解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

灰樹花多糖協(xié)同順鉑對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

解嘉志 王文碩 許巖松 邱 原 金海萍 呂冬霞

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討灰樹花多糖(PGF)協(xié)同順鉑(DDP)對HeLa細(xì)胞凋亡的作用。方法 流式細(xì)胞儀測定不同藥物處理組的凋亡率,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài),免疫組化法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 蛋白表達(dá)。結(jié)果 流式細(xì)胞儀檢測顯示：PGF(0.05 mg/L)、DDP(1 mg/L)及聯(lián)合組(PGF 0.05 mg/L+ DDP 1 mg/L)作用24 h凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與空白對照組比較差異顯著(P<0.05)，協(xié)同作用組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)；HE染色觀察到凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；免疫組化顯示，聯(lián)合用藥組與兩單藥組比較caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論 聯(lián)合用藥對HeLa細(xì)胞的凋亡率較單獨(dú)用藥組有明顯提高，其作用機(jī)制可能與caspase-3蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

灰樹花多糖；順鉑；細(xì)胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

化療藥物在惡性腫瘤的治療中起到非常重要的作用，但毒副作用也較大。研究表明，灰樹花多糖(PGF)具有改善免疫系統(tǒng)功能、抑制腫瘤、調(diào)節(jié)血糖等功能〔1〕。本研究選用PGF聯(lián)合順鉑(DDP)，研究其對HeLa細(xì)胞凋亡的影響，探討PGF對DDP的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 材料 小牛血清與RPMI1640培養(yǎng)液(杭州四季青),DDP(山東齊魯制藥)，PGF(浙江方格藥業(yè)公司)，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3 免疫組化試劑盒(天津索羅門生物公司)。超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，流氏細(xì)胞儀(美國BD公司)。HeLa細(xì)胞(武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物冷藏中心)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 使用RPMI1640完全培養(yǎng)液(含10%小牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞。常規(guī)方法傳代。前期研究顯示0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP聯(lián)合作用于24 h時(shí)點(diǎn)具有協(xié)同作用。分組：空白對照組：予含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；PGF組：PGF濃度為0.05 mg/L；DDP組：DDP濃度1 mg/L;0.05 mg/L PGF與1 mg/L DDP為聯(lián)合用藥組。

1.3 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察凋亡細(xì)胞 多聚賴氨酸處理蓋玻片，將其置于6孔板中，以1×105個(gè)/ml接種，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入藥液，于24 h進(jìn)行常規(guī)HE染色，在顯微成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.4 流式細(xì)胞儀測定凋亡率 取對數(shù)生長期細(xì)胞加入藥物，培養(yǎng)24 h后，采用磷脂結(jié)合蛋白Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率。用無乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化、離心并收集細(xì)胞；冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次；400 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加5 μl Annexin V-FITC于懸液中，2℃～8℃避光15 min后，再加Propidium Iodide 5 μl，混勻繼續(xù)避光孵育5 min；1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

1.5 鏈霉親合素-生物素復(fù)合物(SABC)免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達(dá) 根據(jù)說明書檢測caspase-3 蛋白表達(dá)。隨機(jī)選取不重復(fù)的10個(gè)高倍視野(×400)觀察 。鏡下caspase-3表達(dá)陽性細(xì)胞為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)呈褐色或棕黃色，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)量，并求平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.5 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下觀察染色細(xì)胞，與對照組比較，處理組呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)：胞體小，皺而圓，核深染，質(zhì)濃縮。

2.2 流氏細(xì)胞儀測定凋亡率 PGF組、DDP組及聯(lián)合用藥組凋亡率分別為21.28%、23.60%和42.13%，與對照組(1.18%)比較均有顯著差異(P<0.05)；聯(lián)合用藥組與各單藥組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3 免疫組化法檢測caspase-3 蛋白表達(dá) 聯(lián)合用藥組(49.94%±3.73%)與兩單藥組(DDP組：35.23%±3.69%；PGF組：33.61%±3.35%)比較caspase-3 蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05,P<0.01)，且均高于空白對照組(10.11%±1.67%，P<0.05)。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過HE染色觀察到典型的凋亡細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果提示PGF與DDP有協(xié)同作用，使HeLa 細(xì)胞對DDP的敏感性提高。研究提示，PGF聯(lián)合DDP可明顯增強(qiáng)抗腫瘤作用，對其作用機(jī)制的研究為臨床PGF與DDP聯(lián)用并作為化療增敏劑治療宮頸癌提供了新思路、新方法。

目前研究普遍顯示，抗腫瘤藥物大多數(shù)以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的形式殺死腫瘤細(xì)胞進(jìn)而達(dá)到治療目的〔2,3〕。引起細(xì)胞凋亡的因素很多，其中細(xì)胞凋亡是由一系列高度調(diào)控的caspase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致的結(jié)果已被普遍接受，認(rèn)為細(xì)胞凋亡的核心執(zhí)行者是caspase〔4,5〕。caspase家族中caspase-3是效應(yīng)caspase〔6〕。細(xì)胞間的信號傳遞被caspase-3通過下游效應(yīng)因子切斷，并關(guān)閉DNA的復(fù)制與修復(fù)，破壞DNA的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核，誘導(dǎo)凋亡小體的形成，進(jìn)而執(zhí)行凋亡功能〔7〕。

PGF、DDP單獨(dú)應(yīng)用可導(dǎo)致細(xì)胞中caspase-3表達(dá)增強(qiáng)，且協(xié)同作用時(shí)caspase-3表達(dá)增強(qiáng)更為明顯。提示DDP與PGF促進(jìn)細(xì)胞凋亡具有共同的途徑，這可能是二者在一定時(shí)間及一定劑量時(shí)產(chǎn)生協(xié)同作用的機(jī)制。

1 Mayell M.Maitake extracts and their therapeutic potential〔J〕.Altern Med Rev,2001;6(1):48-60.

2 Wyllie AH,Kerr JF,Currie AR.Cell death:the significance of apoptosis〔J〕.Int Rev Cytol,1980;68(8):251-306.

3 Lee Y,Chong MJ,McKinnon PJ.Ataxia telangiectasia mutated-dependent apoptosis after genotoxic stress in the developing nervous system is determined by cellular differentiation status〔J〕.J Neurosci,2001;21(17):6687-93.

4 Rao RV,Hermel E,Castro-Obregon S,etal.Coupling endoplasmic reticulum stress to the cell death program.Mechanism of caspase activation〔J〕.J Biol Chem,2001;276(36):33869-74.

5 Bradham CA,Qian T,Streetz K,etal.The mitochondrial permeability transition is required for tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis and cytochrome C release〔J〕.Mol Cell Biol,1998;18(11):6353-64.

6 Nicholson DW,Ali A,Thornberry NA,etal.Identification and inhibition of the ICE/CED-3 protease nessary for mammalian apoptosis〔J〕.Nature,1995;376(6535):37-43.

7 Nicholson DW,Thornberry NA.Caspases:killer proteases〔J〕.Trends Biochem Sci,1997;22(8):299-306.

〔2016-02-17修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.31471312)；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.H2015074)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2016102220234)；佳木斯大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2016102220234)

呂冬霞(1965-)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事腫瘤發(fā)生機(jī)制與生物學(xué)治療研究。

解嘉志(1991-)，男，在讀本科，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R730.52

A

1005-9202(2017)03-0531-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.004