梅志忠 林 菡 黃曉蕓 付文金 方浩威 黃益洪 余映麗 陳建軍 王明霞 官少兵

廣東東莞市厚街醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 東莞 523945

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散發(fā)性低鉀性周期性麻痹KCNJ18 KCNJ12基因分析

梅志忠 林 菡 黃曉蕓 付文金 方浩威 黃益洪 余映麗 陳建軍 王明霞 官少兵

廣東東莞市厚街醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 東莞 523945

目的 通過對散發(fā)性低鉀性周期性麻痹KCNJ12、KCNJ18基因測序分析，探討基因突變的相關(guān)性。方法 取我院住院的52例散發(fā)性低鉀性周期性麻痹患者和10例健康對照者血樣，應(yīng)用PCR和測序技術(shù)，進(jìn)行KCNJ12、KCNJ18基因編碼區(qū)PCR、測序比對。結(jié)果 通過對52例患者和10例健康對照者KCNJ12、KCNJ18基因擴(kuò)增測序比對，均未發(fā)現(xiàn)明顯異常。結(jié)論 未發(fā)現(xiàn)散發(fā)性低鉀性周期性麻痹患者KCNJ12、KCNJ18基因編碼區(qū)序列存在突變。

散發(fā)性低鉀性周期性麻痹；KCNJ18；KCNJ12；基因；突變

低鉀性周期性麻痹是一組原發(fā)性伴有低鉀血癥的突發(fā)性肌肉遲緩性癱瘓肌病。常因劇烈運(yùn)動(dòng)后大汗、飽餐、寒冷刺激及應(yīng)用胰島素、糖皮質(zhì)激素后誘發(fā)。HypoKPP可分為家族性和非家族性。家族性低鉀性周期性麻痹(FPP)是一常染色體顯性遺傳性疾病，是由于編碼骨骼肌特異性電壓門性Na+通道Nav1.4(SCN4A)或Ca2+通道Cav1.1(CACNA1S)蛋白基因突變所致[1-3]。約60%的家族性低鉀性周期性麻痹是由CACNA1S突變所致，被稱為hypoPP-1型，約20%的患者是由SCN4A基因突變導(dǎo)致的，被稱為hypoPP-2型，大約3.5%的患者是由KCNJ18基因突變導(dǎo)致。

非家族性低鉀性周期性麻痹(SPP)包括甲亢性和散發(fā)性低鉀性周期性麻痹[4]。甲亢性低鉀性周期性麻痹(HPP)以甲亢患者繼發(fā)低鉀性周期性麻痹為特點(diǎn)，其臨床表現(xiàn)與家族性周期性麻痹相類似。亞洲人種男性和拉丁美洲男性人的非家族性低鉀性周期性麻痹發(fā)病率明顯高于高加索人種[5]。在亞洲人種和拉丁美洲人種的甲亢男性患者中，其發(fā)生低鉀性周期性麻痹的發(fā)病率高達(dá)10%，而高加索人種的發(fā)病率還不到0.1%[6]。

目前，散發(fā)性低鉀性周期性麻痹(SPP)的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。散發(fā)性低鉀性周期性麻痹其臨床表現(xiàn)與家族性低鉀性周期性麻痹類似，但不具有家族性。一般認(rèn)為與家族性低鉀性周期性麻痹具有相似的發(fā)病機(jī)制，可能是由于離子通道病變所引起，值得深思的是只有極少數(shù)散發(fā)性周期性麻痹患者檢測到SCN4A和CACNA1S基因突變[7]。

KCNJ18基因編碼內(nèi)向整流性鉀離子通道蛋白，有研究認(rèn)為可能與甲亢性低鉀性周期性麻痹和散發(fā)性低鉀性周期性麻痹有關(guān)，但也只有極少數(shù)散發(fā)性周期性麻痹患者可以檢測到KCNJ18基因突變[8]。KCNJ12是KCNJ18的同源基因，同樣編碼鉀離子通道蛋白，其DNA及RNA序列與KCNJ18高度相似。雖有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究KCNJ12基因與低鉀性周期性麻痹的關(guān)系，但還沒有人類低鉀性周期性麻痹的基因研究報(bào)道。鑒于KCNJ18和KCNJ12的序列和功能高度同源性，有必要同時(shí)研究兩者對周期性麻痹的影響，明確KCNJ12的突變是否影響周期性麻痹。

本研究就住院的散發(fā)性低鉀性周期性麻痹中國患者進(jìn)行了KCNJ18、KCNJ12基因進(jìn)行測序比對分析。

1 對象與方法

1．1 研究對象 52例均為我院2014—2015年收治的散發(fā)性低鉀性周期性麻痹患者，10健康對照者均告知知情同意書并簽字。均符合散發(fā)性低鉀性周期性麻痹的診斷標(biāo)準(zhǔn)：表現(xiàn)為發(fā)作性低鉀性遲緩性癱瘓，血鉀低于2.5 mmol/L，無家族史；排除胃腸道鉀丟失、TTKG>3、甲亢及藥物性低鉀等?；颊呔鶠槟行?，平均年齡(28±5)歲；10例健康對照組平均年齡(29±4)歲，均為男性，與患者組相比年齡無顯著性差異。

1．2 方法

1．2．1 DNA 的提?。翰杉總€(gè)研究對象外周血3 mL，按照1：3加入9 mL RNALock血液RNA穩(wěn)定劑(廠家：TIANGEN，貨號(hào)：DP440-01)，顛倒混勻，從中吸取1 mL混合液，采用血液基因組DNA提取試劑盒(廠家：TIANGEN，貨號(hào)：DP348)提取基因組DNA。剩余混合液保存于-20℃，用于后續(xù)RNA提取。

1．2．2 序列比對及引物設(shè)計(jì)：利用NCBI數(shù)據(jù)庫在線BLAST工具(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對人類KCNJ18和KCNJ12基因組序列差異。根據(jù)序列比對結(jié)果，Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用于研究對象擴(kuò)增KCNJ12和KCNJ18的基因組序列。

1．2．3 PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25 μL，含DNA 50 ng，引物0.12 μLmol /L，dNTPs 200 μLmol/ L，TaqDNA 聚合酶1 U(日本，TaKaRa 公司)。PCR 反應(yīng)條件：在Cetus2400 熱循環(huán)儀(美國，PE 公司)，預(yù)變性94 ℃ 5 min；變性94 ℃ 40 s，退火溫度由具體引物決定，延伸72 ℃ 60 s，共35循環(huán)；延伸7 min。應(yīng)用2%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1．2．4 測序及序列分析：PCR產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司，采用Sanger法進(jìn)行雙向測序。序列比對和突變位點(diǎn)鑒定采用突變分析軟件Mutation Surveyor。

2 結(jié)果

2．1KCNJ18和KCNJ12序列結(jié)構(gòu)分析 已公布的人類KCNJ18 DNA序列(ACCESSION：NG_033093)全長12090bp，位于第17染色體，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA(ACCESSION：NM_001194958.2)的剪接位置為：1～192，3 461～3 582，10209-12090，長度2 196 bp，其中編碼區(qū)長度1302bp，位于10265-11566。此外，最近的序列預(yù)測發(fā)現(xiàn)KCNJ18存在一個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體(transcript variant)X1(ACCESSION：XM_005276919.2)，長度3 381 bp，其中編碼區(qū)長度1 608 bp。

人類KCNJ12 DNA序列(ACCESSION：NG_042809)全長43 481 bp，位于第17染色體，同樣由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA(ACCESSION：NM_021012.4)的剪接位置為：1～527、32 133～32 254、38 901～43 481，長度5 230 bp，其中編碼區(qū)長度 1302 bp，位于38957～40258。此外，最近的序列預(yù)測發(fā)現(xiàn)KCNJ12存在二個(gè)轉(zhuǎn)錄變異體X1(ACCESSION：XM_005256625.3)和X2(ACCESSION：XM_011523831.1)，X1長度4931 bp，其中編碼區(qū)長度1 302 bp，X2長度4 819 bp，其中編碼區(qū)長度1 302bp。

序列比對發(fā)現(xiàn)，KCNJ18編碼區(qū)序列與KCNJ12的相似度高達(dá)1 290/1 302(99.08%)，僅12個(gè)堿基有差異，未出現(xiàn)序列空位(Gaps)。KCNJ18基因前導(dǎo)區(qū)(編碼區(qū)上游1 0264 bp)與KCNJ12的序列相似度高達(dá)10 027/10 300(97.35%)，Gaps占129/10 300(1.25%)。KCNJ18尾部區(qū)(編碼區(qū)下游507 bp)與KCNJ12的序列相似度高達(dá)97%(509/527)，Gaps占0.76%(4/527)。見圖1。

mRNA序列比對發(fā)現(xiàn)，KCNJ18的mRNA與KCNJ12的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列的同源百分百均為91%，序列相似度為98%。KCNJ18的轉(zhuǎn)錄變異體X1與KCNJ12的三個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列的同源百分百均為87%，序列相似度為98%。見圖2。

圖1 KCNJ18 mRNA與KCNJ12三個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列比對

圖2 KCNJ18的轉(zhuǎn)錄變異體X1與KCNJ12三個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列比對

2．2 測序片段引物設(shè)計(jì) 由于KCNJ18和KCNJ12基因組序列太長，本研究只針對其編碼區(qū)進(jìn)行設(shè)計(jì)PCR引物。鑒于KCNJ18和KCNJ12編碼區(qū)及其側(cè)翼序列高度相似，且缺少序列空位，本研究在編碼區(qū)及其側(cè)翼序列(各100bp)共1502 bp范圍內(nèi)設(shè)計(jì)3對公共引物(KCNJ-1F：CACCAGCCCAGCCAGACA，KCNJ-1R：CTGTGCCCGCTTCTTGGG，KCNJ-2F：TGCATCATCGACTCCTTCATG，KCNJ-2R：GAGGGCACCTCATAGGTCTTG，KCNJ-3F：CACAGCCATGACCACCCA，KCNJ-3R：CCCGTTCTGCTCAAACCC)，其擴(kuò)增片段長度分別為670bp、550bp和475bp，擴(kuò)增范圍覆蓋兩個(gè)基因的編碼區(qū)。

2．3 測序片段序列比對 將3對公共引物在52例研究對象和10例健康對照者基因組DNA中的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，結(jié)果表明，3對引物均可同時(shí)在KCNJ18和KCNJ12基因上擴(kuò)增出目的片段。由于KCNJ18和KCNJ12的編碼區(qū)序列高度同源，不存在序列空位，從PCR產(chǎn)物測序峰圖可分辨出KCNJ18和KCNJ12序列(圖3)。利用突變分析軟件Mutation Surveyor比對52例研究對象在KCNJ18和KCNJ12編碼區(qū)序列上的差異，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何差異。

圖3 引物KCNJ-1的PCR產(chǎn)物測序峰圖

3 討論

SPP是亞洲人引起低鉀型周期性麻痹的第二大主要原因，其發(fā)病明顯高于高加索人種。因此，以大陸華人作為研究對象對揭示SPP的發(fā)病機(jī)制具有典型的代表性，具有重要意義。由于散發(fā)性低鉀性周期性麻痹與家族性低鉀性周期性麻痹具有類似的臨床表現(xiàn)特征特征，所以一直被認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與家族性低鉀性周期性麻痹同樣是由常染色體顯性遺傳缺陷導(dǎo)致，或者是不完全顯性的基因突變，對父母影響輕微，也有可能基因突變沒有影響到父母，盡管SCN4A和CACNA1S基因研究不能得到證實(shí)。有報(bào)道認(rèn)為KCNJ18基因突變引起散發(fā)性低鉀性周期性麻痹，但可惜的是只有極少數(shù)患者可以檢測得到基因的病態(tài)突變[9]。KCNJ12目前尚沒有人類相關(guān)低鉀性周期性麻痹的報(bào)道。

盡管SPP的臨床表現(xiàn)與FPP非常相似，但其臨床癥狀比較輕微，發(fā)病年齡晚、發(fā)作頻率低、缺乏明顯誘發(fā)因素等特點(diǎn)，只有少數(shù)SPP患者發(fā)現(xiàn)有CACNA1S或SCN4A基因突變。因此，Sung CC認(rèn)為，可能與FPP有所不同，代表著hypoKPP獨(dú)特的亞型[4]。

本研究表明，大陸華人散發(fā)性低鉀性周期性麻痹患者DNA未發(fā)現(xiàn)致病性KCNJ18和KCNJ12基因DNA突變。在本研究的52例患者中，通過KCNJ18、KCNJ12基因擴(kuò)增測序，與健康人群比較，均未發(fā)現(xiàn)有意義的基因突變?；仡櫹嚓P(guān)研究報(bào)告，顯示不論是華人還是高加索人患者，盡管有點(diǎn)突變報(bào)道，但發(fā)現(xiàn)率極低，難以解釋SPP的發(fā)病機(jī)制。

內(nèi)向性鉀離子整流通道是肌肉關(guān)鍵性部分，決定著肌肉的靜息電位、電興奮性調(diào)節(jié)、動(dòng)作電位去極化、鉀離子從T管系統(tǒng)中清除，Kir2通道位于細(xì)胞膜和T-管，Kri2的豐度對肌肉的功能至關(guān)重要。鉀離子通道通過與其他Kir亞單位重裝配影響影響肌肉的特性。內(nèi)向性整流鉀通道由亞單位的同源四聚體或異源四聚體裝配形成。Kri2.1、Kri2.2、Kri2.3亞單位能重裝配形成異源四聚體。Kir2.6在細(xì)胞表面很少表達(dá)，主要存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，但與其他Kir2.x很容易形成再裝配異源四聚體，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的顯性負(fù)性保留對內(nèi)向性整流通道調(diào)控起到重要的調(diào)節(jié)作用。因此認(rèn)為Kir2.6是一個(gè)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)節(jié)亞基。Kir2.6和Kir2.1或Kir2.2的聯(lián)合促進(jìn)了異源四聚體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保留，內(nèi)向性整流通道在細(xì)胞膜上的數(shù)量取決于Kir2.1、Kir2.2和Kir2.6亞單位之間的比例。我們推測，要保持健康個(gè)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，就要使細(xì)胞表面通道有一個(gè)穩(wěn)定的表達(dá)數(shù)量。認(rèn)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留是控制肌肉興奮性重要機(jī)制[10]。但在人類細(xì)胞系(HEK細(xì)胞)培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)Kir2.6通道是在細(xì)胞表面表達(dá)，Kir2.6和Kir2.1共表達(dá)產(chǎn)生Kir2.6和Kir2.1通道亞單位復(fù)合功能特性電流，Kir2.6在細(xì)胞表面表達(dá)產(chǎn)生細(xì)胞表面電流。KCNJ18基因如何導(dǎo)致細(xì)胞電生理改變還不清楚，需要進(jìn)一步研究。但不論kir2.6是在細(xì)胞表面表達(dá)還是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，mRNA低表達(dá)都可能影響其功能。

由于KCNJ18和KCNJ12編碼區(qū)及其側(cè)翼序列高度同源，其PCR引物必須根據(jù)兩者序列的同源性進(jìn)行設(shè)計(jì)，否則容易因?yàn)橐锱c目標(biāo)序列錯(cuò)配導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物測序失敗，或者測序結(jié)果出現(xiàn)假陽性。此外，相關(guān)研究表明KCNJ18突變與家族性周期性麻痹有關(guān)，鑒于KCNJ12與KCNJ18高度同源，而有關(guān)KCNJ12是否參與家族性周期性麻痹尚未見相關(guān)報(bào)道，有必要對其進(jìn)行研究。

盡管目前尚未在KCNJ18和KCNJ12的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)序列突變，但這兩個(gè)基因的編碼區(qū)只占其DNA序列的一小部分，大部分序列位于前導(dǎo)區(qū)和尾部區(qū)，目前未能排除這兩個(gè)區(qū)域存在突變。非編碼區(qū)的突變可影響基因的表達(dá)，從而影響基因的功能。目前的序列預(yù)測表明KCNJ18和KCNJ12存在5個(gè)轉(zhuǎn)錄本，說明兩者的基因表達(dá)比想象更為復(fù)雜。因此，有必要研究這兩個(gè)基因在散發(fā)性低鉀性周期性麻痹患者與健康對照在轉(zhuǎn)錄水平上的差異。

綜上所述，本研究表明，散發(fā)性低鉀性周期性麻痹在內(nèi)向性整流鉀離子通道基因KCNJ18/KCNJ12基因編碼區(qū)序列測序比對未發(fā)現(xiàn)與健康人群有差異。由于基因表達(dá)過程的復(fù)雜性，還需對其進(jìn)一步研究，除尋找基因突變性致病的可能外，也不排除基因表達(dá)調(diào)控異常的可能性。

真誠感謝：廣東省農(nóng)業(yè)科技研究所紅顏彬博士在課題實(shí)驗(yàn)研究的大力支持與指導(dǎo)。

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(收稿2016-07-12 修回2016-09-15)

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目，編號(hào)：201303B021800031

R 746.3

A

1673-5110(2016)24-0069-03