識別前后，探針出現(xiàn)高達(dá)70倍的熒光強(qiáng)度變化。作者利用該探針成功實(shí)現(xiàn)缺氧HeLa細(xì)胞中硝基還原酶的高分辨率雙光子成像，進(jìn)一步驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)與硝基還原酶濃度的關(guān)系。

圖17 探針18與硝基還原酶的響應(yīng)示意圖Fig.17 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 18

另一種常見的用于設(shè)計硝基還原酶探針的策略為基于熒光團(tuán)上的硝基直接還原為氨基的反應(yīng)機(jī)理。通過將吸電子基團(tuán)硝基直接轉(zhuǎn)化成氨基使得熒光團(tuán)分子內(nèi)的電子云分布或電子環(huán)境發(fā)生顯著改變，從而實(shí)現(xiàn)熒光性能的變化?；诖嗽O(shè)計策略，2013年，Tang等[31]報道了一例近紅外硝基還原酶探針20 (圖19)。該探針以具有近紅外發(fā)射性能的七甲川菁染料為母體，在母體上引入硝基咪唑作為識別基團(tuán)。硝基還原酶將吸電子基團(tuán)硝基咪唑直接還原成氨基咪唑從而實(shí)現(xiàn)熒光從淬滅到恢復(fù)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該探針在不同氧氣水平條件下的熒光成像強(qiáng)度存在明顯差異，低氧條件下熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。作者成功將該探針用于研究實(shí)體瘤變化時上皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程與細(xì)胞內(nèi)的缺氧狀態(tài)之間的關(guān)系。

圖18 探針19與硝基還原酶的響應(yīng)示意圖及缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞成像圖Fig.18 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 19 and fluorescent images in living cells under hypoxic conditions

2015年，Li等[26]報道了一例超靈敏的近紅外硝基還原酶探針21 (圖20)。探針分子中的硝基苯基團(tuán)在硝基還原酶的催化下被直接還原成苯胺從而實(shí)現(xiàn)熒光從淬滅到恢復(fù)的變化。作者合成了5例探針來研究硝基在苯環(huán)上的取代位置以及硝基苯與熒光團(tuán)母體之間的連接基團(tuán)類型對酶識別能力的影響，最終發(fā)現(xiàn)探針21（對硝基取代，酯鍵連接）與酶具有最強(qiáng)的親和力和識別效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示探針21能夠?qū)崿F(xiàn)對硝基還原酶高達(dá)110倍的熒光響應(yīng)?；谠撎结樀某`敏和高選擇響應(yīng)效果以及優(yōu)良的近紅外發(fā)射性能，作者將該探針成功用于缺氧條件下A549細(xì)胞內(nèi)成像及小鼠低氧腫瘤模型內(nèi)高分辨率成像。

圖19 探針20與硝基還原酶的響應(yīng)示意圖及不同氧氣狀態(tài)下的細(xì)胞成像圖Fig.19 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 20 and fluorescent images in living cells under different oxygen conditions

圖20 探針21與硝基還原酶的響應(yīng)示意圖及缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞及活體成像圖Fig.20 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 21 and fluorescent images in living cells under hypoxic conditions and in vivo

3.4 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶探針的研究進(jìn)展

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-gumatyl transpeptidase, GGT, EC 2.3.3.2）是人體內(nèi)一種重要的細(xì)胞膜結(jié)合酶，主要功能是選擇性催化裂解γ-谷氨?；鵞63]。據(jù)文獻(xiàn)報道，GGT在體內(nèi)發(fā)揮著關(guān)鍵的生理病理作用，例如藥物濫用所導(dǎo)致的肝臟損傷通常伴隨著 GGT 水平升高[64]，一些癌癥如子宮頸癌、卵巢癌等的發(fā)生和發(fā)展也與癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的 GGT水平存在密切關(guān)系[65-66]。因此，開發(fā)高效的檢測手段用于體內(nèi)GGT活性的檢測具有巨大的應(yīng)用價值。2011年，Urano等[28]報道了一例基于羅丹明螺環(huán)開閉機(jī)理的 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光探針22 (圖21)。該探針以羅丹明為母體，在母體上引入谷氨酸作為識別基團(tuán)。未與GGT識別前，探針以螺環(huán)形式存在而處于熒光淬滅狀態(tài)。當(dāng)探針與 GGT發(fā)生識別作用后，在酶的催化下，探針中的γ-谷氨酰基團(tuán)斷裂，分子內(nèi)電子重排誘導(dǎo)螺環(huán)打開，從而實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針不僅能夠在 11種人卵巢癌細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)高分辨率成像，還能夠通過外表直接噴灑探針溶液的方式在超短時間內(nèi)（1 min）實(shí)現(xiàn)卵巢癌小鼠模型內(nèi)高信噪比成像?；谠撎结槼哽`敏、超快速響應(yīng)、高分辨活體成像效果，該探針具有應(yīng)用于臨床上手術(shù)指導(dǎo)腫瘤切除的潛能。

2015年，F(xiàn)an等[29]報道了一例比率型γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶探針 23 (圖 22)。該探針是以氟硼二吡咯（boron dipyrromethene, BODIPY）為母體，在母體上引入谷胱甘肽作為識別基團(tuán)。谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶識別探針后，在酶的催化下，探針發(fā)生γ-谷酰基轉(zhuǎn)移作用，釋放出半胱氨酸的氨基，接著氨基對硫原子發(fā)生親核攻擊，形成分子內(nèi)的N-S交換，產(chǎn)生氨基取代的BODIPY，從而實(shí)現(xiàn)酶促反應(yīng)前后熒光信號的變化，達(dá)到對γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光響應(yīng)的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針能夠在體外達(dá)到對γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶快速、高選擇性、比率響應(yīng)的效果，并且被成功用于卵巢癌細(xì)胞內(nèi)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的檢測和高分辨率成像。

同年，Ma等[67]報道了一例高靈敏的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光探針24 (圖23)。該探針以甲酚紫為熒光團(tuán)母體，在母體的氨基位置上引入谷氨酸作為識別基團(tuán)。利用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的谷?；D(zhuǎn)移作用將谷氨酸從探針分子上斷裂下來，釋放出具有強(qiáng)熒光發(fā)射效果的甲酚紫熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)熒光“OFF-ON”的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該探針不僅能被用于活細(xì)胞內(nèi)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光成像和人血清中 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性的檢測，而且還成功實(shí)現(xiàn)了對正常人血清樣品和肝癌患者血清樣品的區(qū)分。

2016年，Wu等[33]報道了一例γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶雙光子熒光探針25 (圖24)。該探針以苯并吡喃腈作為熒光團(tuán)母體，谷氨酸作為識別基團(tuán)。在γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的催化作用下，處于熒光淬滅狀態(tài)的探針將發(fā)生谷氨?；D(zhuǎn)移作用釋放出強(qiáng)熒光發(fā)射的苯并吡喃腈熒光團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的熒光響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針不僅能在人卵巢癌A2580細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)對 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的單光子與雙光子熒光成像，而且還能夠用于斑馬魚模型內(nèi) γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光成像。利用斑馬魚模型，該探針成功揭示了γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性與藥物導(dǎo)致的肝損傷之間的關(guān)系。

圖21 探針22與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶響應(yīng)示意圖Fig.21 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 22

圖22 探針23與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶響應(yīng)示意圖Fig.22 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 23

4 總結(jié)和展望

綜上所述，本文主要綜述了反應(yīng)激活型酶識別熒光探針的設(shè)計策略及與重大疾病密切相關(guān)的單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶熒光探針的研究現(xiàn)狀。雖然目前相應(yīng)的酶熒光探針取得了一定的進(jìn)展，但還是有如下亟待解決的問題。

（1）目前識別亞細(xì)胞器中酶的熒光探針報道基本沒有，而不同細(xì)胞器中酶活性的不同可能會引起不同的疾病，因此研制新型靶向識別不同細(xì)胞器中酶的熒光探針會成為廣大科研工作者的研究熱點(diǎn)。

（2）設(shè)計合成生物相容性好、水溶性適中、能對活體內(nèi)深層組織中酶活性檢測和可視化成像的近紅外熒光探針仍是一個重要的研究領(lǐng)域。

（3）為提高對酶識別的選擇靈敏度和成像時空分辨率，發(fā)展比率型雙光子酶識別熒光探針也會是未來十分活躍的研究領(lǐng)域。

（4）隨著蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，越來越多的與疾病相關(guān)的標(biāo)志酶被挖掘，而識別新標(biāo)志酶的熒光探針的研究將受到廣泛的關(guān)注。

圖23 探針24與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶響應(yīng)示意圖及血清與細(xì)胞成像圖Fig.22 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 24 and fluorescent images in living cells and serum

圖24 探針25與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶響應(yīng)示意圖及細(xì)胞成像圖Fig.24 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 25 and fluorescent images in living cells

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Progress in research of reaction-activated fluorescent probe for enzymes

QIAN Ming, ZHANG Liuwei, WANG Jingyun
(School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China)

Enzyme plays an extremely important role in maintaining homeostasis and the normal life activities in biological systems. The abnormality of some particular enzymes activity is closely relevant to the occurrence and development of related diseases. Therefore, it is of great significance to detect and visualize specific enzyme in vivo with an in-situ and real-time method. The chemical fluorescent probes are endowed with the obvious advantages such as good selectivity, high sensitivity, high imaging resolution and so forth. In recent years, researchers have designed and synthesized a series of fluorescent probes for enzyme detection and visualized imaging in living systems. Based on the trigger mode of fluorescence response, the enzymatic fluorescent probes can be generally divided into two categories: (1) probes based on the recognition between enzyme and specific groups of its inhibitor existing in the probes, called inhibitor-based enzymatic fluorescent probes and (2) probes based on the effective catalytic ability of specific enzyme, also known as the reaction-activated enzymatic fluorescent probes. Herein, in this review, the design strategies of reaction-activated fluorescent probe for enzymes and the research progress of reaction-activated fluorescent probes for four important disease-related enzymes (monoamine oxidase, β-galactosidase, nitroreductase, γ-gumatyl transpeptidase) were mainly reviewed, and the future research of fluorescent probes for enzymes was prospected.

fluorescence; probes; enzyme; imaging; cell biology

Prof. WANG Jingyun, wangjingyun67@dlut. edu.cn

O 657.3

：A

：0438—1157（2017）01—0008—15

10.11949/j.issn.0438-1157.20161279

2016-09-12 收到初稿，2016-10-19 收到修改稿。

聯(lián)系人：王靜云。

：錢明（1993—），男，博士研究生。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21376039）。

Received date: 2016-09-12.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21376039).