吳中華，徐 曼，馮清雪，雷桂蘭

(1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃州 438000；3.黃岡師范學(xué)院 大別山特色資源協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000)

黃州近郊兩地菜粉蝶酯酶多態(tài)性分析

吳中華1,2,3，徐 曼1，馮清雪1，雷桂蘭1,2,3

(1.黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃州 438000；2.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃州 438000；3.黃岡師范學(xué)院 大別山特色資源協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 黃州 438000)

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對黃州近郊長祈廖(CQL)和萬福(WF)兩蔬菜種植地的菜粉蝶的酯酶同工酶進(jìn)行研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：兩地菜粉蝶成蟲酯酶酶譜分三個(gè)電泳酶帶區(qū)，共顯示了23條酶帶； CQL種群多態(tài)性酶帶21條，多態(tài)性比例為91.3%；WF種群多態(tài)性酶帶19個(gè)，多態(tài)性比例82.6%；兩種群非多態(tài)性酶帶Rm值和出現(xiàn)頻率不相同。研究表明黃州近郊兩地菜粉蝶種群酯酶多態(tài)性存在差異，推測它們遺傳多樣性可能存在差異。該研究結(jié)果對黃州近郊菜青蟲治理有指導(dǎo)作用。

菜粉蝶；酯酶同工酶；代謝抗性

菜粉蝶[Pierisrapae(linnaeus)]為鱗翅目、粉蝶科昆蟲，又名菜白蛾、白粉蝶等，幼蟲叫菜青蟲。菜青蟲是危害農(nóng)作物的主要蟲態(tài)，廣布于全國，是危害白菜、甘藍(lán)等十字花科植物的嚴(yán)重普發(fā)性害蟲，在春夏秋三季往往給菜農(nóng)帶來較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。為治理菜青蟲，農(nóng)民曾大量使用低毒的有機(jī)磷殺蟲劑殺蟲。近年來，國家明令禁止蔬菜上噴施有機(jī)磷農(nóng)藥，農(nóng)民轉(zhuǎn)而大量使用擬除蟲菊酯治蟲?；瘜W(xué)殺蟲劑的大量使用，導(dǎo)致害蟲抗性逐年增加，抗性機(jī)理主要涉及由解毒酶的代謝能力增強(qiáng)而引起的代謝抗性以及由殺蟲劑作用靶標(biāo)部位敏感性降低而引起的靶標(biāo)抗性，主要集中于對代謝抗性的分子機(jī)理，包括在抗性昆蟲中與三大解毒酶系：細(xì)胞色素P450單加氧酶(P450s)、酯酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)相關(guān)的基因擴(kuò)增，過量表達(dá)和基因突變有關(guān)[3-5]。

黃州區(qū)是黃岡市市府所在地，市區(qū)東南和西北兩端近郊分布有供應(yīng)本市蔬菜的種植基地，為了解黃州近郊菜青蟲對化學(xué)農(nóng)藥抗性，擬開展菜粉蝶酯酶多態(tài)性研究，旨在為黃州近郊蔬菜基地菜青蟲治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

實(shí)驗(yàn)用菜粉蝶成蟲分別采集黃州區(qū)東湖辦事處長祈廖社區(qū)(簡稱長祈廖種群，CQL)和禹王辦事處萬福村(簡稱萬福種群，WF)，活的菜粉蝶成蟲樣本置-20℃冰箱保存。

1.2 化學(xué)試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用化學(xué)試劑乙酸-α-萘酯(AR)、乙酸-β-萘酯(AR)、三羥甲基氨基甲烷(CP)，丙烯酰胺(AR) 甲叉雙丙烯酰胺(AR) 四甲基乙二胺(AR)，甘氨酸(AR)、固藍(lán)B(生化試劑，進(jìn)口分裝)等均由武漢科瑞生物技術(shù)有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)儀器：DYY-12C型電腦三恒多用電泳儀，由北京六一儀器廠生產(chǎn)。

1.3 方法[5-8]

1.3.1 電泳方法

采用高pH不連續(xù)凝膠系統(tǒng)，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.5% , pH= 6.7,分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，電極緩沖液為Tris-Gly，pH= 8.3。

1.3.2 點(diǎn)樣及電泳

以個(gè)體為單位，取成蟲腹部加0.2 mL樣品提取液(0.1 mol·L-1Tris·HCL, TritonX-100質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1%，pH7.0) ，冰浴研磨, 在4℃，10 000rpm下，離心10 min，取上清液備用，每個(gè)樣本取成蟲個(gè)數(shù)約26個(gè)。濃縮膠電壓90 V ，待指示劑進(jìn)入分離膠后，調(diào)電壓至110 V ,電泳約6 h。

1.3.3 染色

取 2%乙酸-α-萘酯、2%乙酸-β-萘酯各1 mL于小燒杯中混合，然后加入40 mg固藍(lán)B溶解，加入40 mL 磷酸-F-緩沖液混勻倒入裝有聚丙烯酰胺凝膠膠片的瓷盤中，室溫下置于搖床上孵育直至顯出清晰的酯酶特征條帶，倒掉顯色液，用清水沖洗，然后加入適量的固定液過夜，拍照保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

采用聚丙酰胺凝膠電泳法分別檢測了黃州近郊長祈廖種群(CQL)和萬福種群(WF)菜粉蝶酯酶多態(tài)性，CQL和WF種群酯酶分析成蟲各26只，兩種群酯酶酶譜見圖1、2，酯酶多態(tài)性數(shù)據(jù)見表1、2。

從圖1、2可以看出，菜粉蝶成蟲酯酶按照分子量大小，大約分三個(gè)電泳酶帶區(qū)，分別是EST-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ區(qū)，依據(jù)酶譜酶帶遷移率(Rm)一共顯示了23條酶帶，酶帶遷移率見表1、2。從圖上還可以看出Ⅱ和Ⅲ區(qū)的酶帶豐富度高于Ⅰ區(qū)，Ⅱ和Ⅲ區(qū)酶帶染色深說明酶活也高于Ⅰ區(qū)或酯酶過量表達(dá)。CQL種群電泳共獲得144條酶帶，WF種群電泳共獲得148條酶帶，單個(gè)成蟲顯示2～9條酶帶，平均5～6條酶帶(表3)；CQL種群超過6條酶帶的個(gè)體6只，占23%，若將酶帶出現(xiàn)頻率<50%定為多態(tài)性酶帶，CQL種群多態(tài)性酶帶21條，多態(tài)性比例為91.3%，非多態(tài)性酶帶Rm值是：0.2和0.47，出現(xiàn)頻率分別是57.7%與50%；WF種群超過6條酶帶的個(gè)體8只，有三個(gè)個(gè)體酶帶為9條，占31%，多態(tài)性酶帶19條，多態(tài)性比例82.6%，非多態(tài)性酶帶Rm值是：0.025、0.23、0.25和0.44，出現(xiàn)頻率分別是57.7%、57.7%、73.1%和50%。對兩個(gè)種群酯酶多態(tài)性分析結(jié)果顯示，種群間高酶帶數(shù)量個(gè)體、多態(tài)性酶帶比例、非多態(tài)性酶帶位點(diǎn)數(shù)及Rm存在差異，說明黃州近郊菜粉蝶種群酯酶多態(tài)性存在差異，推測它們遺傳多態(tài)性可能存在差異。

圖1 長祈廖種群成蟲酯酶電泳染色結(jié)果

酶帶EST-Ⅰ區(qū)EST-Ⅱ區(qū)12345678910111213遷移率/%0．0250．040．070．080．10．120．140．160．180．20．230．250．28CQL頻率/%2319．27．73．815．43．8232346．257．738．534．63．8WF頻率/%57．7-7．711．53．87．73．811．515．434．657．773．126．9

表2 菜粉蝶成蟲酯酶同工酶酶帶出現(xiàn)頻率(EST-Ⅲ區(qū))

表3 菜粉蝶成蟲酯酶同工酶酶帶數(shù)量

圖2 萬福種群成蟲酯酶電泳染色結(jié)果

3 討論

酯酶(esterase)是催化酯鍵水解的一大類酶的總稱，廣泛存在于動物、植物和微生物中。許多酯酶都是由多基因家族編碼的，在物種和亞種之間酯酶同工酶存在差異，因此是進(jìn)化關(guān)系分析和品種鑒定的重要靶酶。郭曉霞等(2002年)[8]對菜粉蝶不同發(fā)育期酯酶同工酶的比較研究，檢測出酯酶酶帶21條，按Rm值將酶帶分為三個(gè)區(qū)，各發(fā)育期酶譜具有一定相似相異性，說明菜粉蝶基因表達(dá)與不同時(shí)期食性有關(guān)。比對郭曉霞等研究結(jié)果，筆者認(rèn)為黃州近郊兩地菜粉蝶酯酶酶譜與其具有一致性，但成蟲的酶帶數(shù)量和分區(qū)存在差異，說明兩地種群遺傳背景不同。造成黃州近郊兩種群酯酶多態(tài)性變化的原因，可能是所處環(huán)境差異不同影響的結(jié)果。許多文獻(xiàn)報(bào)道[3-5]水解羧酸酯鍵、磷酸酯鍵的酯酶在有機(jī)磷和擬除蟲菊酯等殺蟲劑的代謝中起著重要作用，在抗性機(jī)理中具有雙重作用，即通過結(jié)合和/或水解殺蟲劑發(fā)揮解毒作用。在抗性昆蟲中，酯酶的活性提高主要是酯酶基因擴(kuò)增使得表達(dá)量的增加或活性并不提高但催化效率提高所引起。對黃州近郊兩地CQL和WF種群酯酶電泳結(jié)果進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，兩種群的EST-Ⅱ區(qū)、EST-Ⅲ區(qū)酶帶數(shù)量、酶活大小基本呈一致性，成蟲高酶活酶帶數(shù)量多，說明兩種群成蟲個(gè)體對化學(xué)殺蟲劑具有高抗性；但種群間高酶活酶帶的個(gè)體數(shù)量和Rm有差異，說明兩地環(huán)境不同如使用化學(xué)農(nóng)藥的種類和頻率有差異，導(dǎo)致其酯酶遺傳多樣性不同；雖然，長祈廖和萬福地理距離僅僅十幾公里，兩種群間成蟲會通過遷飛交流，但這種交流被城市所阻隔，這也是造成酯酶多樣性的另一原因?？偠灾?，黃州近郊菜粉蝶對化學(xué)農(nóng)藥具有一定的抗藥性，在害蟲治理上建議使用低毒的、混配的農(nóng)藥，盡量多使用生物農(nóng)藥，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，讓當(dāng)?shù)厥忻癯陨戏判牡氖卟恕?/p>

[1] 陳曉寧,仝怡.菜粉蝶研究綜述[J].自然科學(xué),2010,1:4-5.

[2] 黃逸釵.菜青蟲綜合防治技術(shù)[J].福建農(nóng)業(yè)科技,2012,Z1:90-91.

[3] 周斌芬,唐振華,高菊芳.昆蟲代謝抗性研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥,2008,47(5):313-315,323.

[4] 王志超,康志嬌,史雪巖,等.有機(jī)磷殺蟲劑代謝機(jī)制研究進(jìn)展[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào),2015,17(1):1-14.

[5] 吳中華,燕帥國,林立豐,等.不同地理種群尖音庫蚊復(fù)組抗性動態(tài)和遺傳多樣性[J]. 昆蟲學(xué)報(bào),2009,52(05):522-530.

[6] 胡能書,萬賢國.同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M].長沙:湖南科技出版社,1985,l-135.

[7] 孫玉梅,王敦清.蜣螨酯酶同工酶的比較研究[J].昆蟲學(xué)報(bào),1988,31(4):401-406.

[8] 郭曉霞,鄭哲民.菜粉蝶不同發(fā)育期酯酶同工酶的比較研究[J].昆蟲學(xué)報(bào),2002,45(3):401-403.

責(zé)任編輯 喻曉敏

A study on esterase isozymes of two population Pieris rapae in the suburbs of Huangzhou

WU Zhong-hua1,2,3, XU Man1, FENG Qing-xue1, LEI Gui-lan1,2,3

(1.College of life science, Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China;2.Hubei Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization,Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China 3.Hubei Collaborative Innovation Center for the Characteristic Resources Exploitation of Dabie Mountains，Huanggang Normal University，Huangzhou 438000，Hubei, China)

The polyacrylamide gel electrophoresis technology was used to study the esterase isoenzyme ofPierisrapaebetween two different vegetable planting area, Changqiliao(CQL)and Wanfu(WF), which were both in the suburbs of Huangzhou. The results showed that there were totally 23 bands distributed in three electrophoresis bands area from the esterase pattern of two populationPierisrapae. 21 and 19 esterase bands were found in population CQL and WF, from which the ratios of polymorphism were 91.3% and 82.6% respectively. In addition, the RM value and occurrence frequency of non-polymorphism esterase bands in two population were different. We estimate that the genetic diversity may exist in those two populationPierisrapae. Our study can provide important guidance for the prevention and control of Pieris rapae in the suburbs of Huangzhou.

Pierisrapae; esterase isozymes; metabolic resistance

Q38

A

1003-8078(2016)06-0034-03

2016-10-30 doi 10.3969/j.issn.1003-8078.2016.06.10

吳中華,男,湖北黃州人，教授,主要研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)害蟲抗性遺傳與治理。

雷桂蘭,女,湖北黃州人，高級實(shí)驗(yàn)師,主要研究方向?yàn)閯游镞z傳學(xué)。

湖北省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目(2012001402);黃岡師范學(xué)院科學(xué)研究項(xiàng)目(06ca22)。