高波 陳杰 余宗濤 李文翠 張吉才△

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 姜堰 225500)

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腦梗死患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性檢測的意義

高波1陳杰2余宗濤1李文翠1張吉才1△

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院檢驗(yàn)科,湖北 十堰 442000；2.泰州市姜堰區(qū)第三人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 姜堰 225500)

目的 分析腦梗死患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性與勁動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度及外周血中同型半胱氨酸(HCY)水平的關(guān)系。方法 收集腦梗死患者100例，芯片法檢測MTHFR C677T基因多態(tài)性，根據(jù)多態(tài)型結(jié)果分為CC型、CT型、TT型；檢測不同多態(tài)型患者內(nèi)中膜厚度以及外周血中HCY濃度水平。結(jié)果 腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19，49，32%； CC型、CT型、TT型患者內(nèi)中膜厚度分別為(0.65±0.13)、(0.91±0.31)、(1.29±0.48)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CC型、CT型、TT型患者HCY水平分別為(10.03±3.24)、(12.04±2.89)、(14.19±3.03)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 MTHFR C677T基因突變可能是引起高HCY血癥的一個(gè)重要遺傳因素，并且可能增加腦梗死患者動(dòng)脈粥樣斑塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。

亞甲基四氫葉酸還原酶； 同型半胱氨酸； 腦梗死； 多態(tài)性； 內(nèi)中膜

腦梗死是一種常見的局限性腦組織軟化或壞死疾病，在我國的腦血管疾病中呈逐步增高趨勢。引起腦梗死的危險(xiǎn)因素很多，如年齡、肥胖、高血糖以及高血壓等。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在HCY向蛋氨酸轉(zhuǎn)化以及DNA合成過程中發(fā)揮著重要作用。C677T多態(tài)性引起的高同型半胱氨酸血癥可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活促凝因子，使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，從而促進(jìn)血栓形成。頸動(dòng)脈內(nèi)中膜(IMT)增厚往往是早期粥樣硬化的一個(gè)敏感指標(biāo)[1]。腦梗死的發(fā)病往往帶有不確定性，特別對于沒有明顯癥狀的急性患者。所以對于腦梗死患者來說預(yù)防大于治療。本文通過檢測MTHFR C677T基因的多態(tài)性，從基因多態(tài)性角度分析MTHFR C677T基因突變與高HCY血癥以及內(nèi)中膜厚度之間的關(guān)系，探討基因多態(tài)性在腦梗死發(fā)病過程中的作用，為腦梗死的個(gè)體化診治提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2011年1月至2014年12月門診或住院腦梗死患者100例，其中男性64例，女性36例，平均年齡(61.4±19.1)歲。腦梗死診斷需符合《全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂》的標(biāo)準(zhǔn)，需經(jīng)影像學(xué)CT或MRI診斷確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重的肝腎功能不全；(2)各種原因?qū)е碌某鲅阅X血管疾?。?3)昏迷病人；(4)后循環(huán)腦梗死患者。所有患者抽取肝素鈉抗凝血3 mL用于HCY 水平的檢查，標(biāo)本采集后離心留取血漿-80 ℃保存?zhèn)溆?，EDTA-K2抗凝血3 mL用于全血基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器 全血DNA提取試劑盒(北京天根)；ND-2000微量核酸定量儀(Thermo公司)；PE7500擴(kuò)增儀(ABI)；AU2700全自動(dòng)生化儀(貝克曼)；基因芯片儀，芯片識(shí)讀儀(上海百傲)；彩色多普勒超聲診斷儀(Vivid7，GE公司，美國)； HCY濃度檢測試劑盒(北京九強(qiáng))。

1.2.2 HCY濃度檢測 HCY在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檢測，所有試劑均采用配套試劑盒，定標(biāo)后測試，正常參考區(qū)間按照說明書進(jìn)行設(shè)置。

1.2.3 頸動(dòng)脈IMT厚度測量 所有檢測人員充分暴露頸部，測量部位一般為頸總動(dòng)脈離分叉處1～2 cm，頸外動(dòng)脈離分叉處1 cm，頸內(nèi)動(dòng)脈離分叉處1 cm。正常IMT厚度≤1 mm，頸總動(dòng)脈膨大≤1.2 mm。判斷標(biāo)準(zhǔn)：將頸總動(dòng)脈>1 mm，頸總動(dòng)脈膨大處>1.2 mm并突向管腔內(nèi)，則判斷為粥樣斑塊形成，并詳細(xì)記錄斑塊的基本特征如大小、部位、形態(tài)以及回聲等。

1.2.4 外周血中DNA提取 EDTA抗凝血采集后需按照試劑盒操作說明提取外周血中的全基因組DNA，若不能及時(shí)提取應(yīng)4℃保存，一般不宜存放超過1周。提取后的DNA經(jīng)微量核酸定量儀測定其濃度和純度后進(jìn)行PCR擴(kuò)增或者-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR擴(kuò)增 提取后的DNA經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲取PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，72 ℃ 25 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。獲取的擴(kuò)增產(chǎn)物需進(jìn)行雜交反應(yīng)或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 雜交及芯片識(shí)讀 對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，雜交體系及雜交條件參照說明書進(jìn)行。雜交結(jié)束后將芯片放置于芯片識(shí)讀儀中對結(jié)果進(jìn)行掃描判定，根據(jù)所得結(jié)果將所有患者分為CC型、CT型、TT型。

2 結(jié) 果

2.1 所有腦梗死患者M(jìn)THFR C677T基因多態(tài)性分析 100例腦梗死患者中MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%、49%、32%，等位基因頻率為C43.5%、T56.5%。腦梗死患者不同基因型(CC型、CT型、TT型)的判讀結(jié)果見圖1。

圖1 MTHFR C677T 基因多態(tài)性結(jié)果

2.2 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，IMT厚度以及HCY濃度均為CC型

表1 不同基因型患者IMT、HCY濃度的變化

注:*P<0.05,△P<0.05。

3 討 論

5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝過程中的關(guān)鍵酶，在葉酸代謝過程中起到重要作用。MTHFR有多個(gè)位點(diǎn)容易發(fā)生突變，其中最常見的基因突變是677位核苷酸突變?yōu)镃C、CT、TT三種。MTHFR 677位點(diǎn)雜合型CT突變和純合型TT突變可以影響到該酶的活性，葉酸濃度降低，蛋氨酸合成減少，進(jìn)而使得HCY淤積過多，產(chǎn)生高HCY血癥。頸動(dòng)脈的內(nèi)中膜厚度IMT與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)，通過頸動(dòng)脈彩超測定IMT厚度是預(yù)防腦梗死的一種簡單有效、無創(chuàng)、方便、經(jīng)濟(jì)的方法。

微陣列技術(shù)就是利用分子雜交原理，使同時(shí)被比較的標(biāo)本(用同位素或熒光素標(biāo)記)與微陣列雜交，并包被于芯片上，通過檢測包被芯片雜交信號(hào)強(qiáng)度及數(shù)據(jù)處理，用一種直觀圖像反映出基因多態(tài)性

的分型，常常用于遺傳性基因多態(tài)性的分析。本文采用DNA微陣列芯片法檢測腦梗死患者外周血中MTHFR基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，MTHFR C677T 基因CC型、CT型、TT型的檢出頻率分別為19%，49%，32%，可以很好的檢出MTHFR C677T基因多態(tài)性分型。研究[2]表明CT型、TT型的基因突變可以降低MTHFR的酶活性，導(dǎo)致葉酸代謝途徑障礙。這就使得突變型的腦梗死患者由于MTHFR酶活性的降低導(dǎo)致高HCY血癥，HCY又可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，激活促凝血因子，進(jìn)而促進(jìn)纖溶酶激活物抑制劑的表達(dá)，抑制硫酸肝素的合成，促進(jìn)血小板粘附聚集，使得機(jī)體處于高凝狀態(tài)，導(dǎo)致血栓的形成[3-5]，進(jìn)而增加腦血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。而如果通過基因檢測，對于突變型的患者攝入一定劑量的葉酸，早期進(jìn)行葉酸干預(yù)，提高酶活性，同樣可以維持正常的HCY代謝濃度，降低由于高HCY血癥導(dǎo)致的血管損害及并發(fā)癥的發(fā)生。這為腦梗死患者的診治提供了一定的個(gè)體化依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論是IMT厚度，還是HCY濃度，均為CC型

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2015-06-18)

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