韓克實(shí) ,楊 旭,黃瑞哲△

1.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科(西安710077)，2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院(西安710003)

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△通訊作者

成釉細(xì)胞株ALC體外培養(yǎng)觀察

韓克實(shí)1,楊 旭2,黃瑞哲2△

1.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科(西安710077)，2.西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院(西安710003)

目的：探索成釉細(xì)胞株ALC的體外培養(yǎng)方法，了解ALC細(xì)胞的形態(tài)特征和生長特點(diǎn)。方法：對成釉細(xì)胞株ALC進(jìn)行復(fù)蘇、培養(yǎng)，運(yùn)用免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測角蛋白14和釉原蛋白的表達(dá)。結(jié)果：ALC細(xì)胞呈現(xiàn)特征性的“鋪路石”樣生長，多邊形，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核明顯，有短的細(xì)胞突起，符合上皮樣細(xì)胞生長特點(diǎn)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示角蛋白14和釉原蛋白染色陽性。結(jié)論：ALC細(xì)胞生長良好，并具有成釉細(xì)胞特點(diǎn)，是一種適合作為實(shí)驗(yàn)研究對象的成釉細(xì)胞株。

釉質(zhì)的發(fā)育主要經(jīng)歷兩個階段，即成釉細(xì)胞合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)以及釉基質(zhì)的生物礦化。釉質(zhì)的形成由成釉細(xì)胞調(diào)控，成釉細(xì)胞合成釉質(zhì)基質(zhì)之后，胞外基質(zhì)在成釉細(xì)胞的調(diào)控下開始生物礦化。成釉細(xì)胞釉質(zhì)發(fā)育分泌階段表達(dá)的主要的釉基質(zhì)蛋白是釉原蛋白，大約占有機(jī)基質(zhì)的90%。牙齒發(fā)育完成需經(jīng)20多種細(xì)胞的分化，要將成釉細(xì)胞經(jīng)過分離、純化后，再構(gòu)建組織工程，難度較大。因此，特征性單一細(xì)胞的體外培養(yǎng)對牙齒發(fā)育的研究具有非常重要的意義。Nakata等取新生C57BL/6J小鼠的下頜磨牙牙胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，利用差別消化法分離成釉細(xì)胞后，獲得了自發(fā)性永生化的成釉細(xì)胞株，命名為ALC(Ameloblast-lineage cell)[1]。

材料與方法

1 材 料 DMEM培養(yǎng)液(美國Hyclone)；胎牛血清(美國GIBCO)；DMSO(美國Sigma)；Amelogenin單克隆抗體(美國Santa公司)；SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德)；DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；生物素化兔抗山羊IgG(武漢博士德)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

2.1 ALC細(xì)胞的復(fù)蘇：迅速從液氮罐中取出細(xì)胞凍存管，立即放入37℃水浴箱中融解，不超過1 min；吸出已融解的細(xì)胞懸浮液，立即加入含有培養(yǎng)液的離心管內(nèi)，輕輕吹打混勻后蓋緊瓶蓋，800r/min離心5 min；棄上清，加入6ml配好的DMEM高糖培養(yǎng)液，細(xì)胞吹打均勻后，移入培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

2.2 ALC細(xì)胞的傳代：待ALC細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底壁80%～90%后，去除原培養(yǎng)液，4ml PBS液清洗培養(yǎng)皿底壁2次，并棄去PBS；培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶消化液3 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中消化4 min后倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓變亮?xí)r，加入3 ml DMEM高糖培養(yǎng)液終止消化；用移液管輕輕吹打培養(yǎng)皿的底壁，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿底壁完全脫落并成單個分布，收集細(xì)胞懸液于離心管中，蓋緊瓶蓋，封口膜封口，800r/min離心5 min，棄上清；加適量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸細(xì)胞、混合均勻，按1∶3比例進(jìn)行傳代，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 細(xì)胞計數(shù)：取生長狀態(tài)良好的ALC細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化液3ml，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，消化4min后倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓變亮?xí)r，加入3ml培養(yǎng)液以終止消化；用細(xì)胞計數(shù)器，記錄細(xì)胞數(shù)量后平均接種到24個培養(yǎng)皿中，按每個培養(yǎng)皿105個細(xì)胞接種； 24h后觀察細(xì)胞貼壁情況，之后每隔6 h計數(shù)一次，每次取3個培養(yǎng)皿，分別計數(shù)后，求平均值。

2.4 SABC法觀察角蛋白14和釉原蛋白的表達(dá)：取生長狀態(tài)良好的ALC細(xì)胞制成細(xì)胞爬片，滴加適當(dāng)稀釋的角蛋白14抗體，4℃過夜，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔，37℃孵育 20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，2 min×3次；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min，PBS(pH7.2～7.6)清洗，5 min×4次；DAB顯色，顯微鏡下觀察，蒸餾水清洗，5 min×4次；蘇木素染液復(fù)染60秒；加入梯度酒精中脫水，70%(1次，1 min)-80%(1次，1 min)-90%(1次，1 min)-無水乙醇(2次×3 min)；加入二甲苯透明，2次×1min；中性樹膠封片；顯微鏡下觀察細(xì)胞胞漿的顏色。陰性對照用PBS代替一抗進(jìn)行染色，其余步驟不變。釉原蛋白免疫組化步驟同角蛋白14。

結(jié) 果

1 ALC細(xì)胞的培養(yǎng)狀況 倒置顯微鏡下觀察， ALC細(xì)胞呈特征性的“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)，卵圓形或多邊形，成簇排列，細(xì)胞間連接緊密，符合上皮樣細(xì)胞生長形態(tài)(見圖1)。

圖1 倒置顯微鏡下ALC細(xì)胞的形態(tài)

2 ALC細(xì)胞的生長特點(diǎn) ALC細(xì)胞生長較快，貼壁后很快進(jìn)入對數(shù)生長期，約24 h后進(jìn)入生長穩(wěn)定期，細(xì)胞數(shù)量變化不大。生長狀態(tài)良好的ALC細(xì)胞在貼壁生長48h后，細(xì)胞密度可達(dá)到90%。

3 角蛋白14和釉原蛋白免疫組化染色結(jié)果 ALC細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，胞體豐滿，細(xì)胞漿豐富，胞核圓形居中，角蛋白14和釉原蛋白陽性染色細(xì)胞胞漿中可見棕黃色染色(見圖2A，圖3A)，陰性對照細(xì)胞胞漿中無棕黃色染色(見圖2B，圖3B)，說明ALC細(xì)胞表達(dá)角蛋白14和釉原蛋白。

A為陽性，B為陰性

A為陽性，B為陰性

討 論

最初研究牙源性上皮的結(jié)構(gòu)和功能，是通過體外培養(yǎng)牙胚的方法來獲得的，后又將其從牙胚中分離出來單獨(dú)研究[2]。但這些方法獲得的細(xì)胞培養(yǎng)時間短，也難以單因素分析牙源性上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。于是，有學(xué)者開始進(jìn)行成釉細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)研究[3]。

Chen等人分離小鼠第一磨牙的成釉器上皮細(xì)胞，采用組織消化法，培養(yǎng)出原代的上皮樣細(xì)胞，將含SV40大T抗原的質(zhì)粒導(dǎo)入上皮樣細(xì)胞中，從而獲得的永生化細(xì)胞株命名為LS8，具有成釉細(xì)胞特性，如表達(dá)角蛋白和釉原蛋白等，屬于分泌期成釉細(xì)胞。DenBesten等人分離幼豬未萌磨牙的成釉器上皮細(xì)胞，通過磷酸鈣沉淀法將含多瘤病毒大T-抗原編碼基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述細(xì)胞中，所建立的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞系命名為PABSo-E，此細(xì)胞系保留成釉細(xì)胞的某些特性，如表達(dá)釉原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶20、釉基質(zhì)絲氨酸蛋白酶1等。Kawano等人建立了口腔上皮細(xì)胞系HAT-7，免疫組織化學(xué)表明，HAT-7表達(dá)釉原蛋白，成釉蛋白，堿性磷酸酶(ALP)，具有成釉細(xì)胞特性[4]。Nakata等人取新生C57BL/6J小鼠的下頜磨牙牙胚進(jìn)行組織培養(yǎng)，利用差別消化法分離成釉細(xì)胞后，獲得了自發(fā)性永生化的成釉細(xì)胞株，命名為ALC(Ameloblast-lineage cell)。ALC細(xì)胞具備成釉細(xì)胞的特性，包括體外培養(yǎng)時能夠表達(dá)成釉細(xì)胞特異性蛋白(釉原蛋白，釉叢蛋白和成釉蛋白)，以及在體外誘導(dǎo)生物礦化的能力[5]。

本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的ALC細(xì)胞為卵圓形或多邊形，采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞增殖能力較強(qiáng)，生長較快，穩(wěn)定單一，形態(tài)良好。鑒定ALC 細(xì)胞時，選擇了上皮樣細(xì)胞的特異性蛋白-角蛋白14和成釉細(xì)胞的特異性蛋白-釉原蛋白[6-7]，ALC細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中穩(wěn)定地表達(dá)角蛋白14和釉原蛋白，可認(rèn)為ALC細(xì)胞為成釉細(xì)胞。ALC細(xì)胞既突破了原代細(xì)胞培養(yǎng)的限制，又避免了因外源基因的導(dǎo)入而導(dǎo)致成釉細(xì)胞某些重要生物學(xué)特性的改變。它們細(xì)胞均一，生長穩(wěn)定，并擁有成釉細(xì)胞的各種特性，是一種適合作為實(shí)驗(yàn)研究對象的細(xì)胞株。

[1] Nakata A, Kameda T, Nagai H,etal. Establishment and characterization of a spontaneously immortalized mouse ameloblast-lineage cell line[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2003, 308 (4): 834-839.

[2] 王冠宇.成釉細(xì)胞的培養(yǎng)及其在釉質(zhì)形成中的作用[J].醫(yī)學(xué)綜述, 2007, 13 (24): 1952-1954.

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[6] 田 華,呂 平,高 巖，等.鐘狀期成釉細(xì)胞的體外生長研究[J].牙體牙髓牙周病學(xué)雜志, 2009,19(6):309-313.

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(收稿：2016-06-28)

成釉質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞培養(yǎng) 體外發(fā)生 @釉原蛋白

R783.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.004