龍 帥 ＊，王金鵬 ＊，曹 峰 ，陶 欣 ，張 勇

（北京大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，2.神經(jīng)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3.國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)神經(jīng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4.神經(jīng)科學(xué)研究所，北京 100083；5.北京大學(xué)IDG麥戈文腦科學(xué)研究所，北京 100871）

人類的大腦由億萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元相互聯(lián)結(jié)而成，可以執(zhí)行高度復(fù)雜的工作。神經(jīng)元之間通過突觸相互連接并傳遞信號(hào)，大腦中每個(gè)神經(jīng)元可形成上萬(wàn)個(gè)突觸。突觸連接的形成、消失以及突觸傳遞效能的改變可以被各種經(jīng)歷所修飾，這一高度動(dòng)態(tài)化的過程被稱作突觸可塑性，突觸可塑性對(duì)于學(xué)習(xí)和記憶等高級(jí)大腦功能非常重要［1-2］。因此，理解突觸傳遞和可塑性的分子機(jī)制是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的最基本問題之一。

突觸傳遞是由從突觸前膜釋放的神經(jīng)遞質(zhì)與突觸后膜上的受體相結(jié)合這一過程介導(dǎo)的。谷氨酸受體是興奮性神經(jīng)元上最重要的突觸后受體之一，包括α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸（alphaamino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid，AMPA）型、N-甲D-基天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）型和紅藻氨酸（kainate）型3種類型。AMPA受體是由4種亞基（GluA1，GluA2，GluA3和GluA4）組成的雜合四聚體結(jié)構(gòu)的離子通道，AMPA受體介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大部分快速興奮性神經(jīng)突觸傳遞。突觸后AMPA受體的數(shù)量由突觸后位點(diǎn)上受體的插入和移除的相互調(diào)節(jié)所控制。該過程包括質(zhì)膜上的胞吞作用、胞吐作用以及側(cè)向擴(kuò)散作用［3］。這是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)化的過程，每一步都受到緊密調(diào)控［1-2，4-7］。大量研究證明，AMPA受體的功能和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)對(duì)多種形式的突觸可塑性起決定性作用［8］。

AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)控和突觸可塑性的機(jī)制一直是神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［9］。分子水平上，突觸可塑性最主要的表現(xiàn)形式為長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）和長(zhǎng)時(shí)程抑制（long term depression，LTD）。研究表明，突觸后表面AMPA受體的數(shù)量和活性對(duì)調(diào)控LTP和LTD的表達(dá)起決定性作用［10］。因此，AMPA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控在突觸可塑性及學(xué)習(xí)和記憶中是一項(xiàng)十分重要的細(xì)胞學(xué)機(jī)制［8，11］。

AMPA受體功能或轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂會(huì)導(dǎo)致突觸功能異常，進(jìn)而影響學(xué)習(xí)和記憶。人類遺傳學(xué)證據(jù)表明，當(dāng)AMPA受體或調(diào)控AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白發(fā)生遺傳突變時(shí)，會(huì)導(dǎo)致各種神經(jīng)和精神性疾病，包括自閉癥、精神分裂癥、阿爾茨海默病以及智力障礙。因此，闡明介導(dǎo)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)理解大腦功能和神經(jīng)性疾病的細(xì)胞基礎(chǔ)具有重要的意義。本綜述將討論AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域的重要發(fā)現(xiàn)，闡述體外成像和體內(nèi)成像技術(shù)的發(fā)展對(duì)突觸可塑性研究的貢獻(xiàn)，并比較各自技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 體外AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)成像研究

研究者通過生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及電生理記錄等研究手段，在很大程度上促進(jìn)了人們對(duì)神經(jīng)元突觸可塑性的細(xì)胞與分子機(jī)制的研究。近年來(lái)，隨著熒光顯微鏡的發(fā)展，研究者可以通過顯微鏡直接對(duì)細(xì)胞和分子進(jìn)行觀察。NMDA和AMPA型谷氨酸受體抗體的雙標(biāo)免疫共定位研究結(jié)果顯示，2受體在一些突觸共定位［3］。只有NMDA受體而缺乏AMPA受體的突觸稱為沉默型突觸，而同時(shí)具有NMDA受體和AMPA受體的突觸稱為活躍型突觸，AMPA受體的插入會(huì)介導(dǎo)沉默型突觸到活躍型突觸的轉(zhuǎn)變，該轉(zhuǎn)變也被認(rèn)為是LTP的一種重要形式。此外，Nusser等［12］利用免疫金標(biāo)記技術(shù)確定了大鼠海馬區(qū)域突觸AMPA受體的數(shù)量和變異性。雖然大腦切片離體培養(yǎng)的原代神經(jīng)元的免疫組化研究能確定AMPA受體在突觸上的空間位置［13］，但是由于AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)化過程，只有實(shí)時(shí)成像才能觀測(cè)到每個(gè)突觸的精細(xì)變化［14］。

AMPA受體和熒光蛋白的重組技術(shù)已廣泛用于AMPA受體亞基在神經(jīng)元細(xì)胞里動(dòng)態(tài)變化的研究［6，15-16］。綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）和共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用極大地促進(jìn)了活細(xì)胞中受體轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)研究［17］。為了觀察活神經(jīng)元中AMPA受體的動(dòng)態(tài)變化過程，Shi等［18］將AMPA受體的GluA1亞基連接上GFP。GFP-GluA1蛋白具有正常的功能并且可在海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元中瞬時(shí)表達(dá)。利用雙光子激光掃描顯微鏡（two photon laser scanning microscope，TPLSM）觀察顯示GFP-GluA1模擬了內(nèi)源性GluA1的分布，并發(fā)現(xiàn)GluA1的分布受神經(jīng)元活性的調(diào)節(jié)。

成像方法并不能區(qū)分GFP蛋白偶聯(lián)的AMPA受體定位于胞內(nèi)還是位于質(zhì)膜表面。然而，只有嵌合在質(zhì)膜上的AMPA受體才具有活性并且參與突觸的傳遞。因此，區(qū)分這2種位于不同細(xì)胞位置的AMPA受體非常關(guān)鍵。Passafaro等［6］在離體培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細(xì)胞中，采取凝血酶裂解實(shí)驗(yàn)并結(jié)合抗體標(biāo)簽來(lái)測(cè)量AMPA受體亞基表面表達(dá)的速率和位置，進(jìn)而區(qū)分位于不同區(qū)域的AMPA受體。然而，該技術(shù)存在一定的局限性。為了有效地選擇性觀察鑲嵌在膜上的AMPA受體，可使用對(duì)pH值敏感的GFP（super ecliptic phluorin，SEP）來(lái)研究膜表面AMPA受體的變化。SEP是GFP蛋白亞型，在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中由于轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡內(nèi)的酸性環(huán)境，SEP的熒光被淬滅，當(dāng)SEP通過轉(zhuǎn)運(yùn)嵌入到神經(jīng)元表面暴露于胞外中性環(huán)境時(shí)，其熒光強(qiáng)度大大增加［19］。

SEP標(biāo)簽蛋白的發(fā)現(xiàn)極大地促進(jìn)了不同AMPA受體亞基表面位置的研究和在LTP或LTD的條件下的AMPA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，同時(shí)也促進(jìn)對(duì)受體插入事件的可視化。在離體培養(yǎng)的原代神經(jīng)元和急性海馬切片中，通過化學(xué)藥物刺激，如甘氨酸或腺苷酸環(huán)化酶激活劑可引起突觸強(qiáng)化；另外，通過谷氨酸用于單個(gè)樹突棘也可引起突觸連接的增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，通過來(lái)自樹突干受體的側(cè)向擴(kuò)散或通過受體胞吐作用都可增加樹突棘表面的AMPA受體的含量，樹突棘上GluA1和GluA2的含量增加將介導(dǎo)LTP。Yudowksi等［20］對(duì)海馬切片中連有SEP-GFP的GluA1進(jìn)行成像研究，使其對(duì)AMPA受體的個(gè)體膜插入事件可視化。研究發(fā)現(xiàn)，胞吐作用主要發(fā)生在胞體和樹突干部位，而由以上部位釋放的AMPA受體可擴(kuò)散到樹突棘部位。綜上，突觸的AMPA受體數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡是通過突觸后位點(diǎn)受體的插入和移除來(lái)調(diào)節(jié)。這些過程是高度動(dòng)態(tài)化和緊密調(diào)控的，涉及到脂膜的胞吞作用、胞吐作用和側(cè)向擴(kuò)散的調(diào)控［1-2，4-7］。

使用NMDA處理離體培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元會(huì)誘導(dǎo)LTD并且會(huì)導(dǎo)致AMPA受體的GluA1亞基去磷酸化和內(nèi)吞［21］。但由于NMDA的使用會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的快速酸化，影響AMPA受體的SEP熒光強(qiáng)度的改變，所以要謹(jǐn)慎使用NMDA［8］。雖然熒光蛋白的使用極大地促進(jìn)了AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的研究，但是熒光蛋白的引入通常是通過過表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。避免過表達(dá)的方法是構(gòu)建敲入小鼠品系，使得熒光蛋白融合的AMPA受體的表達(dá)受內(nèi)源基因啟動(dòng)子調(diào)控。

活細(xì)胞成像技術(shù)很好地促進(jìn)了AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)的研究，并且為研究AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制提供了一個(gè)新途徑。通過對(duì)AMPA受體本身或互作蛋白進(jìn)行點(diǎn)突變，Lin等［22］發(fā)現(xiàn)，AMPA受體結(jié)合蛋白4.1N對(duì)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸可塑性具有重要的功能。其中4.1N蛋白通過提供肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和AMPA受體連接來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。除了4.1N外，PICK1和GRIP1/2等多種結(jié)合蛋白都在調(diào)節(jié)AMPA受體的上膜和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著關(guān)鍵的作用［23-24］。

2 體內(nèi)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)時(shí)成像

2.1 體內(nèi)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和突觸分子的實(shí)時(shí)成像

如上所述，在離體培養(yǎng)的神經(jīng)元和大腦切片中，已進(jìn)行了很多AMPA受體的成像研究。但體外系統(tǒng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能模擬整體大腦的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。為更好地理解突觸可塑性以及大腦的功能，活體動(dòng)物AMPA受體的動(dòng)態(tài)化研究非常必要。

目前，TPLSM成像已經(jīng)廣泛地用于突觸可塑性的研究，在完整的神經(jīng)組織中，可獲得高分辨率和高靈敏的熒光成像。TPLSM已經(jīng)被用于活體細(xì)胞水平和亞細(xì)胞水平對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元活動(dòng)可視化研究。Chen等［25］利用遺傳編碼的熒光鈣離子指示劑，比如GCaMP，對(duì)神經(jīng)元的活性進(jìn)行可視化研究。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠視覺皮質(zhì)2和3層的錐形神經(jīng)元中，GCaMP6穩(wěn)定地檢測(cè)到在胞體的放電活動(dòng)。

在小鼠發(fā)育和學(xué)習(xí)過程中，利用TPLSM和Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，可對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行持續(xù)數(shù)天到數(shù)月的觀察［26］。樹突棘與樹突干相通，但也是一個(gè)相對(duì)隔離的特殊區(qū)域。樹突棘是神經(jīng)突觸尤其是興奮性突觸富集的結(jié)構(gòu)。樹突棘的更替可以直接通過同一神經(jīng)元的重復(fù)成像來(lái)追蹤［27］。研究發(fā)現(xiàn)，樹突棘隨著時(shí)間推移可消失和重現(xiàn)。樹突棘的動(dòng)態(tài)化對(duì)于動(dòng)物的正常發(fā)育和大腦功能都非常重要；另外，感覺的喪失、環(huán)境豐富以及學(xué)習(xí)等過程都會(huì)改變樹突棘的更替。

Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物成像在很大程度上促進(jìn)了對(duì)突觸結(jié)構(gòu)的理解。但是，要想闡述突觸可塑性的詳細(xì)機(jī)制，需要轉(zhuǎn)向分子水平進(jìn)行進(jìn)一步研究。Gray等［28］對(duì)青年小鼠的突觸后網(wǎng)架蛋白PSD-95研究發(fā)現(xiàn)，樹突棘上的PSD-95蛋白在小鼠早期發(fā)育是穩(wěn)定存在的。但將PSD-95連接GFP標(biāo)簽成像后研究發(fā)現(xiàn)，突觸PDS-95可迅速地重新分配，并隨著動(dòng)物發(fā)育而持續(xù)增加，在阻斷感覺信息攝入后突觸PSD-95則會(huì)減少。

2.2 體內(nèi)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)時(shí)成像

樹突棘和突觸結(jié)構(gòu)蛋白的可視化雖揭示了突觸的結(jié)構(gòu)改變，但對(duì)突觸功能以及突觸強(qiáng)度的相關(guān)信息仍不清楚。因此，活體動(dòng)物突觸受體即時(shí)成像非常必要。

為了研究AMPA受體的轉(zhuǎn)運(yùn)，Mayford［29］實(shí)驗(yàn)室建立了GFP-GluA1的轉(zhuǎn)基因小鼠，他們發(fā)現(xiàn)條件化恐懼記憶可以引起新合成的GFP-GluA1在蘑菇狀樹突棘富集。遺憾的是該轉(zhuǎn)基因小鼠的GFPGluA1表達(dá)量比較低，即使在大腦切片中也需要通過熒光染色才能觀測(cè)到GFP信號(hào)，并不適合活體成像。Malinow實(shí)驗(yàn)室利用胚胎電轉(zhuǎn)的方法對(duì)SEPAMPA受體進(jìn)行了成像研究，他們發(fā)現(xiàn)感覺信息能特異性地引起區(qū)域性樹突棘的增強(qiáng)效應(yīng)［30］。該研究雖然止步于腦片成像，但為活體AMPA受體活體成像提供了新的思路。轉(zhuǎn)基因小鼠AMPA受體表達(dá)量并不盡如人意，AAV或Lenti病毒包裝GFPAMPA受體可以實(shí)現(xiàn)，但即使在體外原代神經(jīng)元中，熒光信號(hào)也很弱。為了解決這些難題，Huganir實(shí)驗(yàn)室對(duì)胚胎電轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行了進(jìn)一步的探索和嘗試，最終實(shí)現(xiàn)了AMPA受體的活體成像。具體來(lái)講，首先將SEP融合的GluA1亞基、myc融合的GluA2亞基和熒光蛋白dsRed2導(dǎo)入胎鼠的感覺皮質(zhì)2和3層的神經(jīng)元，再對(duì)10～12周小鼠進(jìn)行開顱手術(shù)后，然后利用雙光子成像對(duì)活體內(nèi)AMPA受體的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)［31］。研究發(fā)現(xiàn)，感覺刺激引起樹突棘和樹突干表面的AMPA受體的GluA1亞基熒光強(qiáng)度顯著增加，而樹突棘的大小只發(fā)生了輕微的變化。有趣的是，在接受感覺刺激后，樹突棘和樹突干表面GluA1亞基的熒光強(qiáng)度變化呈現(xiàn)正相關(guān)。該感覺刺激引起的樹突棘表面AMPA受體熒光強(qiáng)度的增加具有持久性和NMDA受體依賴性。以往的研究只能以樹突棘結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化作為衡量突觸可塑性的標(biāo)準(zhǔn)，然而只監(jiān)測(cè)樹突棘的更替，可能錯(cuò)過發(fā)生在穩(wěn)定樹突棘中的關(guān)鍵可塑性事件。在成年動(dòng)物中，發(fā)生在穩(wěn)定存在的樹突棘中的可塑性比樹突棘更替引起的可塑性可能更為普遍。活體內(nèi)AMPA受體的可視化開辟了一種嶄新的更加精確的研究突觸可塑性的方法。

3 展望

熒光標(biāo)記AMPA受體已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于觀察神經(jīng)元表面AMPA受體動(dòng)態(tài)變化。體外AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的成像加深了對(duì)突觸和突觸外受體轉(zhuǎn)運(yùn)的理解，而體內(nèi)AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)的可視化真正實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)突觸可塑性的實(shí)時(shí)觀測(cè)。藥理學(xué)或電刺激等易于操作的技術(shù)非常適用于AMPA受體轉(zhuǎn)運(yùn)和突觸可塑性更深層次的分子機(jī)制研究。除此之外，活體成像可實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠在學(xué)習(xí)任務(wù)中突觸變化的實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而提供突觸變化和相應(yīng)行為的直接聯(lián)系。在學(xué)習(xí)任務(wù)下研究小鼠體內(nèi)AMPA受體動(dòng)態(tài)、神經(jīng)元活性以及相關(guān)神經(jīng)環(huán)路的變化，將會(huì)有助于更深入地理解突觸可塑性以及大腦功能，同時(shí)也會(huì)對(duì)突觸功能異常導(dǎo)致多種認(rèn)知疾病的致病機(jī)制有更好的闡述。

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