翁謝川

（軍事醫(yī)學(xué)研究院1.軍事認知與腦科學(xué)研究所，2.國家蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，北京 100850）

超極化激活的環(huán)核苷酸門控（hyperpolarizationactivated and cyclic nucleotide-gated，HCN）陽離子通道是一類新近發(fā)現(xiàn)的由HCN1-4基因家族編碼的離子通道［1］。不同于經(jīng)典的去極化激活的Na+通道和K+通道，HCN通道在膜電位超極化時開放，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能和角色倍受關(guān)注。

HCN通道對K+和Na+具有通透性，其離子通透比率為3～5∶1，其反轉(zhuǎn)電位在-30 mV左右［1］。HCN通道需要細胞外有Cl-和K+存在時才能開放。有趣的是，在HCN通道的C末端有一個環(huán)核苷酸結(jié)合域（cyclic nucleotide-binding domain，CNBD），稱為C-linker，在HCN通道的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。C-linker可通過結(jié)合環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）等信號分子誘導(dǎo)HCN通道的電壓依賴曲線右移，從而使HCN通道更容易開放［2-4］。因此，HCN通道電流也被稱為“有意思的電流（funny current，If）”或“奇怪的電流（queer current，Iq）”。HCN 通道在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能和角色與它的這些電生理特征緊密相連［5］。本文重點探討HCN通道在神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能和作用、調(diào)節(jié)因子及其作為新藥靶點可能的臨床意義。

1 HCN通道蛋白家族

HCN通道于20世紀70年代在竇房結(jié)細胞和神經(jīng)元中被發(fā)現(xiàn)和鑒定，由4個相同的亞基組成聚合體（homomeric）或由4個不同的亞基構(gòu)成復(fù)合體（heteromeric）［6］。在哺乳動物中，HCN 通道家族包含HCN1，HCN2，HCN3和HCN4 4個亞單位，亞單位之間序列的同源性約為60%。每個亞單位都有6個跨膜區(qū)，跨膜區(qū)包括6個α-螺旋（S1～S6），其中S5和S6螺旋區(qū)域負責(zé)離子的選擇性通透，帶正電的S4螺旋區(qū)域為電壓感受器［7］。

雖然HCN通道4個亞型介導(dǎo)的電流互不相同，但依據(jù)其激活的動力學(xué)特征，它們激活的速度都具有強烈的電壓依賴性，其激活速度HCN1＞HCN2＞HCN3＞HCN4。另外，HCN通道4個亞型對cAMP，cCMP 和 cGMP的敏感性也存在差異［2，4］。例如，cAMP能使HCN2和HCN4的激活曲線右移+15 mV，而對HCN1和HCN3的調(diào)節(jié)作用卻很弱［4］?？梢韵胂蟮氖?，不同亞基構(gòu)成的HCN通道，其生物物理特性由每個亞單位共同確定，而這種通道的構(gòu)成方式對于不同類型神經(jīng)元中HCN電流的多樣性具有重要意義。

2 HCN通道在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達模式

HCN通道主要在大腦和心臟中表達。近年來，在味蕾、胰腺細胞、睪丸、平滑肌、內(nèi)耳和腎等組織中也發(fā)現(xiàn)有HCN通道蛋白的存在，其功能和角色作用還不清楚［5，8-12］。在大腦中，HCN2亞型的表達最為普遍，幾乎存在于所有的腦內(nèi)核團；而HCN1在大腦皮質(zhì)、海馬和上丘中表達最為豐富［13］。HCN3的表達多見于嗅球、下丘腦核團和視網(wǎng)膜。HCN4主要在丘腦核團、基底神經(jīng)節(jié)、嗅球及大鼠脊髓和海馬的快速放電的中間神經(jīng)元中表達［10，14］。

在神經(jīng)元，HCN通道存在于樹突、胞體和軸突的末端，其在神經(jīng)元表面表達的密度不盡相同［1］。例如，HCN通道在丘腦網(wǎng)狀神經(jīng)元遠端樹突的表達比在胞體豐富，而在丘腦皮質(zhì)的中繼神經(jīng)表面的分布幾乎是均勻的。在成熟大鼠大腦皮質(zhì)的V層錐體神經(jīng)元中，HCN1在樹突中表達豐富，而HCN2主要表達在神經(jīng)元的胞體［15］。

本課題組近期發(fā)現(xiàn)，HCN1，HCN2和HCN3在各種類型的感覺神經(jīng)元上均有表達，與文獻報道一致［5，11，16-17］。RT-PCR 和免疫組化證實，HCN1，HCN2和HCN3共存于正常大鼠的脊髓背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglions，DRG），主要在大型神經(jīng)元上，其中HCN1是表達最為豐富的亞型。

HCN1和HCN2通道蛋白在傷害性感覺神經(jīng)元和低閾值的機械感覺神經(jīng)元中都有表達，這可能與其參與神經(jīng)的傳導(dǎo)速率相關(guān)［11］。HCN1和HCN2通道蛋白水平在非傷害性感覺神經(jīng)元中的高表達，可能與其參與DRG傳導(dǎo)非疼痛性刺激相關(guān)。對比DRG中的其他神經(jīng)元，HCN2較HCN1更高表達于肌梭傳入神經(jīng)元（muscle spindle afferents，MSA）［5］，該結(jié)果與MSA中記錄到的大的HCN電流相一致。而在正常大鼠的C纖維傷害性感覺神經(jīng)元，HCN1和HCN2通道蛋白的表達水平較低，其HCN電流比較小，甚至低于一些低閾值的C纖維神經(jīng)，盡管傷害性感覺神經(jīng)元中的HCN2在慢性疼痛中發(fā)揮著非常重要的角色［6，11］。

3 HCN通道在慢性疼痛中的重要作用

越來越多的證據(jù)表明，HCN通道在炎性和神經(jīng)病理性疼痛中扮演重要角色［5-6，11，16，18］。利用在體胞內(nèi)技術(shù)記錄正常大鼠和弗氏完全佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的后肢炎性痛大鼠L4/L5的DRG神經(jīng)元，本課題組發(fā)現(xiàn)，負責(zé)傷害性感覺的C纖維神經(jīng)元而不是Aδ纖維神經(jīng)元興奮性增強，其HCN通道電流幅度顯著增加［5］。免疫組化實驗進一步發(fā)現(xiàn)，HCN通道電流的增大與HCN2而不是HCN1和HCN3的表達上調(diào)相關(guān)。其他研究也證實了小型神經(jīng)元中的HCN2在皮膚炎癥1 d后表達即開始上調(diào)，而大型神經(jīng)元中的HCN2表達在炎癥4 d后下降。因此，HCN2在炎性疼痛中發(fā)揮重要的角色［11］。

在部分神經(jīng)損傷的模型中，盡管HCN電流Ih增大，但HCN1和HCN2通道m(xù)RNA和蛋白表達卻降低，而HCN3和HCN4的表達未發(fā)生變化，因此說明HCN通道還存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)機制［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)根型頸椎病模型中，大鼠坐骨神經(jīng)損傷后Aδ而非Aα/β神經(jīng)元Ih電流增加。在這個模型中，通過插入不銹鋼棒進入椎間孔的L4和L5直接進行DRG的慢性壓迫，5～7 d后進行疼痛的行為學(xué)和電生理測試。從傷害性神經(jīng)元中敲除HCN2亞型可以消除熱誘發(fā)炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛的癥狀，但急性疼痛感覺不受影響［6，18-19］。另外，神經(jīng)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道選擇性拮抗劑ZD7288可以顯著逆轉(zhuǎn)慢性疼痛中痛覺過敏、痛覺超敏和自發(fā)性疼痛的癥狀［1，5］。以上研究表明，HCN 通道在慢性炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛中具有重要功能，選擇性HCN通道阻斷劑可能成為有價值的鎮(zhèn)痛藥。

4 HCN通道參與部分腦疾病的發(fā)生

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)細胞構(gòu)成的錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，具有多種電學(xué)特性。對于一個特定的神經(jīng)元，細胞HCN電流大小和動力學(xué)的增加或減少可能對大腦功能、興奮性或抑制性產(chǎn)生不同的影響，這取決于神經(jīng)元的內(nèi)在特性及其在大腦信號整合背景下的角色［20］。在大腦中，HCN通道的表達和動力學(xué)特征的改變與癲癇、失神發(fā)作、帕金森病、抑郁癥及一些環(huán)境刺激等病理疾病緊密相關(guān)［1，21-24］。例如，在毛果蕓香堿誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)性抽搐狀態(tài)中，HCN通道蛋白在膜表面表達，但在隨后1周內(nèi)，HCN通道蛋白和mRNA表達降低，其電壓依賴性也在癲癇病中發(fā)生改變［17-18］。

感覺傳入是增加或保持HCN通道表達水平的必要條件。研究發(fā)現(xiàn)，胡須剝奪實驗減少了大鼠軀體感覺皮質(zhì)樹突HCN通道的表達［7］。在同一癲癇模型中，HCN2在海馬CA3區(qū)增加，而在海馬CA1區(qū)HCN1和HCN2通道蛋白減少［25-26］。研究還發(fā)現(xiàn)，在社交沖突模型和慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）所致的抑郁模型中，HCN通道蛋白表達上調(diào)且Ih電流增大，而ZD7288能有效治療抑郁的發(fā)生，表明HCN參與了抑郁癥的發(fā)生［24］。另外，近期研究發(fā)現(xiàn)，HCN通道還參與了甲基苯丙胺成癮的發(fā)生。這些研究表明，HCN通道廣泛參與了大腦疾病。然而，HCN通道表達的調(diào)控機制仍然需要進一步的探討［26-30］。

5 HCN通道參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的機制

5.1 HCN通道對神經(jīng)興奮性的調(diào)節(jié)

HCN通道參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與其對神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)直接相關(guān)。由于典型的HCN通道電流反轉(zhuǎn)電位約為-30 mV，高于動作電位產(chǎn)生的正常閾值，HCN通道電流控制膜電位在靜息膜電位附近［7］。當移除HCN通道的電導(dǎo)，模擬神經(jīng)元顯示超極化膜電位。例如，阻斷HCN通道可以誘導(dǎo)大鼠上丘神經(jīng)元的超極化［1］。雖然HCN通道電導(dǎo)降低了興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）振幅，但這種抑制效應(yīng)被膜電位的去極化作用所掩蓋［7］。此外，HCN通道減弱抑制性突觸輸入的影響，因為抑制性突觸超極化電導(dǎo)可以打開HCN通道，喚起極化電導(dǎo)［6-7］。當電壓依賴的HCN通道被cAMP或者磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）調(diào)節(jié)時，通道在靜息膜電位附近即可激活，并可作為一個興奮因子［2］。而且，用光纖刺激大鼠的上丘時，樹突的HCN通道被激活產(chǎn)生短和固定潛伏期的樹突電位［2-3，31］。

一般認為，活化的HCN通道電導(dǎo)可以降低膜電阻。這種降低可以抑制突觸輸入對膜電位的影響［1，7］。隨著HCN通道的激活，突觸后電位的振幅和動力參數(shù)逐漸變小變短。樹突的HCN通道可以使皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元突觸輸入正常化。HCN通道的密度隨著海馬和新皮質(zhì)錐體神經(jīng)元體細胞的距離的增加而增大［21］。這種樹突HCN通道決定著神經(jīng)元胞體上EPSP振幅的大小，并且抑制海馬和新皮質(zhì)錐體神經(jīng)元突觸輸入的位置依賴性［1］。

激活的HCN通道參與了突觸輸入的過程。由于HCN通道電導(dǎo)通過降低膜電阻而縮短了EPSP的上升時間和衰減時間，因此抑制了在低頻時發(fā)生的重復(fù)EPSP的總和。這種抑制過濾出低頻輸入，從而提高了同步突觸輸入的選擇性［7］。離子通道的主動電導(dǎo)使神經(jīng)元產(chǎn)生固有的膜電位振蕩和共振。這樣的節(jié)律性活動可以在一定的頻率過濾輸入，并能影響峰電位的定時精度［7］。HCN通道電流過濾出慢頻輸入。有證據(jù)表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域中，Ih電流對神經(jīng)元同步放電的產(chǎn)生有促進作用［32］，例如在丘腦皮質(zhì)中繼神經(jīng)元的Ih電流參與了調(diào)節(jié)睡眠和覺醒狀態(tài)的活動［14］。需要指出的是，HCN通道的表達必須是賦予細胞有節(jié)奏的放電能力，原因在于細胞啟動和（或）維持有節(jié)奏活動的能力取決于功能上不同類的離子通道的相互作用［7］。

5.2 細胞內(nèi)信號分子對HCN通道的調(diào)節(jié)

HCN通道可以被細胞內(nèi)信號分子調(diào)控，包含cAMP，PIP2和三角形四肽重復(fù)的相互作用蛋白（tetratricopetide repeat-containing Rab8b-interacting protein，TRIP8b）［2，33-34］。此外，電壓門控性鉀通道對HCN通道活動有很強的影響［7］。由于這些特性，HCN通道電流可以有廣泛的功能，并由一個微妙的平衡調(diào)節(jié)系統(tǒng)決定。研究證實，背根神經(jīng)節(jié)的許多神經(jīng)調(diào)質(zhì)如P物質(zhì)、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、血清素和神經(jīng)介素U都有增強Ih電流的作用［35］。增加神經(jīng)元Ih電流可能意味著炎癥介質(zhì)和神經(jīng)肽產(chǎn)生痛覺過敏的一種新的機制。此外，鈣依賴磷酸酶的激活和P38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）的失活參與到電壓依賴性的超極化轉(zhuǎn)移中［35］。

有報道顯示，一些蛋白質(zhì)和HCN通道蛋白一起組裝，其功能意義尚不清楚。這種蛋白質(zhì)包括電壓門控性鉀通道蛋白、Isk相關(guān)的家庭成員2、鉀通道調(diào)節(jié)器1、細絲蛋白A（filamin A）、腸抑胃肽（gastric inhibition polypeptide，GRP1）相關(guān)的支架蛋白以及小窩蛋白-3（caveolin-3）等。這些蛋白質(zhì)在HCN通道功能方面的具體作用有待進一步研究驗證。

除了輔助亞基，HCN通道也被幾個小分子質(zhì)量因子調(diào)控［6］。這些因子中最典型的是PIP2，它能使HCN通道的激活曲線右移約+20 mV。這個調(diào)節(jié)是非常重要的，因為它需要在生理電壓范圍內(nèi)激活HCN通道。除了PIP2，一些其他酸性脂類如磷脂酸和花生四烯酸，它們是二酰甘油激酶-磷酯酶A2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的產(chǎn)物，能促進HCN通道的激活。HCN通道活動也受細胞外的K+、Cl-濃度和細胞內(nèi)外的H+濃度的調(diào)節(jié)。

第三組HCN 通道調(diào)節(jié)器包括蛋白激酶［6，35］。酪氨酸蛋白激酶可以直接與HCN1，HCN2和HCN4相互作用，并通過磷酸化的酪氨酸來調(diào)節(jié)Ih電流。酪氨酸蛋白激酶在生理條件下對HCN通道的調(diào)節(jié)作用在大鼠竇房結(jié)起搏細胞和神經(jīng)元都得到了證實。P38 MAPK能上調(diào)海馬錐體神經(jīng)元中HCN通道的表達，而鈣依賴磷酸酶能通過誘導(dǎo)激活曲線超極化偏移來抑制海馬錐體神經(jīng)元中HCN通道［1，6］。而P38 MAPK和鈣依賴磷酸酶的這種雙向調(diào)節(jié)是由HCN通道直接的磷酸化或去磷酸化還是由其他蛋白機制引起［36］，還有待進一步確定。cGMP依賴性蛋白激酶2已被確定為HCN通道在大腦中的另一個調(diào)節(jié)因子。它結(jié)合到HCN2 C末端并且磷酸化CNBD的一個特定絲氨酸殘基［37］。該修飾使激活曲線向超極化方向偏移。因此，cGMP通過2種方式來調(diào)節(jié)HCN通道活動：①直接結(jié)合到通道蛋白的CNBD來增強HCN電流；②磷酸化CNBD抑制通道的開放。

6 HCN通道未來的臨床意義

HCN通道可以在興奮和抑制2種狀態(tài)下工作，并且這種作用通過藥理學(xué)調(diào)節(jié)來修飾。因此，HCN通道是潛在的治療腦部疾病的理想靶標。

影響Ih的藥物常被稱為減慢心率藥，常被用來研究HCN通道的功能［1，25］。由于對cAMP敏感，β受體阻滯劑主要影響HCN2和HCN4，但其他減慢心率的藥物對HCN通道并沒有特定的選擇性。一些藥物包括ZD7288、烯丙尼定（alinidine）、扎替雷定（zatebradine）和伊伐布雷定（ivabradine）［5，38-40］，這些藥物已被用來治療心動過速。

本課題組研究表明，對CFA誘導(dǎo)的慢性炎性疼痛模型大鼠和神經(jīng)損傷模型大鼠，HCN通道阻斷劑ZD7288具有明顯的減輕疼痛和反轉(zhuǎn)慢性疼痛癥狀的作用。另外，其他臨床常用的鎮(zhèn)痛藥也被證明可能是通過調(diào)節(jié)HCN通道功能而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效果［6，19，39］。例如，一些局麻藥曾被認為是通過阻斷電壓門控鈉通道來發(fā)揮作用，但其對鈉通道并無高選擇性，可能還存在其他藥理作用機制［38］。全身給予利多卡因（lidocaine）對神經(jīng)病理性疼痛有效，其有效劑量下血漿利多卡因濃度與其抑制心肌細胞HCN通道電流的IC50接近，但比其作用于鈉通道的IC50低得多［40-41］。雖然尚不足以斷定利多卡因治療疼痛與其抑制Ih電流相關(guān)，但利多卡因?qū)CN通道的抑制作用可能強于其對鈉離子通道的抑制作用。

總之，由于HCN通道在神經(jīng)系統(tǒng)重要的功能及其對神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)的重要性，已成為慢性疼痛及一些腦疾病的潛在治療靶點。一些臨床使用的藥物將為我們HCN通道亞基選擇性拮抗劑提供線索。此外，HCN通道在神經(jīng)系統(tǒng)的功能和相關(guān)機制仍有待進一步闡明。

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