林曉影，楊炳友，何婭雯，劉艷，韓偉，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

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接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠血液流變學(xué)的影響

林曉影，楊炳友，何婭雯，劉艷，韓偉，匡海學(xué)*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠血液流變學(xué)的影響，確定接骨木根皮促進(jìn)活血化瘀作用的有效組分。方法：將Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，陽性藥跌打丸組，有效部位高、中、低劑量組，環(huán)烯醚萜高、中、低劑量組和木脂素高、中、低劑量組。采用大鼠股骨完全開放型骨折模型，觀察各組在給藥2、4和8周后，血液流變學(xué)指標(biāo)(全血黏度、血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù))的變化。結(jié)果：接骨木根皮有效部位、環(huán)烯醚萜組分和木脂素組分均有不同程度的抑制大鼠骨折后的血液流變學(xué)指標(biāo)升高的作用，且木脂素組分作用較明顯。結(jié)論：接骨木根皮促進(jìn)骨折大鼠活血化瘀作用的有效組分是木脂素組分。

忍冬科；木脂素；環(huán)烯醚萜；骨折；血液流變學(xué)

接骨木[SambucuswilliamsiiHance(SWH)]為忍冬科植物，又名續(xù)骨木、大接骨丹等，其根皮作為民間用藥歷史較長，具有治療跌打腫痛、骨折、創(chuàng)傷出血等功效。臨床觀察表明，接骨木治療骨折具有療程短、恢復(fù)功能快、療效高的特點(diǎn)[1-2]。前期研究已經(jīng)確定接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合的有效部位為50%乙醇洗脫部位[3-7]，并將其拆分成環(huán)烯醚萜組分和木脂素組分[8]。為了考察接骨木根皮有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠活血化瘀的作用，并確定其有效組分，本文采用Sprague-Dawley大鼠開放型股骨完全骨折模型，初步探討接骨木根皮有效部位和有效組分的對(duì)骨折大鼠血液流變學(xué)的影響，為接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制研究提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常健康SD大白鼠(合格證號(hào)：SCSK黑2012005)，雌雄各半，體質(zhì)量190～210 g，室內(nèi)溫度20～25℃，相對(duì)濕度40～70%，12 h循環(huán)照明。

1.2 儀器和試劑

2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；冷凍干燥機(jī)Christ LDplus(北京思達(dá)興業(yè)儀器有限公司)；血液流變分析儀(BH-YDA-III，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司)；AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)；Sephadex LH-20型葡聚糖凝膠色譜(Pharmacia公司)。

1.3 藥品

接骨木藥材采自哈爾濱市方正縣，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室蘇連杰教授鑒定為忍冬科接骨木屬植物接骨木干燥的根皮，樣品保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(2011079)。

2 方法

2.1 接骨木根皮有效部位和有效組分的制備

將干燥的接骨木根皮20 kg，用15倍量95%乙醇熱回流提取2次，每次2 h，過濾，合并乙醇提取液，減壓回收溶劑，得到乙醇提取物(1.05 kg)。濃縮液(755 g)進(jìn)行AB-8大孔吸附樹脂柱色譜，用20倍樹脂床體積的蒸餾水洗去糖等水溶性雜質(zhì)，繼之用50% EtOH、95% EtOH依次洗脫。50% EtOH洗脫液為接骨木根皮促進(jìn)骨折愈合有效部位，經(jīng)減壓回收溶劑得到298 g。

取一定量的接骨木根皮50%乙醇洗脫部位，進(jìn)行Sephadex LH-20凝膠柱色譜，依次分別用7倍柱體積的水和3倍柱體積的甲醇洗脫，分別得到各自洗脫物。水洗脫液和甲醇洗脫液經(jīng)減壓回收，冷凍干燥，獲得水洗脫組分和甲醇洗脫組分。經(jīng)前期研究將水洗脫組分確定為環(huán)烯醚萜組分，甲醇洗脫組分確定為木脂素組分。

2.2 SD大鼠開放型股骨完全骨折模型

使用克氏針法制作Sprague-Dawley大鼠開放型股骨完全骨折模型。大鼠在適應(yīng)環(huán)境1周后，進(jìn)行骨折手術(shù)。腹腔注射10%水合氯醛(3.0 mL/kg) 麻醉后，用手術(shù)刀切開右后腿皮毛，撥開肌肉直達(dá)股骨，用線鋸在股骨中部鋸斷，用1.1 mm克氏針從髓內(nèi)插入，使骨折斷端對(duì)接完好，切斷兩頭多余的克氏針，縫合傷口。整個(gè)手術(shù)過程在無菌條件下進(jìn)行。手術(shù)后開始的第2天，每天肌內(nèi)注射4×104U /kg青霉素鈉7天，避免手術(shù)后傷口感染。

2.3 分組及給藥方法

健康SD大白鼠，體質(zhì)量190～210 g，雌雄各半，隨機(jī)分為9組，每組10只。分別設(shè)：假手術(shù)組，模型組，陽性藥組：跌打丸(0.52 g/kg)，有效部位高(0.68 g/kg)、中(0.34 g/kg)、低(0.17 g/kg)劑量組，環(huán)烯醚萜高(0.58 g/kg)、中(0.29 g/kg)、低(0.15 g/kg)劑量組，木脂素高(0.1 g/kg)、中(0.05 g/kg)、低(0.025 g/kg)劑量組。

2.4 血液流變學(xué)的檢測(cè)

分別于藥后2、4、8周，每組大鼠頸總動(dòng)脈取血，離心取血清，-40℃保存，用血液流變分析儀進(jìn)行血液流變學(xué)指標(biāo)(全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù))的測(cè)定。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 接骨木根皮有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠的全血黏度的影響

全血黏度的升高會(huì)引起血流阻力增加，使血流速度減慢，最后導(dǎo)致血流停滯，直接影響臟器的血液供應(yīng)。全血黏度的結(jié)果如Fig.1，骨折發(fā)生后的2、4和8周，即骨折愈合的初、中和末期，模型組大鼠與假手術(shù)組比較，全血黏度水平有所升高(P<0.05，P<0.01)，說明大鼠骨折后血液流動(dòng)變慢；加藥組大鼠在骨折愈合的各個(gè)時(shí)期，同模型組比較，接骨木根皮有效部位高劑量組和木脂素高劑量組大鼠的全血黏度有下降趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而環(huán)烯醚萜組大鼠的全血黏度的下降作用沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示接骨木根皮降低骨折大鼠全血黏度的有效組分是木脂素組分。

Fig.1 The effects of rbSWH on whole blood viscosity of fracture rats

3.2 接骨木根皮有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠的血漿黏度的影響

血漿黏度是影響全血黏度的重要因素之一，血漿黏度升高全血黏度必然升高。血漿黏度的結(jié)果如圖Fig.2，在骨折發(fā)生后各個(gè)時(shí)期，模型組大鼠與假手術(shù)組比較，血漿黏度水平有所升高(P<0.05)；加藥組大鼠在骨折愈合的早期和末期，同模型組比較，接骨木根皮有效部位高、中劑量組和木脂素高劑量組大鼠的血漿黏度水平有下降趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在骨折愈合的中期，也有下降作用，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；環(huán)烯醚萜高劑量組大鼠在骨折愈合初期，血漿黏度的下降作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在中、末期不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示接骨木根皮降低骨折大鼠全血黏度的有效組分是木脂素組分。

Fig.2 The effects of rbSWH on plasma viscosity of fracture rats

3.3 接骨木根皮有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠的紅細(xì)胞聚集指數(shù)的影響

紅細(xì)胞聚集指數(shù)的增高可能導(dǎo)致血液黏度的增高。紅細(xì)胞聚集指數(shù)的結(jié)果如圖Fig.3，在骨折發(fā)生后的各個(gè)時(shí)期，模型組大鼠與假手術(shù)組比較，紅細(xì)胞聚集指數(shù)水平有所升高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在骨折愈合的早期和末期，同模型組比較，接骨木根皮有效部位高劑量組和木脂素高劑量組大鼠的紅細(xì)胞聚集指數(shù)水平有下降趨勢(shì)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在骨折愈合的中期，也下降作用，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；環(huán)烯醚萜組大鼠在骨折愈合的初期，紅細(xì)胞聚集指數(shù)的下降作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而中、末期下降作用沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示接骨木根皮降低骨折大鼠紅細(xì)胞聚集指數(shù)的有效組分是木脂素組分。

Fig.3 The effects of rbSWH on erythrocyte aggregation index of fracture rats

4 討論

骨折后局部會(huì)有不同程度的出血，使血液流動(dòng)發(fā)生應(yīng)激性變化，致氣血瘀滯[9-10]。骨折后的瘀血程度可以用血液流變學(xué)指標(biāo)來反映，表現(xiàn)為全血黏度、血漿黏度及紅細(xì)胞的聚集指數(shù)等指標(biāo)的升高。本文通過采用骨折大鼠股骨完全開放型骨折模型，研究接骨木根皮有效部位和有效組分對(duì)骨折大鼠血液流變學(xué)的指標(biāo)

的作用，發(fā)現(xiàn)大鼠在骨折后，在骨折愈合初、中、末期，血液流變學(xué)指標(biāo)有所升高，但均在正常的范圍內(nèi)波動(dòng)，在給骨折大鼠接骨木根皮有效部位和有效組分后，在骨折愈合的各個(gè)時(shí)期，骨折大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)均有下降的趨勢(shì)，且骨折愈合的初期比中、末期明顯，木脂素組分比環(huán)烯醚萜組分明顯。提示接骨木根皮促進(jìn)骨折大鼠活血化瘀作用的有效組分是木脂素組分。

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國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81173501)；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目計(jì)劃(No.2014AB3AS045)

林曉影(1988-)，女，博士研究生，主要研究方向：中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究。

匡海學(xué)*(1955-)，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥性味理論研究，中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制研究。

2016-01-27

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0055-02

修回日期：2016-02-01