梁瑞峰，宋獻美，王守富，盧吉鋒

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州 451191；3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004)

?

實 驗 研 究

冠心止痛膠囊含藥血清內(nèi)皮保護作用與體內(nèi)給藥時效關(guān)系研究

梁瑞峰1，宋獻美2，王守富3*，盧吉鋒1

(1.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004；2.河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 鄭州 451191；3.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004)

目的：觀察冠心止痛膠囊含藥血清對過氧化氫(H2O2)損傷內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用與體內(nèi)給藥的時效關(guān)系。方法：建立體外培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞H2O2氧化損傷模型，以冠心止痛膠囊不同給藥方案所制備的含藥血清對氧化損傷內(nèi)皮細(xì)胞存活率、乳酸脫氫酶活性、一氧化氮、內(nèi)皮素-1、組織型纖溶酶原激活物、組織型纖溶酶原激活物抑制劑的含量為指標(biāo)，評價不同方案制備的含藥血清對內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用。結(jié)果：不同方案所制備冠心止痛膠囊含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷均具有保護作用，連續(xù)3 d、5 d、7 d給藥組含藥血清的藥效明顯強于單次給藥，連續(xù)5 d、7 d組的含藥血清作用強于3 d組，但連續(xù)5 d、7 d組含藥血清藥效無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：冠心止痛膠囊含藥血清的藥效與給藥時間存在一定時效關(guān)系，以2次/d連續(xù)5 d給藥后所制備的含藥血清藥理效應(yīng)最佳。

冠心止痛膠囊；含藥血清；時效關(guān)系；過氧化氫

中藥及中藥復(fù)方成分復(fù)雜，直接用于體外藥理實驗的科學(xué)性較差，難以得到認(rèn)可。血清藥理學(xué)將中藥或中藥復(fù)方給動物灌胃后，采集動物血液并分離血清，以含藥血清作為藥物用于中藥的體外研究，可以避免中藥直接應(yīng)用體外實驗帶來的各種弊端[1]。然而制備含藥血清的給藥時間并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，中藥成分多樣，不同成分的藥代動力學(xué)相差甚遠，因此確定給藥多長時間才能取得最佳的含藥血清是血清藥理學(xué)的重要問題[2]。冠心止痛膠囊是河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床療效確切，實驗表明其對血管內(nèi)皮具有很好的保護作用[3-4]。本研究采用不同給藥時間制備的冠心止痛膠囊含藥血清干預(yù)H2O2誘導(dǎo)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，以確定制備含藥血清的最佳方案，為進一步研究冠心止痛膠囊的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品與試劑

冠心止痛膠囊，由瓜蔞、半夏、紅花、赤芍、蒲黃、川芎、紫蘇梗等組成，為河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號：豫藥制字Z20121056，批號20130301。臨用時將膠囊內(nèi)容物用蒸餾水配成0.3 g/ml混懸液備用。胎牛血清、1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司)；噻唑藍(MTT，Amresco公司)；H2O2(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；乳酸脫氫酶(LDH)、一氧化氮(NO)試劑盒(南京建成生物公司)；內(nèi)皮素-1(ET-1)、組織型纖溶酶原激活物(tPA)、纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.2 動物和細(xì)胞株

SPF級SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購于河南省實驗動物中心，許可證號SCXK(豫)2010-0002。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(HUVECs)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 儀器

Synergy NEO型全功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)；3164型細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific公司)；2K15型冷凍離心機(Sigma公司)；XSJ-D型倒置相差顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

SD大鼠常規(guī)喂養(yǎng)，隨機分為空白對照組、單次給藥組、3 d給藥組、5 d給藥組、7 d給藥組，每組8只，給藥組給予冠心止痛膠囊3.0 g/(kg·d)(等效劑量的5倍)，空白組給予相同體積的蒸餾水。單次給藥組僅給藥1次，其余給藥組，每天給藥2次。各組分別在末次給藥后1 h，麻醉后腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min分離血清，56℃水浴滅活，0.22 μm過濾除菌，-80℃保存?zhèn)溆肹5]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，待細(xì)胞至80%融合時，加入0.25%胰酶消化，顯微鏡下見細(xì)胞圓縮、間隙增大時，立即加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液終止消化，吹打，制成細(xì)胞懸液進行實驗。

2.3 不同給藥方案含藥血清對HUVECs細(xì)胞存活率的影響

將HUVECs細(xì)胞以1×105個/ml接種于96孔板，分為6組：空白對照組(15%空白大鼠血清)、模型對照組(15%空白大鼠血清+200 μmol/L H2O2)和各實驗組(分別含15%不同方案含藥血清+200 μmol/L H2O2)，每組6個復(fù)孔[6]，另設(shè)6孔為陰性組(無細(xì)胞)，孵育培養(yǎng)20 h后，每孔加入5 g/L的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，然后每孔加入150 μL DMSO，避光震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于570 nm處測定各孔的吸光度(A)并計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=(實驗組A-陰性組A)/(空白組A-陰性組A)×100%

2.4 不同血清對HUVECs分泌LDH、NO、ET-1、tPA、PAI-1的影響

HUVECs細(xì)胞以1×105個/ml接種于48孔板，分組同“2.4”，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，收集上清液，采用微板法檢測各組細(xì)胞上清液中LDH的活性和NO的含量，ELISA法檢測各組上清液中ET-1、tPA、PAI-1的含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 不同給藥方案含藥血清對細(xì)胞存活率的影響

與空白對照組相比，H2O2損傷后HUVECs存活率顯著降低；與模型組相比，各方案制備的含藥血清均能提高HUVECs細(xì)胞的存活率(P<0.01)。連續(xù)3 d、5 d、7 d制備的含藥血清與單次給藥相比，HUVECs細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1。

組別劑量(g/kg)A值細(xì)胞存活率(%)空白對照組-0.580±0.082**100.00模型對照組-0.297±0.04651.21單次給藥組3.00.432±0.061**74.483d給藥組3.00.421±0.058**72.595d給藥組3.00.457±0.069**78.797d給藥組3.00.451±0.057**77.76

注：與模型對照組比較，**P<0.01。

3.2 不同含藥血清對LDH 、NO、ET-1、tPA、PAI-1的影響

與模型對照組相比，各實驗組含藥血清均能降低LDH的活性和ET-1含量，增加NO的分泌(P<0.05或P<0.01)，3 d、5 d、7 d組tPA分泌增加，PAI-1含量降低，PAI-1的分泌顯著減少(P<0.05或P<0.01)，且存在時間依賴關(guān)系，結(jié)果見表2。

組別LDH(U/L)NO(μmol/L)ET-1(pg/ml)tPA(ng/ml)PAI-1(ng/ml)空白對照組587.49±42.60**54.85±4.46**47.89±4.60**59.60±5.33**46.26±4.45**模型對照組886.26±64.2831.53±2.8574.29±7.5240.62±4.0275.37±6.73單次給藥組765.20±52.23*36.02±2.76*62.28±5.35*44.94±4.5165.24±6.323d給藥組708.51±49.64**42.58±3.07**△55.89±4.96**52.80±4.76*54.65±4.94**△5d給藥組672.65±45.31**△44.67±3.15**△52.07±4.88**△56.62±4.91**△50.29±5.21**△7d給藥組674.82±47.69**△47.90±3.11**△52.64±4.73**△55.94±4.78**△49.15±5.39**△

注：與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與單次給藥組比較，△P<0.05。

4 討論

自從日本學(xué)者Hiroko Iwama于1984年首次提出了血清藥理學(xué)的概念，中藥的體外藥理研究有了新途徑。血清藥理學(xué)具有藥效易于檢測，避免中藥本身對實驗的影響，直接體現(xiàn)了中藥及其代謝產(chǎn)物的藥理作用等優(yōu)點，在中醫(yī)藥藥理作用機制的研究中顯示出了明顯優(yōu)勢。利用含藥血清進行中藥藥理研究，如何能夠采集到含藥量較高的血清是非常重要的問題。不同的給藥次數(shù)、間隔，都會影響血藥濃度，所以進行時效關(guān)系研究對于制備含藥血清是必要的[7-9]。

目前制備含藥血清常用給藥方案有：單次給藥或間隔2～4 h分2次給藥，或1天1～2次，連續(xù)3～10天[10-11]，還有每天給藥2次，連續(xù)3 d，末次給藥后1 h采血的“通法”[12]。我們通過比較連續(xù)3 d、5 d、7 d給藥與僅單次給藥后所制備的含藥血清對過氧化氫損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的存活率，同時對各組血清細(xì)胞分泌相關(guān)因子的影響，確定制備冠心止痛含藥血清的最佳給藥方案。結(jié)果表明，冠心止痛膠囊含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷具有顯著的保護作用，連續(xù)3 d、5 d、7 d給藥組的含藥血清的藥效明顯強于單次給藥，連續(xù)5 d、7 d組的含藥血清的作用強于3 d組，但連續(xù)5 d、7 d組的含藥血清藥效無統(tǒng)計學(xué)差異，因此制備冠心止痛膠囊含藥血清的最佳方案為2次/d連續(xù)5 d給藥。

基于以上，我們認(rèn)為制備含藥血清不能套用其他藥物或者拘泥于傳統(tǒng)的“通法”，中藥成分多樣，體內(nèi)過程復(fù)雜，制備含藥血清應(yīng)該根據(jù)具體藥物及實驗情況而定，不僅要省時省力，更要保證所制備的含藥血清的質(zhì)量。對中藥復(fù)方含藥血清制備方法的研究，本實驗只是一個初步的探討，尚需更深入地研究。

[1] 張靈娜,林兵,宋洪濤.中藥血清藥理學(xué)、血清藥物化學(xué)的研究概況及展望[J].中草藥,2015,46(17):2662-2665.

[2] 陳賜慧,花寶金.關(guān)于中藥血清藥理學(xué)實驗的幾個問題和探討[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2013,31(1):46-48.

[3] 黃霞,王守富,劉惠霞,等.冠心止痛膠囊對動脈粥樣硬化模型大鼠的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2016,22(1):153-157.

[4] 梁瑞峰,王守富,宋獻美.冠心止痛膠囊含藥血清對過氧化氫損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用[J].中國中醫(yī)急癥,2015,24(11):1885-1887.

[5] 雷霞,遲英嬌,趙冬梅,等.逍遙丸含藥血清依賴雌激素受體促進鼠成骨細(xì)胞增殖作用的研究[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(6):107-109.

[6] 杜清華,曹唯儀,王宏濤,等.土鱉蟲活性組分對過氧化氫損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護作用[J].中醫(yī)藥信息,2014,31(3):10-14.

[7] 林圓圓,杜武勛,張少強,等.基于血清藥理學(xué)的中藥復(fù)方時效關(guān)系研究[J].中醫(yī)雜志,2013,54(14):1175-1178.

[8] 王倩，范文濤，賀又舜.地黃飲子含藥血清對胎鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞遷移的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2015,43(1):8-10.

[9] 蘆沖，張睿蘇，高彥宇,等.半枝蓮醇提物含藥血清對人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖、凋亡和周期的影響[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2016,44(2):51-54.

[10] 李月婷,李靖,肖婷婷,等.基于中藥血清藥物化學(xué)及血清藥理學(xué)方法探討葒草保護心肌細(xì)胞氧化損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2013,19(2):158-162.

[11] 柏立浩,張麗,沈健.二參加芪口服液含藥血清對人肺癌A549細(xì)胞的抑制作用及機制研究[J].中醫(yī)藥信息,2016,33(1):19-21.

[12] 李儀奎,吳健宇.血清藥理實驗中采血時間的通法方案[J].中國藥理學(xué)通報,1999,15(6):569-570.

Effect of Medicated Serum Prepared with Guanxin Zhitong Capsule in Differents Time-effects on Human Umbilical Vein Endothelial Cells

LIANG Rui-feng1, SONG Xian-mei2, WANG Shou-fu3*, LU Ji-feng1

(1.HenanProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450004,China;2.HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191,China; 3.TheAffiliatedHospitalofHenanProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450004，China)

Objective:To study the effect of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule in different time-effects on human umbilical vein endothelial cells. Methods:The oxidative injury models induced by H2O2were established by human umbilical vein endothelial cells and then the cell viability, lactic dehydrogense, nitric oxide,endothelin-1, tissue plasminogen activator and plasminogen activator inhibitor-1 were analyzed. They were used to study the time-effect of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule. Results:Medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule had a significantly protective effect on HUVECs injured by H2O2. The 3d group, 5d group and 7d group were better than the single administration group according to protecting HUVECs, while the latter two groups were better than the 3 d group. However, there was no significant difference between 5 d group and 7 d group according to the protective effect on HUVEC injured by H2O2. Conclusion:There is a time-effect relationship of medicated serum prepared with Guanxin Zhitong capsule for the treatment of HUVECs injured by H2O2. Administration with two times per day for five days has the optimal efficacy.

Guanxin Zhitong capsule; Medicated serum; Time-effect relationship; Hydrogen peroxide

國家中醫(yī)藥管理局重點學(xué)科建設(shè)項目(No.國中醫(yī)藥發(fā)[2009]30號)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)心病學(xué)重點學(xué)科基礎(chǔ)研究課題(No.1304483)；河南省省屬科研機構(gòu)預(yù)研專項基金(No.201504552)

梁瑞峰(1983-)，男，助理研究員，主要研究方向：中藥藥理。

王守富*(1964-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)防治心血管疾病。

2016-06-06

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0049-03

修回日期：2016-07-10