高瓊瓊 蔣湘俐 黃純

肺癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，近年來成為我國(guó)癌癥死亡最主要的原因[1]。據(jù)國(guó)家癌癥中心2015年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：2006年-2011年我國(guó)肺癌5年患病率是130.2（1/10萬）。其中男性84.6（1/10萬），居惡性腫瘤第2位；女性45.6（1/10萬），居惡性腫瘤第4位[2]。其中非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）占肺癌患者的85%[3]。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，不足43%的NSCLC患者初診時(shí)為早期，并獲得根治性治療機(jī)會(huì)。然而，57%以上的NSCLC患者初診時(shí)即為晚期，已經(jīng)出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)于晚期NSCLC患者，除一線含鉑雙藥化療外，分子靶向治療越來越多的受到人們的關(guān)注。棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白-間變淋巴瘤激酶（echinoderm microtubule-associated protein-like 4 gene and the anaplastic lymphoma kinase gene, EML4-ALK）等分子亞型的出現(xiàn)，使得人們對(duì)NSCLC的發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)一步明確，而針對(duì)EML4-ALK致癌靶點(diǎn)的小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）-克唑替尼（crizotinib）等，因其具備良好的療效和安全性，已被批準(zhǔn)應(yīng)用于ALK陽(yáng)性晚期NSCLC患者的治療。對(duì)于ALK陽(yáng)性早期NSCLC患者，ALK-TKIs應(yīng)用必要性尚不明確，本文主要介紹ALK陽(yáng)性NSCLC患者的檢測(cè)進(jìn)展，ALK陽(yáng)性早期NSCLC患者的臨床病理特征、預(yù)后，評(píng)價(jià)ALK-TKIs在ALK陽(yáng)性早期NSCLC患者中的地位和意義。

1 EML4-ALK融合基因的發(fā)現(xiàn)

EML4-ALK是在2007年由Soda等[4]通過應(yīng)用酪氨酸激酶蛋白組學(xué)技術(shù)從一個(gè)肺腺癌患者腫瘤組織中篩選致癌基因時(shí)首次發(fā)現(xiàn)的。EML4屬于棘皮動(dòng)物微管蛋白相關(guān)類蛋白家族，由N端Basic區(qū)、HELP域和WD重復(fù)區(qū)構(gòu)成；ALK屬于胰島素受體超家族，由細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)組成。ALK蛋白通過活化下游的STAT3和MARK信號(hào)傳導(dǎo)通路及激活RAS/ERK、PI3K/AKT等多條其他的信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡。正是由于2號(hào)染色體短臂的微小倒置導(dǎo)致EML4 N端Basic區(qū)、HELP域和部分WD重復(fù)區(qū)在ALK胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生融合，形成EML4-ALK融合基因。融合基因的EML4部分均具有致癌活性，其中以Basic區(qū)致癌活性最高，這種致癌活性依賴于融合伴侶EML4和ALK的二聚作用對(duì)酪氨酸激酶的激活。EML4-ALK在體內(nèi)及體外均擁有強(qiáng)大的致癌活性[4,5]，這種致癌活性可以被針對(duì)ALK靶點(diǎn)的小分子TKIs有效阻斷[5,6]，這為EML4-ALK作為肺癌發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子提供了證據(jù)。EML4-ALK存在十余種融合基因亞型，最常見的融合亞型為E13:A20和E6a/b:A20，發(fā)生率分別為33%和29%[7,8]。當(dāng)然，在NSCLC中，除了EML4作為ALK的常見融合伴侶外，研究還相繼發(fā)現(xiàn)了其他的ALK融合伴侶，包括TFG[9]、KIF5B[10]、KLC1[11]、HIP1[12]、TPR[13]、SEC31A[14]等。

2 ALK融合基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

現(xiàn)在有3種不同的方式來檢測(cè)ALK融合基因的表達(dá)情況，分別是免疫組化（immunohistochemistry, IHC）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR）。在臨床上，F(xiàn)ISH和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)ALK融合基因已有相應(yīng)試劑盒通過美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）及國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration,CFDA）的認(rèn)證。2013年美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南也明確表示FISH可作為ALK融合基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，F(xiàn)ISH熒光信號(hào)消減迅速，難以測(cè)定腫瘤整體形態(tài)學(xué)及腫瘤異質(zhì)性，且價(jià)格昂貴[15]；RT-PCR對(duì)引物要求較高，需要較多RNA及石蠟組織樣本易降解[16]等因素，使得FISH和RT-PCR技術(shù)不易普及。相比而言，IHC便宜、高效、快速，因而被廣泛應(yīng)用于常規(guī)的病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。然而，IHC的實(shí)驗(yàn)操作和結(jié)果評(píng)價(jià)存在一定的主觀性，且IHC檢測(cè)質(zhì)量很大程度上取決于抗體的質(zhì)量，但目前已開發(fā)的商業(yè)化EML4-ALK抗體的特異性及敏感性不夠高，低表達(dá)的EML4-ALK融合蛋白往往被漏檢[17]。所以開發(fā)高特異性及高敏感性的抗體至關(guān)重要。Pyo等[18]在IHC篩查ALK重排的系統(tǒng)回顧和meta分析中指出：IHC的敏感性和特異性分別為92%和91%。劉暢等[19]在免疫組化法檢測(cè)EML4-ALK融合突變價(jià)值的meta分析中得出特異性抗體IHC法檢測(cè)EML4-ALK融合基因的方法可行，具有高特異度和敏感度，可作為一種簡(jiǎn)單快速的篩查方法，具有臨床應(yīng)用價(jià)值。而針對(duì)4種不同的ALK抗體D5F3（ventana）、D5F3（CST）、1A4/1H7（OriGene Tech）和5A4（Abcam）其敏感性分別為93.8%、84.4%、93.8%和56.3%，其特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值均為100%[20]。尤其是新研發(fā)的單克隆抗體D5F3（ventana）大大提高了檢測(cè)的特異性和敏感性[20,21]，甚至有研究[22]認(rèn)為其可以作為有明確染色模式下的ALK融合基因的獨(dú)立檢測(cè)手段。最近，羅氏公司推出的用于識(shí)別肺癌患者EML4-ALK融合蛋白表達(dá)的首款全自動(dòng)VENTANA ALK（D5F3）IHC檢測(cè)試劑盒獲得FDA及CFDA認(rèn)證，研究表明，該方法檢測(cè)EML4-ALK融合蛋白的特異性和敏感性分別為98%和100%[23]，金貽鐸等[24]研究指出相較于RT-PCR，手工IHC檢測(cè)EML4-ALK融合蛋白的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為82.4%、95.1%、73.7%和97%，二者的總體符合率為93.3%，VENTANA IHC檢測(cè)EML4-ALK融合蛋白的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93.3%、100%、100%和99.1%，二者的總體符合率為99.1%。VENTANA IHC相較于手工IHC具備更高的特異性和敏感性，且該方法已被批準(zhǔn)用于篩選適合服用輝瑞制藥有限公司的克唑替尼的患者，這極大肯定了IHC在ALK檢測(cè)中的地位和作用。

3 ALK融合基因陽(yáng)性患者的臨床病理特征

因檢測(cè)方法、檢測(cè)人群不同，A LK融合基因在NSCLC患者中的陽(yáng)性率為1.4%-13%[25-28]，且在IV期出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的NSCLC患者中，ALK融合基因的陽(yáng)性率比較高。有研究指出晚期NSCLC患者ALK融合基因的陽(yáng)性率為8.7%-9.0%[29,30]，而在早期NSCLC患者中的陽(yáng)性率僅為2.4%-8.6%[31-35]，明顯低于晚期患者。這點(diǎn)和Zhao等[36]在關(guān)于ALK融合基因臨床特征的meta分析中得出的結(jié)論是一致的，他指出ALK融合基因在III期-IV期的NSCLC患者中的檢出率高于I期-II期患者，即ALK融合基因在晚期NSCLC患者的陽(yáng)性率高于早期NSCLC患者。關(guān)于早期和晚期ALK融合基因陽(yáng)性患者的臨床病理特征普遍達(dá)成共識(shí)，即：年輕、不吸煙或少量吸煙、富含印戒細(xì)胞或?qū)嶓w成分的腺癌、EGFR或KRAS突變野生型的NSCLC[25-35]。有研究指出ALK融合基因在EGFR或KRAS突變陰性的NSCLC患者中的陽(yáng)性率高達(dá)25.7%-34%[25,32,37]。

4 ALK融合基因?qū)υ缙贜SCLC患者預(yù)后的影響

一直以來，關(guān)于ALK融合基因表達(dá)情況是否影響早期NSCLC患者的預(yù)后尚存有一些爭(zhēng)議。韓國(guó)Paik等[31]回顧性研究了接受根治性手術(shù)治療的早期NSCLC中ALK陽(yáng)性患者的臨床病理特征和預(yù)后情況，研究指出，運(yùn)用FISH技術(shù)對(duì)735例患者手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行ALK融合基因檢測(cè)，其中ALK陽(yáng)性患者28例（3.8%），ALK陽(yáng)性率在腺癌、女性、不吸煙患者中明顯升高，分別為6.8%、7.6%和8.9%；ALK陽(yáng)性患者中位年齡55歲，明顯低于ALK陰性患者（P＜0.001）；中位隨訪時(shí)間41.6個(gè)月時(shí)，ALK陽(yáng)性患者與ALK陰性患者的總生存（overall survival, OS）分別為97.7個(gè)月 vs 78.9個(gè)月（P=0.10），無病生存期（disease-free survival, DFS）分別為76.4個(gè)月 vs 71.3個(gè)月（P=0.66），ALK陽(yáng)性患者與ALK陰性患者的DFS及OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALK融合基因并非是影響患者DFS和OS的預(yù)后因素。研究還發(fā)現(xiàn)ALK陽(yáng)性患者T分期級(jí)別較陰性患者低，且主要集中在T1期（P=0.02），但在腺癌患者中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移級(jí)別較陰性患者高，這說明了ALK陽(yáng)性患者具備原發(fā)腫瘤雖小但易出現(xiàn)早期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)特的生物學(xué)特征，也進(jìn)一步解釋了晚期NSCLC患者ALK陽(yáng)性率較早期患者高的原因。而來自韓國(guó)的另外一項(xiàng)研究[32]同樣指出，ALK陽(yáng)性患者的T分期級(jí)別較陰性者低，但未指出兩組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的不同。該研究還發(fā)現(xiàn)，在納入研究的162例接受根治性手術(shù)治療的早期不吸煙肺腺癌患者中，ALK陽(yáng)性患者14例（8.6%）；中位隨訪時(shí)間40.8個(gè)月，ALK陽(yáng)性患者與ALK陰性患者的OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但ALK陽(yáng)性患者DFS更短（P=0.022），提示ALK陽(yáng)性患者更易出現(xiàn)術(shù)后疾病的復(fù)發(fā)。泰國(guó)Tantraworasin等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在267例接受根治性手術(shù)的NSCLC患者中，ALK陽(yáng)性更易出現(xiàn)在年齡小于55歲、存在臟胸膜受侵犯、有肺癌家族史的NSCLC患者中，且ALK陽(yáng)性患者更易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)；該研究指出ALK融合基因并非是影響DFS和OS的預(yù)后因素，這一點(diǎn)和Paik等[31]的研究結(jié)果是一致的。然而韓國(guó)Kim等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在119例接受根治性手術(shù)治療的早期NSCLC患者中，ALK陽(yáng)性患者和ALK陰性患者的RFS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即ALK陽(yáng)性和腫瘤復(fù)發(fā)無關(guān)；另外該研究還指出ALK陽(yáng)性患者OS更短，說明ALK陽(yáng)性可能是早期NSCLC患者的預(yù)后不良的因素。張夢(mèng)雪等[38]研究指出：在95例早期NSCLC患者中，ALK陽(yáng)性患者OS更長(zhǎng)，預(yù)后更好。Blackhall等[33]的關(guān)于歐洲人群的研究顯示，在1,281例接受根治性手術(shù)切除的肺腺癌患者中，ALK陽(yáng)性患者較ALK陰性患者OS更長(zhǎng)，即ALK陽(yáng)性患者較ALK陰性患者預(yù)后好。

為了進(jìn)一步分析造成不同結(jié)論的原因，有研究者將早期NSCLC按照病理或臨床分期分成不同的亞組來研究。Ohba等[35]指出，在256例病理分期為I期的日本肺腺癌患者中，ALK融合基因并非是影響肺腺癌患者DFS和OS的預(yù)后因素。Zhou等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，在488例中國(guó)NSCLC患者中，165例為IIIa期，僅在IIIa期NSCLC患者中，ALK陽(yáng)性者較ALK陰性者DFS更短，其他分期組ALK陽(yáng)性和陰性者的DFS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

分析以上資料，我們發(fā)現(xiàn)：ALK陽(yáng)性對(duì)亞裔人群預(yù)后的影響各不相同。這種差異很可能是受回顧性研究的限制、隨訪時(shí)間短、樣本量較小、檢測(cè)技術(shù)等混雜因素的影響，而比較歐美和亞裔人群的研究結(jié)果提示我們ALK陽(yáng)性對(duì)不同種族人群預(yù)后的影響可能不同。

ALK融合基因?qū)ν砥贜SCLC患者預(yù)后的影響現(xiàn)已比較明確。研究指出ALK陽(yáng)性患者和ALK陰性患者對(duì)含鉑化療方案的敏感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，ALK陽(yáng)性患者和ALK陰性患者DFS和OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[25,30,39]。而Yang等[39]的研究進(jìn)一步指出，ALK陽(yáng)性者較ALK陰性者有著更短的DFS，但OS無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；ALK陽(yáng)性肺腺癌患者在被確診后的5年內(nèi)，疾病的進(jìn)展和復(fù)發(fā)率是ALK陰性患者的2倍。對(duì)晚期NSCLC患者而言，ALK融合基因并非影響預(yù)后的因素，ALK陽(yáng)性患者更易出現(xiàn)疾病的進(jìn)展。

5 ALK抑制劑

克唑替尼（crizotinib）是2005年合成的一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性TKI，具有抗ALK活性的脫靶效應(yīng)，可作為小分子ATP模擬化合物與ATP靶位結(jié)合，從而阻滯了ALK下游信號(hào)通路的激活，進(jìn)一步阻滯腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲[40]。III期臨床試驗(yàn)PROFILE1014[41]結(jié)果顯示：克唑替尼作為一線用藥對(duì)于延長(zhǎng)ALK陽(yáng)性晚期NSCLC患者的無進(jìn)展生存期的療效要優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)化療。盡管ALK陽(yáng)性晚期NSCLC患者可以從克唑替尼中獲益，但與EGFR-TKIs一樣，大多數(shù)患者在獲得8個(gè)月-10個(gè)月的腫瘤控制后，最終會(huì)發(fā)展成獲得性耐藥。耐藥機(jī)制主要包括ALK激酶區(qū)二次突變、ALK融合基因擴(kuò)增、旁路激活途徑等。多項(xiàng)研究對(duì)解決克唑替尼耐藥問題進(jìn)行了探索，Ou等[42]研究表明：服用克唑替尼患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展后繼續(xù)用藥比停止服藥獲益明顯。第2代ALK抑制劑由于其在結(jié)構(gòu)上與克唑替尼差異明顯，不僅對(duì)克唑替尼敏感的ALK陽(yáng)性晚期NSCLC患者有效，而且對(duì)克唑替尼耐藥患者更是表現(xiàn)出強(qiáng)大的療效。目前經(jīng)FDA批準(zhǔn)上市的有Ceritinib，正在進(jìn)行臨床研究的藥物有Alectinib、AP26113。Ceritinib能抑制ALK自身磷酸化和ALK介導(dǎo)下游信號(hào)蛋白（STAT3）的磷酸化，F(xiàn)riboulet等[43]研究指出：Ceritinib對(duì)L1196M、G1269A、S1206Y、I1171T等ALK激酶區(qū)突變引起的耐藥具有顯著活性；Alectinib在體外化合物篩選時(shí)具有很強(qiáng)的ALK抑制活性，Kodama等[44]研究發(fā)現(xiàn)：Alectinib可以對(duì)已知的大多數(shù)ALK耐藥類型有效；AP26113是ALK、EGFR雙重抑制劑，對(duì)絕大部分ALK耐藥療效顯著，Viala等[45]發(fā)現(xiàn)AP26113等可有效解決L1196M突變引起的耐藥問題。另外，HSP90抑制劑可以下調(diào)ALK融合蛋白的表達(dá)水平，對(duì)ALK陽(yáng)性的未經(jīng)克唑替尼處理或?qū)诉蛱婺崮退幍募?xì)胞均具有良好的活性，相關(guān)研究已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[46]。

6 小結(jié)

EML4-ALK融合基因是肺癌的重要分子亞型，由于2號(hào)染色體短臂的微小倒置導(dǎo)致EML4N端Basic區(qū)、HELP域和部分WD重復(fù)區(qū)在ALK胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)發(fā)生融合，EML4-ALK存在十余種融合基因亞型，除了EML4作為ALK的常見融合伴侶外，研究還相繼發(fā)現(xiàn)了其他至少6種ALK融合伴侶。綜合IHC、FISH和RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，IHC的應(yīng)用更為重要和普及，尤其是全自動(dòng)VENTANA ALK（D5F3）IHC檢測(cè)試劑盒的獲批，極大肯定了IHC在ALK檢測(cè)中的地位和作用。EML4-ALK融合基因多見于年輕、不吸煙或少量吸煙、富含印戒細(xì)胞或?qū)嵭孕拖侔?、EGFR或KRAS突變野生型的NSCLC患者，且早期NSCLC患者中EML4-ALK融合基因的檢出率低于晚期患者。克唑替尼等ALK-TKIs在晚期ALK陽(yáng)性NSCLC患者中的治療作用已得到廣泛認(rèn)可，但目前缺乏資料證明ALK-TKIs可使早期ALK陽(yáng)性NSCLC患者受益，這或許是因?yàn)锳LK融合基因?qū)υ缙贜SCLC患者預(yù)后的影響尚不明確。本文對(duì)有限的早期資料進(jìn)行了總結(jié)，多數(shù)研究證明ALK融合基因和NSCLC患者的預(yù)后無關(guān)，僅Kim等[26]的研究指出ALK陽(yáng)性早期NSCLC患者預(yù)后不良，為了進(jìn)一步明確這一問題，我們收集了1,108例多中心的早期NSCLC患者的標(biāo)本和臨床資料進(jìn)行分析，目前尚在進(jìn)行中，期待能得出有臨床指導(dǎo)意義的結(jié)果。