王 靜 鐘子劭 林益群 鄺宇香

hMSH2和hMSH6蛋白在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

王 靜 鐘子劭 林益群 鄺宇香

目的研究廣東地區(qū)散發(fā)性結(jié)直腸癌患者h(yuǎn)MSH2與hMSH6蛋白表達(dá)情況及其與臨床特征的關(guān)系。方法采用免疫組化法檢測了100例廣東地區(qū)散發(fā)性結(jié)直腸癌患者的癌組織hMSH 2與hMSH 6蛋白表達(dá)情況。結(jié)果hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)缺失率分別為26.0%和11.0%，兩者共同表達(dá)缺失率為9.0%；hMSH2蛋白缺失患者與陽性表達(dá)患者相比，在年齡、腫瘤部位方面存在顯著差異（P＜0.01）；hMSH6蛋白缺失患者與陽性表達(dá)患者在性別、腫瘤部位方面存在顯著差異（P＜0.05）；hMSH2蛋白和hMSH6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.447，P<0.05）。結(jié)論hMSH2與hMSH6蛋白在廣東地區(qū)散發(fā)性大腸癌中有一定比例的缺失，且與腫瘤發(fā)生部位、性別、年齡存在相關(guān)性，錯(cuò)配修復(fù)基因的突變可能參與了腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)階段。

散發(fā)性結(jié)直腸癌；錯(cuò)配修復(fù)；hMSH2；hMSH 6

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在我國惡性腫瘤中均排第5位[1]。結(jié)直腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，其中涉及許多腫瘤相關(guān)因子的參與和調(diào)控。除了與癌基因激活和抑癌基因失活有關(guān)外，與錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)（m ismatch repair，MMR）亦有密切關(guān)系。MMR蛋白在識(shí)別損傷信號(hào)和引起細(xì)胞凋亡的過程中起重要作用，該蛋白缺失會(huì)使原癌基因和抑癌基因突變?cè)隗w內(nèi)累積，最終可引起細(xì)胞增殖、分化的異常，發(fā)生惡性腫瘤[2-3]。近年來的研究顯示，在結(jié)直腸癌組織中有包括hMLH1、hMSH2、hMSH6等多種重要MMR蛋白的缺失[4-6]，但有關(guān)散發(fā)性結(jié)直腸癌（SCC）組織中hMSH2和hMSH6蛋白的表達(dá)研究結(jié)果卻不盡一致。本文通過免疫組化法檢測SCC患者結(jié)直腸組織中hMSH2與hMSH6蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明錯(cuò)配修復(fù)基因在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用提供依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

收集2014年1月至2015年1月在廣東省中醫(yī)院住院診斷為結(jié)直腸癌并行手術(shù)切除，經(jīng)病理確診的散發(fā)型結(jié)直腸癌患者100例，其中男59例（59.0%），女41例（41.0%）；年齡28～89歲，平均年齡63.56歲，中位年齡65歲；高中分化腺癌76例（76.0%），低未分化7例（7.0%），黏液腺癌17例（17.0%）；右半結(jié)腸癌（回盲部癌、升結(jié)腸癌、結(jié)腸肝曲癌及橫結(jié)腸癌）29例（29%），左半結(jié)腸癌（結(jié)腸脾曲癌、降結(jié)腸癌、乙狀結(jié)腸癌）35例（35.0%），直腸癌36例（36.0%）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例（60.0%），無淋巴轉(zhuǎn)移40例（40.0%）；Duke分期A和B期共59例（59.0%），C和D期共41例（41.0%）。所有患者術(shù)前均未行放化療，否認(rèn)腫瘤家族史。30例正常結(jié)直腸組織作為對(duì)照。排除符合AmsterdamⅡ診斷標(biāo)準(zhǔn)的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌。

二、試劑與方法

標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。即用型兔抗人MSH2、兔抗人MLH6抗體購自基因科技有限公司，免疫組化過程在羅氏全自動(dòng)免疫組化儀（Roche Benchmark XT）完成。

三、結(jié)果判定

結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參考許良中等[7]的免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比判定陽性表達(dá)程度。hMSH2和hMSH6陽性表達(dá)均在細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，光鏡下每張切片中選取癌細(xì)胞較多的5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按染色強(qiáng)度分級(jí)：無著色為0分，淡黃色1分，黃色2分，棕黃色3分；按陽性細(xì)胞百分比分級(jí)：無陽性細(xì)胞為0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥2分為陽性表達(dá)，<2分為陰性表達(dá)。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以正常結(jié)直腸黏膜上皮和/或浸潤的淋巴細(xì)胞為陽性對(duì)照，陽性對(duì)照核表達(dá)陽性而腫瘤細(xì)胞核缺乏染色則判為陰性。所有免疫組化染色結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生復(fù)核。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法；相關(guān)性分析采用Spear-man等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 hMSH-2、hMSH-6在癌組織中的表達(dá)（×200）

結(jié) 果

一、hMSH2和hMSH6蛋白表達(dá)情況

結(jié)直腸癌組織與正常結(jié)直腸組織中hMSH2和hMSH6蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核及部分細(xì)胞質(zhì)中，間質(zhì)細(xì)胞偶有表達(dá)，染色深呈棕褐色（圖1）。在100例SCC患者的腸組織中，hMSH2蛋白表達(dá)缺失26例，缺失率26.0%，hMSH6蛋白表達(dá)缺失11例，缺失率11.0%，hMSH2蛋白和hMSH6蛋白共同表達(dá)缺失9例，缺失率9.0%。

二、hMSH2和hMSH6蛋白表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

在100例SCC患者中，hMSH2蛋白缺失患者與陽性表達(dá)患者相比，在年齡、腫瘤部位存在顯著差異（P＜0.01），hMSH2蛋白缺失患者年齡更低，腫瘤發(fā)生于右半結(jié)腸數(shù)量多于左半結(jié)腸和直腸，而在性別、腫瘤最大徑、浸潤深度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、Duke分期方面未發(fā)現(xiàn)顯著差異（P>0.05）。hMSH6蛋白缺失患者與陽性表達(dá)患者在性別、腫瘤部位上存在顯著差異（P＜0.05），hMSH6蛋白缺失患者男性顯著多于女性，腫瘤發(fā)生于右半結(jié)腸數(shù)量多于左半結(jié)腸和直腸，而在年齡、腫瘤最大徑、浸潤深度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、Duke分期方面未見顯著差異（見表1）。

表1 hMSH-2和hMSH-6蛋白在廣東地區(qū)散發(fā)性大腸癌組織中的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

三、hMSH2和hMSH6蛋白在SCC患者腸組織中表達(dá)的相關(guān)性

在本研究100例SCC患者的腸組織中，hMSH2蛋白和hMSH6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性（r= 0.447，P<0.05），見表2。

表2 hMSH2與hMSH6蛋白在散發(fā)性大腸癌組織組織中表達(dá)的相關(guān)性分析

討 論

近年來的研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤，包括結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌等[4-5]的發(fā)生與錯(cuò)配修復(fù)（M issmatch Repair,MMR）基因的表達(dá)缺失有著重要聯(lián)系。MMR是DNA自我修復(fù)系統(tǒng)中的一種方式，主要用于修復(fù)堿基的插入、配對(duì)及缺失錯(cuò)誤，是維持DNA正確復(fù)制、遺傳的重要機(jī)制。MMR基因在原核生物到人類的各種生物中均高度保守，MMR基因通過編碼出MMR酶（MMR enzymes,MMREs），結(jié)合至錯(cuò)誤編碼的DNA鏈上發(fā)揮修復(fù)錯(cuò)誤的作用。目前發(fā)現(xiàn)的人類MMR基因主要有與Mut S、Mut L同源的hMLH1、hMSH2、hMSH3、hMSH6等，其中MSH6能與MSH2形成二聚體MutSα，共同起到錯(cuò)配結(jié)合的作用。MMR基因缺失多同時(shí)伴有微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI），其產(chǎn)生原因是由于錯(cuò)配修復(fù)錯(cuò)誤導(dǎo)致。若MMR基因表達(dá)缺失，不能正確發(fā)揮修復(fù)錯(cuò)誤堿基的作用，會(huì)使原癌基因和抑癌基因突變?cè)隗w內(nèi)累積，最終可引起細(xì)胞增殖、分化的異常，發(fā)生惡性腫瘤[2-3]。

在既往MMR與結(jié)直腸癌相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)，與結(jié)直腸癌密切相關(guān)的MMR基因主要有hMLH1、hMSH2、hMSH3、hMSH6等[4-5]。大多數(shù)MMR缺失的結(jié)直腸癌患者屬于遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC），大約占76%，而僅有約8.8%～20.4%與散發(fā)性結(jié)直腸癌（SCC）有關(guān)，且均存在高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（High MSI,MSI-H），并與MHL-1啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)[4,8-10]。

本研究對(duì)廣東地區(qū)散發(fā)性結(jié)直腸癌患者病理組織hMSH2、hMSH6表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明hMSH2缺失率為26.0%，hMSH6缺失率為11.0%，略高于其他地區(qū)的研究結(jié)果。在與臨床特征的關(guān)系方面，hMSH2與hMSH6蛋白表達(dá)缺失率在右半結(jié)腸顯著高于左半結(jié)腸和直腸，這與國內(nèi)外的研究基本相符合[11-13]，提示MMR蛋白缺失更容易導(dǎo)致右半結(jié)腸癌的發(fā)生，其原因與右半結(jié)腸癌發(fā)生階段可能存在更高比例的基因啟動(dòng)子甲基化、病理組織學(xué)特征傾向于MSI-H表達(dá)及右半結(jié)腸與左半結(jié)腸、直腸生物學(xué)和分子學(xué)特征不同有關(guān)[11]，MMR蛋白表達(dá)可能更多地參與腫瘤發(fā)生的早期階段。

此外，Kmschewski等[14]在研究SCC時(shí)發(fā)現(xiàn)MSH2蛋白表達(dá)缺失與腫瘤的分化程度、Duke分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。但也有研究顯示異常的MMR蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別或種族群體之間沒有任何的關(guān)聯(lián)，而與腫瘤部位、腫瘤類型及腫瘤分化程度相關(guān)[15]。本研究中hMSH2蛋白表達(dá)在年齡分布上存在顯著差異，年齡＜60歲組的hMSH2蛋白缺失率高于≥60歲組，提示hMSH2蛋白缺失者結(jié)腸癌的發(fā)病年齡更早。而hMSH6蛋白表達(dá)缺失者中，男性比女性更多。在本研究中，hMSH6和hMSH2在腫瘤最大徑、浸潤深度、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移、Duke分期間未見顯著差異，與一些國外文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]，這提示錯(cuò)配修復(fù)基因的突變可能只作用于腫瘤的啟動(dòng)發(fā)生階段，與其浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系不大。本研究結(jié)果可能與標(biāo)本的數(shù)量、標(biāo)記方法及結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)選擇不同等因素有關(guān)，還需擴(kuò)大樣本量深入研究來證實(shí)dMM R檢測的應(yīng)用意義，為大腸癌的診治提供依據(jù)。

[1]ChenW,Zheng R,Baade PD,etal.Cancerstatisticsin China,2015 [J].CA Cancer JClin,2016,66(2)∶115-132.

[2]Youn CK,Cho HJ,Kim SH,etal.Bcl-2 expression suppressesm ismatch repair activity through inhibition of E2F transcriptional activity[J].NatCellBiol,2005,7(2)∶137-147.

[3]Park IJ,Kim HC,Kim JS,etal.Correlation between hMLH1/ hMSH2 and p53 protein expression in sporadic colorectal cancer[J]. Hepatogastroenterology,2005,52(62)∶450-454.

[4]于鵬飛,顧國利,魏學(xué)明,等.hMLH1、hMSH2、hMSH6在散發(fā)性結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀態(tài)與其臨床病理特征的關(guān)系[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志,2015,22(5)∶581-585.

[5]Niessen RC,BerendsMJ,Wu Y,etal.Identification ofmismatch repair genemutations in young patients w ith colorectal cancer and in patients w ith multiple tumours associated w ith hereditary nonpolyposiscolorectalcancer[J].Gut,2006,55(12)∶1781-1788.

[6]Markowitz SD,Bertagnolli MM.Molecular origins of cancer∶Molecular basis of colorectal cancer[J].N Engl JMed,2009,361 (25)∶2449-2460.

[7]許良中,楊文濤.免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中國癌癥雜志,1996(04)∶229～231.

[8]Gu GL,Zhu XQ,WeiXM,etal.Epithelial-mesenchymal transition in colorectal cancer tissue of patients w ith Lynch syndrome[J]. World JGastroenterol,2014,20(1)∶250-257.

[9]Lindor NM,Burgart LJ,Leontovich O,et al.Immunohistochemistry versusm icrosatellite instability testing in phenotyping colorectal tumors[J].JClin Oncol,2002,20(4)∶1043-1048.

[10]Ohrling K,EdlerD,Hallstrom M,etal.M ismatch repair protein expression is an independent prognostic factor in sporadic colorectal cancer[J].ActaOncol,2010,49(6)∶797-804.

[11]Iacopetta B.A re there two sides to colorectal cancer?[J].Int JCancer,2002,101(5)∶403-408.

[12]MolaeiM,Mansoori BK,GhiasiS,etal.Colorectal cancer in Iran∶immunohistochemicalprofilesof fourmismatch repairproteins[J]. Int JColorectalDis,2010,25(1)∶63～69.

[13]于靜,趙峰,梁麗萍,等.hMLH-1和hMSH-2蛋白在新疆漢族散發(fā)性大腸癌中的表達(dá)及意義[J].世界華人消化雜志,2012,20 (33)∶3218-3224.

[14]KruschewskiM,Noske A,Haier J,etal.Is reduced expression of mismatch repair genes MLH1 and MSH2 in patientsw ith sporadic colorectal cancer related to their prognosis?[J].Clin Exp Metastasis, 2002,19(1)∶71-77.

[15]Kaur G,M asoud A,Raihan N,etal.M ismatch repairgenesexpression defects&association w ith clinicopathological characteristics in colorectal carcinoma[J].Indian JMed Res,2011,134∶186～192.

The expression and significance of protein hMSH2 and hMSH6 in sporadic colorectal carcinoma

WANG Jing，ZHONG Zi-shao,LIN Yi-qun,KUANG Yu-xiang.The 2ndAffiliated Hospital,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhuo 510504

ObjectiveTo investigate the relationship between clinical characteristics and hMSH2, hMSH6 protein expression of patients w ith sporadic colorectal carcinoma(SCC)in Guangdong province.MethodshMSH2 and hMSH6 expressionwere detected by immunohistochemistry in 100 casesof SCC specimenscollected from Guangdong province.ResultsTheexpression loss rateof hMSH2 and hMSH6was26.0% and 11.0%respectively,and common loss ratewas9.0%.Compared w ith hMSH2 positive patients,the age and tumor location of hMSH2 negative patientswere significantly different(P＜0.01).Compared with hMSH6 positive patients,the gender and tumor location of hMSH6 negative patientsw ere significantly different(P＜0.05).Therewasa positive correlation between the expression of hMSH2 and hMSH6 proteins in SCC(r= 0.447,P<0.05).ConclusionsLossexpression of hMSH2 and hMSH6 proteinswasproportionally observed in patientsw ith SCC in Guangdong province,w hich could correlatew ith age,gender,and tumor location.Mutation ofm ismatch repairgenemightoccur in initiating stageof SCC.

Sporadic colorectal carcinoma;Mismatch repair;hMSH2;hMSH6

2016-07-14）

（本文編輯：白楊）

10.3969/j.issn.1672-2159.2016.05.003

510504廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

王靜，Email：drwangjingxj@163.com

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800202）