張國(guó)森，王 玉，莊曉瑾，楊 劭，蔣金輝（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

沉水植物輪葉黑藻附生細(xì)菌對(duì)雙酚A的降解能力研究

張國(guó)森，王 玉，莊曉瑾，楊 劭，蔣金輝*（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430079）

沉水植物附生細(xì)菌可能具有降解轉(zhuǎn)化水體中雙酚A（BPA）能力從而影響該污染物在環(huán)境中的歸趨.以輪葉黑藻為代表，分離篩選其BPA降解附生菌，結(jié)果共獲得22株，在接種量為1×108個(gè)/mL，37℃下72h對(duì)BPA的去除率為11.46%～25.06%.選擇降解率最高的3株細(xì)菌B12、B14和B23，采用16S rDNA鑒定，結(jié)合生理生化反應(yīng)和形態(tài)觀察，3株細(xì)菌分別為屬于Lysinibacillus sp.（桿菌屬），Brevibacterium sp.（短桿菌屬）和Ochrobactrum sp.（蒼白桿菌屬）.將3株菌株添加至輪葉黑藻無(wú)菌苗體系中，發(fā)現(xiàn)BPA去除率顯著下降（P＜0.05）.物理去除部分野生輪葉黑藻表面部分附生細(xì)菌后，BPA去除率反而上升（約5%）.綜合本研究結(jié)果，沉水植物附生細(xì)菌具有降解BPA的能力，但在沉水植物-附生生物體系去除BPA過(guò)程中貢獻(xiàn)較?。s為23%， 2d），植物本身起關(guān)鍵作用.

附生細(xì)菌；BPA去除；沉水植物

雙酚A（BPA）是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，由于其使用廣泛，已成為一種全球性污染物，在世界各地多個(gè)水環(huán)境中被檢測(cè)出來(lái)［1］.研究表明，即使在環(huán)境低濃度下，BPA也可以對(duì)水生生物體產(chǎn)生不良影響，如當(dāng)水體中的BPA濃度在0.228μg/L 時(shí)，就會(huì)使斑馬魚(yú)后代雌性化［2］.而當(dāng)BPA濃度在1～10mg/L時(shí)，對(duì)所有水生生物均可以表現(xiàn)出急性毒性［3］.因此，水環(huán)境中BPA的去除已經(jīng)越來(lái)越引起人們重視.

沉水植物作為水環(huán)境中重要的初級(jí)生產(chǎn)者，是健康水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分.有研究表明沉水植物具有高效降解轉(zhuǎn)化水體中BPA的能力［4-5］，但其機(jī)制不明，其中可能存在附生生物群落的貢獻(xiàn)，特別是附生細(xì)菌.之前研究表明附生細(xì)菌在植物降解有機(jī)污染物的過(guò)程中具有貢獻(xiàn)作用［6-9］，所以推測(cè)輪葉黑藻表面可能存在具有降解BPA能力的附生細(xì)菌，但目前為止并未見(jiàn)附生細(xì)菌降解BPA的相關(guān)報(bào)道.研究沉水植物附生細(xì)菌對(duì)水體中BPA的降解轉(zhuǎn)化，將有助于進(jìn)一步了解沉水植物體系對(duì)BPA的高效降解機(jī)制，并為揭示該類(lèi)污染物的環(huán)境歸趨奠定基礎(chǔ).因此，本文選擇常見(jiàn)沉水植物輪葉黑藻（Hydrilla verticillata（L. f.） Royle），對(duì)其BPA降解附生細(xì)菌進(jìn)行了分離篩選和鑒定，并通過(guò)附生細(xì)菌添加和附生生物去除的相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究其在沉水植物體系高效降解BPA過(guò)程中的貢獻(xiàn).

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

雙酚A標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Acros Organics公司，純度為97%；乙腈及甲醇購(gòu)自美國(guó)TEDⅠA公司，為色譜純；其他化學(xué)藥品均為分析純.高效液相色譜為L(zhǎng)C20AT（SHⅠMADZU，日本），掃描電鏡為JSM-6700F（JEOL，日本）.

1.2 附生細(xì)菌的富集，分離，純化

LB培養(yǎng)基：牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂20g/L，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min.

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基： K2HPO4·3H2O 6g/L，KH2PO41g/L，NH4Cl 2.5g/L， MgSO4·7H2O 0.41g/L，MnSO4·H2O 0.056g/L， FeSO4·7H2O 0.01g/L，CaCl20.022g/L，pH 7.2～7.4，121℃滅菌20min.

附生細(xì)菌的富集，分離，純化：取在無(wú)菌自來(lái)水培養(yǎng)條件下的輪葉黑藻野生苗的培養(yǎng)水0.1mL，在無(wú)菌條件下涂布于含BPA（濃度為10mg/L）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃下富集培養(yǎng)24h后，選擇不同菌落，多次劃線(xiàn)分離后挑取單菌落，再將所得單菌落接種到以BPA（濃度為10mg/L）為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上，于37℃下培養(yǎng)24h后，反復(fù)劃線(xiàn)分離純化幾次得到單菌株.

1.3 附生細(xì)菌降解能力的測(cè)定

將篩選出來(lái)的單菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，10000g離心10min，棄上清，用無(wú)菌生理鹽水將菌體洗3次后，接種到BPA為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，BPA濃度為10mg/L，接種量為1×108個(gè)/mL，每組3個(gè)重復(fù)，均在37℃下振蕩培養(yǎng)72h后，檢測(cè)剩余BPA的濃度，并計(jì)算降解率：DR=（C0-Ct）/C0× 100%，其中DR為降解率，C0為初始BPA濃度，Ct為最終BPA濃度.

1.4 16S rDNA的擴(kuò)增和序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

收集菌體，提取DNA作為擴(kuò)增模板，擴(kuò)增引物序列：上游27f：AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG，下游1492r：TACGGCTACCT，酶為康為世紀(jì)EsTaq MasterMix，PCR反應(yīng)條件： 94℃ 5min，94℃30s，55℃ 30s， 72℃ 1min，循環(huán)30次，72℃延伸5min.產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).測(cè)序工作由上海生工生物公司完成.獲得的序列在NCBⅠ進(jìn)行Blast相似性搜索和同源性比對(duì)，采用ClustalX 1.8進(jìn)行序列匹配分析，通過(guò)MEGA 5.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建發(fā)育樹(shù).

1.5 附生降解菌添加到輪葉黑藻無(wú)菌苗

輪葉黑藻無(wú)菌苗的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)［10］.取約2cm輪葉黑藻的健壯芽尖，經(jīng)70 % 的乙醇浸泡3 0s及 10 % 的次氯酸鈉表面消毒10min后，用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5遍，放入MS（3%蔗糖）靜置培養(yǎng)，取長(zhǎng)出的無(wú)菌芽段用于實(shí)驗(yàn).按照上述處理（1.3）將不同組合細(xì)菌（包括單一組B12、B14、B23和混合組B12+B14、B12+B23、B14+B23、B12+ B14+B23，共7個(gè)處理組）接種到含有10mg/LBPA的無(wú)菌水中，并按照10g/L的比例添加輪葉黑藻無(wú)菌苗，分別記作輪葉黑藻+BPA+B12、輪葉黑藻+BPA+B14、輪葉黑藻+BPA+B23、輪葉黑藻+BPA+B12+B14、輪葉黑藻+BPA+B12+B23、輪葉黑藻+BPA+B14+B23、輪葉黑藻+BPA+B12+ B14+B23；同時(shí)設(shè)植物組（記作輪葉黑藻+BPA）、空白對(duì)照組（記作BPA）作為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù).降解體系250mL，溫度（25±1）℃，光照4000lux.每0，24h， 48h，72h，96h取樣測(cè)定水中BPA的濃度.

1.6 物理去除部分附生細(xì)菌

將采來(lái)的新鮮輪葉黑藻野生苗分為兩組，一組直接放入含有BPA的無(wú)菌水中進(jìn)行降解，記作未去附組；另一組參照文獻(xiàn)［11］的處理方法，經(jīng)超聲，渦旋處理后將植物放入含有BPA的無(wú)菌水中進(jìn)行降解，記作去附組；而將獲得的附生細(xì)菌離心（5000g，10min）收集后加入含有BPA的無(wú)菌水中進(jìn)行降解，記住附生組.降解體系和條件同1.5，每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù).處理2d后檢測(cè)水體中雙酚A的含量.

1.7 雙酚A的定量檢測(cè)

采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)雙酚A進(jìn)行檢測(cè)，樣品經(jīng)12000r/min離心10min，取上清過(guò)0.22μmol/L尼龍膜后，用HPLC檢測(cè).高效液相色譜儀為島津LC20AT，色譜柱為Agilent C18反相柱，色譜條件：乙腈：超純水=65：35（V/V），流速為1.0mL/min，紫外光檢測(cè)波長(zhǎng)278nm，進(jìn)樣量20μL.

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析采用一元方差分析，多重檢驗(yàn)采用Duncan法，數(shù)據(jù)的正態(tài)分布采用Kruskal-Wallis H方法檢驗(yàn)，方差齊性采用Levene方法檢驗(yàn)，顯著水平為0.05.

2 結(jié)果

2.1 附生細(xì)菌的篩選及降解效率測(cè)定

經(jīng)過(guò)富集純化后，在以BPA為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上共篩選出22株具有降解BPA能力的細(xì)菌，分別命名為B1～B22.降解菌的整體降解效率較低，在30%以下，其中10%以下10株，10%～20% 10株，20%以上2株.表1列出了降解率超過(guò)10%的細(xì)菌，共12株.由表1可以看出，B23和B14的降解效果最好，72h的降解率超過(guò)了25%，其次為B12.選取效果最好的3株細(xì)菌B12，B14和B23進(jìn)行下一步鑒定.

表1 附生細(xì)菌的BPA降解率Table 1 Degradation of BPA by the isolated epiphytic bacteria strains （mean ± SE， n=3）

2.2 附生細(xì)菌的鑒定

表2 菌株B12， B14和B23的形態(tài)特征Table 2 Colony morphological characteristics of strain B12， B14and B16

圖1 菌株B12， B14， B23的掃描電鏡照片（×10000）Fig.1 Scan electron micrographs of strain B12， B14and B23（×10000）

表3 菌株B12，B14和B23 16S rDNA 序列對(duì)比結(jié)果Table 3 Comparison of 16S rDNA sequences of strain B12， B14 and B23

選取降解效果最好的3株細(xì)菌B12、B14、B23進(jìn)行形態(tài)觀察（表2）和掃描電鏡觀察（圖1）.3種細(xì)菌在掃描電鏡下的形態(tài)均為桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性.3株細(xì)菌經(jīng)菌落PCR測(cè)序后，在GenBank上登錄進(jìn)行Blast對(duì)比，結(jié)果如表3所示 ，3株 細(xì) 菌 分 別 與Lysinibacillus sp.，Brevibacterium sp.， Ochrobactrum sp. 的相似度達(dá)到99%，結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征，3株細(xì)菌分別命名為L(zhǎng)ysinibacillus sp.B12，Brevibacterium sp.B14和Ochrobactrum sp.B23.圖2為3種細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位.

圖2 B12，B14和B23的16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育地位Fig. 2 Phylogenetic tree of strain B12， B14 and B23 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 附生細(xì)菌對(duì)輪葉黑藻無(wú)菌苗去除BPA的影響

圖3分別表示輪葉黑藻無(wú)菌苗及添加不同組合（單一組和混合組）附生降解菌B12，B14和B23對(duì)BPA的去除效率（a）及各組細(xì)菌的生長(zhǎng)情況（b）.可以看出輪葉黑藻無(wú)菌苗對(duì)BPA具有較高的去除效率，24h達(dá)到90.3%±1.08%，96h達(dá)到99.79%±1.08%.而添加不同組合附生降解菌B12，B14和B23到無(wú)菌苗系統(tǒng)后，顯著的影響了輪葉黑藻對(duì)BPA的去除（P＜0.05）.在24h時(shí)，對(duì)照組與處理組之間差距達(dá)到最大，而隨著時(shí)間的推移，二者之間的差距逐漸縮小，到96h時(shí)，二者差距最小，但單一組仍有顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）.而添加不同細(xì)菌組合的處理組去除率之間也存在差異， 混合組的去除率均顯著高于單一組（P＜0.05）.在單一組中，24h時(shí)輪葉黑藻+BPA+B23的BPA去除率顯著高于輪葉黑藻+BPA+B12和輪葉黑藻+BPA+B14（P＜0.05），到72h后，3個(gè)處理組的BPA去除效率差異消失（P＞0.05）.而混合組中，在24h時(shí)， BPA+輪葉黑藻+B12+B23的去除率最高，顯著高于其他3組（P＜0.05），48h后4個(gè)處理組的BPA去除率之間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），去除率均在90%以上.

圖3 輪葉黑藻無(wú)菌苗及添加不同組合附生細(xì)菌對(duì)BPA的去除率及細(xì)菌生長(zhǎng)情況Fig.3 BPA removal rates of the combinations of aseptic Hydrilla verticillata and the addition of epiphytic bacteria and growth （OD600） of epiphytic bacteria （The data are presented as mean ± SE of three individual experiments）

不同組合細(xì)菌添加到無(wú)菌苗體系中后，總體細(xì)菌數(shù)量均在增大（圖3b），但細(xì)菌的生長(zhǎng)速度不同.單一組中B23適應(yīng)期較短，24h生長(zhǎng)速度明顯高于其他2株細(xì)菌（P＜0.05），72h后B23的生長(zhǎng)速度均趨于平穩(wěn)，其他2株細(xì)菌仍有較快的生長(zhǎng)速度.不同細(xì)菌混合后，24h時(shí)細(xì)菌的總體生長(zhǎng)速度高于單一細(xì)菌，而72h后混合組細(xì)菌總量均出現(xiàn)下降趨勢(shì).各組細(xì)菌的生長(zhǎng)速度與上述處理組去除率之間的關(guān)系一致.

圖4是對(duì)照組和輪葉黑藻+BPA+B23在96h收獲后的掃描電鏡圖片，可以看出96h后對(duì)照組輪葉黑藻無(wú)菌苗表面并沒(méi)有細(xì)菌出現(xiàn)，而輪葉黑藻+BPA+B23中細(xì)菌已經(jīng)附著到輪葉黑藻無(wú)菌苗表面.

圖4 無(wú)附生菌添加與添加附生菌B23 96h后輪葉黑藻無(wú)菌苗的掃描電鏡照片（×5000）Fig.4 Scan electron micrographs of aseptic seedlings of Hydrilla veticillata with or without the epiphytic bacteria B23 addition （×5000， 96h treatment）

2.4 物理去除部分附生細(xì)菌對(duì)輪葉黑藻去除BPA的影響

圖5 附生細(xì)菌去除前后輪葉黑藻對(duì)BPA的去除率及收集的附生細(xì)菌對(duì)BPA的去除率（2d）Fig.5 BPA removal rates of Hydrilla verticillata （with or without epiphytic bacteria） and epiphytic bacteria （2-day treatment， mean ± SE）

物理處理（超聲+渦旋）被認(rèn)為是最佳的去除沉水植物附生細(xì)菌的手段.圖5為物理去除前后輪葉黑藻對(duì)BPA的去除率.由圖5可以看出，物理去除部分附生生物后，植物對(duì)BPA的去除能力增加，2d后去附組對(duì)BPA的去除率高于未去附組（約5%），但二者并沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）.同時(shí)，附生組對(duì)BPA去除率較低，2d的去除率僅為8.5%±2.11%，約占沉水植物-附生生物體系BPA總?cè)コ实?3%

3 討論

本研究通過(guò)直接篩選（表1）和物理去除（圖5）的方式證明沉水植物的附生細(xì)菌具有降解BPA的能力，降解效率在（11.46±2.38）%～（25.06± 1.63）%的范圍內(nèi)，與篩選的高效降解菌［12-13］相比效果較弱.原因可能是細(xì)菌中降解BPA的關(guān)鍵酶是誘導(dǎo)酶，其活性與環(huán)境中的BPA濃度相關(guān)［14］.高效降解菌通常篩自高污染的活性污泥或水體，高濃度的污染物會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌降解酶的表達(dá)或高效降解菌的富集，而采集輪葉黑藻的水體中BPA的濃度較低，并不利于該類(lèi)污染物高效降解菌群體的發(fā)展，所以附生細(xì)菌的降解效率普遍較低，這與Kang等［15］發(fā)現(xiàn)的自然水體中BPA降解細(xì)菌普遍存在但降解效率低的結(jié)果類(lèi)似.另外當(dāng)附生細(xì)菌與植物共存時(shí)，植物會(huì)分泌如糖類(lèi)，脂肪酸等供細(xì)菌利用［16］，這些物質(zhì)會(huì)比BPA等污染物更容易被細(xì)菌作為碳源利用，減少了污染物對(duì)細(xì)菌的誘導(dǎo)，進(jìn)一步降低了其對(duì)污染物的降解能力［17］.鄭師章等［18］在研究鳳眼蓮的附生細(xì)菌降解酚時(shí)也得出類(lèi)似結(jié)果.很多研究表明［19-20］附生細(xì)菌與植物一同降解有機(jī)污染物可能是一個(gè)普遍存在的現(xiàn)象，但關(guān)于植物與附生細(xì)菌在降解污染物過(guò)程中各自所占比例研究較少.多數(shù)研究證明將獲得的降解菌添加到植物表面后會(huì)影響植物的降解效率，有些降解效率提高，有些則會(huì)降低，這可能與降解環(huán)境有關(guān)，包括植物物種、微生物物種及污染物種類(lèi)［18,21-22］.Toyama等［20］在研究Spirodela及根際細(xì)菌對(duì)污染物降解效果時(shí)發(fā)現(xiàn)，植物與細(xì)菌在降解體系中的貢獻(xiàn)與污染物的種類(lèi)有關(guān)，在降解苯酚時(shí)主要是根際細(xì)菌起主導(dǎo)作用，而在降解二氯苯酚時(shí)是植物起主導(dǎo)作用.在本研究中，沉水植物在整個(gè)BPA去除體系中起主要作用.

目前關(guān)于BPA的降解菌有很多報(bào)道，來(lái)源也較廣泛［23］，主要有篩自天然水體如Streptomyces sp.［24］，沉 積 物 如Bordetella sp.strainOS17，Pseudomonas sp.LBC1［25-26］，垃圾滲濾液 如Achromobacter xylosoxidans strain B-16［27］，活性污泥如Citrobacter sp. 57， Serratia marcescens NB1［28-29］等.而本研究中降解效率較高的3種細(xì)菌分別屬于Lysinibacillus sp.，Brevibacterium sp.和 Ochrobactrum sp..目前關(guān)于3個(gè)屬的報(bào)道主要有Lysinibacillus sp.對(duì)農(nóng)藥馬拉硫磷［30］，奧美拉唑［31］，偶氮染料［32］等的降解，Brevibacterium sp.的研究有對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯［33］，二苯并呋喃［34］和除草劑［35］等的降解，Ochrobactrum sp.對(duì)雌二醇［36］，多環(huán)芳烴［37］和對(duì)硝基苯酚［38］的等降解，對(duì)于BPA的降解還未見(jiàn)報(bào)道.

影響細(xì)菌對(duì)BPA的因素很多，包括投菌量、溫度、pH值、BPA初始濃度等［39-40］.本研究中降解菌的效率偏低，也可能與其降解條件有關(guān).不同細(xì)菌對(duì)BPA的最優(yōu)降解條件有很大區(qū)別，如袁理等［41］篩選的BPA降解菌的最佳降解條件為接種量為0.6%，初始pH值為7.0，溫度為30，℃初始濃度為10mg/L時(shí)達(dá)到最大值46.93%，而房芳等［42］報(bào)道的降解菌在接種量為5%，pH=4，BPA濃度為50.18mg/L，8d后降解率可達(dá)到71.79%.蔣俊等［28］與鄧偉光等［29］均從活性污泥中篩選出的BPA降解菌，其BPA最佳降解條件相似（接種量2%～5%， pH7～8，溫度30～32℃，BPA 10mg/L）.

本研究中，附生細(xì)菌添加到無(wú)菌苗降解體系后會(huì)使無(wú)菌苗體系降解效率顯著減少（P＜0.05），但隨著時(shí)間增加與對(duì)照組差距逐漸減?。▓D3a）.原因可能是相對(duì)濃度較大的細(xì)菌進(jìn)入無(wú)菌苗體系后，附著在植物表面，影響了植物對(duì)BPA的去除，而同時(shí)細(xì)菌因環(huán)境的變化進(jìn)入遲緩期，也影響了細(xì)菌的降解能力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境，降解能力顯著增加，縮小了與無(wú)菌苗體系的去除率差異.Saiyood等［43］研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的結(jié)果，部分降解菌添加到無(wú)菌植物根系后會(huì)減少植物對(duì)BPA降解.細(xì)菌與植物之間還存在相互促進(jìn)作用，共同降解污染物，這與細(xì)菌和植物的種類(lèi)有關(guān)［19,23］.不同細(xì)菌組合后BPA的降解效果高于單一細(xì)菌，說(shuō)明細(xì)菌間具有相互促進(jìn)的作用，這與李明堂等［44］的研究結(jié)果一致.不同細(xì)菌組合后形成的菌群對(duì)BPA降解率顯著上升原因可能是混合菌群加速了中間代謝物的轉(zhuǎn)化利用從而提高了污染物的降解速度.而不同細(xì)菌間的進(jìn)化距離也會(huì)影響細(xì)菌間對(duì)污染物降解的協(xié)同作用，親緣性近，進(jìn)化距離小的細(xì)菌間協(xié)同性更強(qiáng)［45］，本研究中B12與B23的進(jìn)化距離較近，而與B14的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，這也可能是造成B12+B23組合后降解效果高于其他3個(gè)組合的原因.而混合組細(xì)菌在72h后數(shù)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是因?yàn)轶w系中95%以上的BPA都被去除，沒(méi)有足夠BPA的誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)減緩，數(shù)量下降.

物理去除部分附生細(xì)菌后，植物去除BPA的效率升高，說(shuō)明附生細(xì)菌在沉水植物體系中可能起到隔離作用，減少植物與BPA的直接接觸，這可能是保護(hù)植物的一種方式.有研究表明［46-48］附生細(xì)菌能夠在植物根系形成細(xì)菌膜幫助植物抵抗不良環(huán)境并促進(jìn)植物的生長(zhǎng).鄧歡歡等［21］在研究黃麻對(duì)蒽的降解時(shí)發(fā)現(xiàn)在蒽濃度為300mg/kg條件下，加菌組植物在42d后生物量是不加菌組的11倍.水中的細(xì)菌還能夠平衡水體中的過(guò)高的氮磷及其他污染物，減少其對(duì)沉水植物的毒害［49］.但因?yàn)楦缴?xì)菌對(duì)水體中BPA降解能力有限，并不能補(bǔ)償因隔離植物作用減少的BPA去除，最終減少了沉水植物及其附生生物體系對(duì)BPA的去除.

4 結(jié)論

4.1 輪葉黑藻附生細(xì)菌中共篩出22株能夠利用BPA的細(xì)菌，其中降解效率在10%以上的12株，降解率在（11.46±2.38）%～（25.06±1.63）%之間.

4.2 通過(guò)對(duì)降解率最高的3株細(xì)菌B12，B14和B23進(jìn)行形態(tài)觀察，生理生化鑒定和16r DNA比對(duì)，認(rèn)為它們分別屬于Lysinibacillus sp.（桿菌屬），Brevibacterium sp.（短桿菌屬）和 Ochrobactrum sp.（蒼白桿菌屬）.

4.3 輪葉黑藻附生細(xì)菌具有降解水體中BPA的能力，2d的降解率為8.5%±2.11%，約占整個(gè)沉水植物-附生生物體系總?cè)コ实?3%.

［1］ Michalowicz J. Bisphenol A - Sources， toxicity and biotransformation ［J］. Environmental Toxicology and Pharmacology， 2014，37（2）:738-758.

［2］ Chen J F， Xiao Y Y， Gai Z X， et al. Reproductive toxicity of low level bisphenol A exposures in a two-generation zebrafish assay: Evidence of male-specific effects ［J］. Aquatic Toxicology（Amsterdam， Netherlands）， 2015，169:204—214.

［3］ Alexander H C， Dill D C， Smith L W， et al. Bisphenol A: acute aquatic toxicity ［J］. Environmental Toxicology and Chemistry，1988，7:19-26.

［4］ Zhang B， Wu Z， Cheng S， et al. Primary study on photodegradation of bisphenol A by Elodea nuttallii ［J］. Wuhan University Journal of Natural Sciences， 2007，12:1181-1124.

［5］ 嚴(yán)貴芬.幾種水生植物對(duì)水環(huán)境濃度BPA去除效果的研究 ［D］.華中師范大學(xué)， 2011.

［6］ 邢維芹，駱永明，李立平，等.持久性有機(jī)污染物的根際修復(fù)及其研究方法 ［J］. 土壤， 2004，36（3）:258-263.

［7］ Chi J， Gao J. Effects of Potamogeton crispus L.—bacteria interactions on the removal of phthalate acid esters from surface water ［J］. Chemosphere， 2015，119:59-64.

［8］ Mcguinness M， Dowling D. Plant-Associated Bacterial Degradation of Toxic Organic Compounds in Soil ［J］.Ⅰnternational Journal of Environmental Research & Public Health，2009，6（8）:2226-2247.

［9］ Weyens N， Lelie D V D， Taghavi S， et al. Phytoremediation: plant—endophyte partnerships take the challenge ［J］. Current Opinion in Biotechnology， 2009，20（2）:248-254.

［10］ 蔣金輝，周長(zhǎng)芳，安樹(shù)青，等.工具種輪葉黑藻的組織培養(yǎng)與快速繁殖 ［J］. 湖泊科學(xué)， 2008，20（2）:200-215.

［11］ Zhang B G， Bai Z H， Hoefel D， et al. Assessing the impact of the biological control agent Bacillus thuringiensis on the indigenous microbial community within the pepper plant phyllosphere ［J］. FEMS Microbiology Letters， 2008，284（1）:102-108.

［12］ Sakai K， Yamanaka H， Moriyoshi K， et al. Biodegradation of bisphenol A and related compounds by Sphingomonas sp. strain BP-7isolated from seawater ［J］. Bioscience Biotechnology & Biochemistry， 2007，71（1）:51-7.

［13］ Toyama T， Kainuma Y， Kikuchi S， et al. Biodegradation of bisphenol A and 4-alkylphenols by Novosphingobium sp. strain TYA-1and its potential for treatment of polluted water ［J］. Water Science & Technology A Journal of the Ⅰnternational Association on Water Pollution Research， 2012，66（10）:2202-8.

［14］ 劉 智，洪 青，張曉舟，等.甲基對(duì)硫磷降解菌DLL—E4降解對(duì)-硝基苯酚特性 ［J］. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2003，23（4）:435-439.

［15］ Kang J H， Kondo F. Bisphenol A degradation in seawater is different from that in river water ［J］. Chemosphere， 2005，60（9）: 1288-1292.

［16］ Kuiper Ⅰ， Lagendijk E L， Bloemberg G V， et al. Rhizoremediation: a beneficial plant-microbe interaction ［J］. Molecular Plant-Microbe Ⅰnteractions， 2004，17（17）:6-15.

［17］ 孫瑞珠，馬玉龍，張 娟，等.泰樂(lè)菌素降解菌的篩選及其降解動(dòng)力學(xué)研究 ［J］. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)， 2013，33（4）:722-727.

［18］ 鄭師章，樂(lè)毅全，吳 輝，等.鳳眼蓮及其根際微生物共同代謝和協(xié)同降酚機(jī)理的研究 ［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 1994，5（4）:403-408.

［19］ Scheublin T R， Leveau J H J. Ⅰsolation of Arthrobacter species from the phyllosphere and demonstration of their epiphytic fitness［J］. Microbiologyopen， 2013，2（1）:205-213.

［20］ Toyama T， Murashita M， Kobayashi K， et al. Acceleration of nonylphenol and 4-tert-octylphenol degradation in sediment by Phragmites australis and associated rhizosphere bacteria ［J］. Environmental Science & Technology， 2011，45（15）:6524-6530.

［21］ 鄧歡歡，張甲耀，趙 磊，等.外源降解菌對(duì)黃麻根區(qū)凈化能力的生物強(qiáng)化作用 ［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2005，11（4）:426-430.

［22］ 胡立芳，沈東升，賀永華.接種Penicillium sp.和根際分泌物對(duì)土壤甲磺隆的協(xié)同降解研究 ［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2007，28（1）:199-203.

［23］ Zhang W W， Yin K， Chen L X. Bacteria-mediated bisphenol A degradation ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2013，97（13）:5681-5689.

［24］ Kang J H， Ri N， Kondo F. Streptomyces， sp. strain isolated from river water has high bisphenol A degradability ［J］. Letters in Applied Microbiology， 2004，39（39）:178-180.

［25］ Matsumura Y， Hosokawa C， Sasakimori M， et al. Ⅰsolation and characterization of novel bisphenol-A--degrading bacteria from soils ［J］. Biocontrol Science， 2009，14（4）:161-169.

［26］ Telke A A， Kalyani D C， Jadhav U U， et al. Purification and characterization of an extracellular laccase from a Pseudomonas sp. LBC1and its application for the removal of bisphenol A ［J］. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic， 2009，61（3）:252-260.

［27］ Zhang C， Zeng G M， Yuan L， et al. Aerobic degradation of bisphenol A by Achromobacter xylosoxidans strain B-16isolated from compost leachate of municipal solid waste ［J］. Chemosphere，2007，68（1）:181-190.

［28］ 蔣 俊，李秀艷，趙雅萍.2株分別降解壬基酚和雙酚A細(xì)菌的分離，鑒定和降解特性 ［J］. 環(huán)境科學(xué)研究， 2010，23（9）:1196-1123.

［29］ 鄧偉光，諶建宇，李小明，等.壬基酚和雙酚A降解菌株的分離，鑒定和特性研究 ［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2013，33（3）:700-707.

［30］ Singh B， Kaur J， Singh K. Transformation of malathion by Lysinibacillus sp. isolated from soil ［J］. Biotechnology Letters，2012，34（5）:863-7.

［31］ Babiak P， Kyslíková E， ?těpánek V， et al. Whole-cell oxidation of omeprazole sulfide to enantiopure esomeprazole with Lysinibacillus sp. B71 ［J］. Bioresource Technology， 2011，102（17）: 7621-6.

［32］ 蘇 萌，陶 然，楊 揚(yáng)，等.偶氮染料脫色菌Lysinibacillus sp.FS1的脫色性能 ［J］. 環(huán)境工程學(xué)報(bào)， 2015，9（10）:4664-4672.

［33］ 曾 鋒，傅家謨，盛國(guó)英，等.不同菌源的微生物對(duì)鄰苯二甲酸二異丁酯（DⅠBP）生物降解性的比較 ［J］. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1999，19（4）:322-324.

［34］ Strubel V， Engesser K H， Fischer P， et al. 3-（2-hydroxyphenyl）catechol as substrate for proximal meta ring cleavage in dibenzofuran degradation by Brevibacterium sp. strain DPO 1361［J］. Journal of Bacteriology， 1991，173（6）:1932-1937.

［35］ 周建嬌，鄒 芳，楊 漢，等.乙草胺降解菌篩選及其初步鑒定［J］. 中國(guó)土壤與肥料， 2013，（6）:93-96.

［36］ Ⅰsabelle M， Villemur R， Juteau P， et al. Ⅰsolation of estrogen-degrading bacteria from an activated sludge bioreactor treating swine waste， including a strain that converts estrone to β-estradiol. ［J］. Canadian Journal of Microbiology， 2011，57（7）: 559-568.

［37］ Arulazhagan P， Vasudevan N. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a halotolerant bacterial strain Ochrobactrum sp. VA1 ［J］. Marine Pollution Bulletin， 2011，62（2）:388-94.

［38］ Qiu X H， Zhong Q Z， Li M， et al. Biodegradation of pnitrophenol by methyl parathion-degrading Ochrobactrum sp. B2［J］. Ⅰnternational Biodeterioration & Biodegradation， 2007，59（4）: 297—301.

［39］ Kang J H， Kondo f. Effects of bacterial counts and temperature on the biodegradation of bisphenol A in river water ［J］. Chemosphere，2002，49（5）: 493-498.

［40］ 王樂(lè)樂(lè)，張國(guó)森，耿 超，等.狐尾藻降解雙酚A內(nèi)生菌的分離鑒定及降解特性 ［J］. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)， 2015，38（12）:16-21.

［41］ 袁 理，曾光明，張 長(zhǎng)，等.雙酚A降解菌的分離鑒定及其降解特性 ［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2006，27（10）:2095-2099.

［42］ 房 芳，張?zhí)m英，楊雪梅，等.雙酚A高效降解菌的篩選與降解特性 ［J］. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版）， 2005，（6）:873-876.

［43］ Saiyood S， Vangnai A S， Thiravetyan P. Bisphenol A removal by the Dracaena plant and the role of plant-associating bacteria ［J］. Journal of Hazardous Materials， 2010，178（1-3）:777-785.

［44］ 李明堂，徐鏡波，盧振蘭，等.兩株細(xì)菌對(duì)鄰氯硝基苯的協(xié)同降解［J］. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2010，30（6）:1138-1143.

［45］ 王佳楠，石妍云，鄭力燕，等.石油降解菌的分離鑒定及4株芽胞桿菌種間效應(yīng) ［J］. 環(huán)境科學(xué)， 2015，（6）:2245-2251.

［46］ 劉 娟，凌婉婷，盛月慧，等.根表功能細(xì)菌生物膜及其在土壤有機(jī)污染控制與修復(fù)中的潛在應(yīng)用價(jià)值 ［J］. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，32（11）:2112-2117.

［47］ Yamaga F， Washio K， Morikawa M. Sustainable biodegradation of phenol by Acinetobacter calcoaceticus P23 isolated from the rhizosphere of duckweed Lemna aoukikusa ［J］. Environmental Science and Technology， 2010，44（16）:6470-6474.

［48］ Molina M A， Ramos J L， Espinosa U M. Plant-associated biofilms ［J］. Reviews in Environmental Science and Bio/ Technology， 2003，（2）:99-108.

［49］ Baines S B， Pace M L. The production of dissolved organic matter by phytoplankton and its importance to bacteria: Patterns across marine and freshwater systems ［J］. Limnology & Oceanography， 1991，36（6）:1078-1090.

Degradation of bisphenol A by the epiphytic bacteria of submerged macrophytes Hydrilla verticillata （L. f.） Royle.

ZHANG Guo-sen， WANG Yu， ZHUANG Xiao-jin， YANG Shao， JIANG Jin-hui*（School of Life Sciences， Central China Normal University， Wuhan 430079， China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：3081～3088

Epiphytic bacteria of submerged macrophytes may have the capability in biodegradation and/or biotransformation of bisphenol A （BPA） in water column， therefore affect the fate of such environmental pollutant. In this research， Hydrilla verticillata （L. f.） Royle was selected and their attached BPA degrading epiphytic bacteria attached were isolated. Among the 22bacteria strains， the BPA removal rates were from 11.46% to 25.06% with the inoculum density at 1×10-8cell/mL and culture at 37℃ for 72h. The most effective bacteria strains， B12， B14and B23 were identified as Lysinibacillus sp.， Brevibacterium sp. and Ochrobactrum sp.， respectively， according to the results of 16S rDNA sequencing and morphological， physiological and biochemical tests. But aseptic seedlings of H. verticillata significantly decreased their BPA removal rates after the addition with B12， B14and B23 （P＜0.05）. Natural seedlings of such species surprisingly increased about 5% in BPA removal after partially removing their epiphyte with physical methods. All the results indicated that epiphytic bacteria of submerged plant can remove BPA， although their contributions（about 23%） are less than the host plants in the submerged macrophytes-epiphyte associations.

epiphytic bacteria；BPA removal；submerged macrophytes

X171.5，X172

A

1000-6923（2016）10-3081-08

張國(guó)森（1989-），男，河南平頂山人，博士研究生，主要從事污染生態(tài)學(xué)研究.

2016-01-30

國(guó)家水體污染控制與治理科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX07104-004-03）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31200399）

* 責(zé)任作者， 講師， jiang_jhcn@126.com