付殷，高彥宇，曹明明，王艷麗，李冀

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

?

烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

付殷，高彥宇，曹明明，王艷麗，李冀*

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法： 采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法，建立心肌缺血再灌注損傷模型，測(cè)定大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量;采用TUNEL法檢測(cè)心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞的凋亡;免疫組化法測(cè)定心肌缺血再灌注心肌細(xì)胞Caspase-3和TNF-α蛋白表達(dá)。結(jié)果：與M組比較，P組和H+AM1:2組能夠明顯提高SOD活性，降低MDA含量;與M組比較，H+AM1:2組明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，P組明顯降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù);sham組與M組比較，M組心肌細(xì)胞中Caspase-3和TNF-α的蛋白量明顯增加，與M組比較，H+AM1:2組和P組能夠明顯降低Caspase-3和TNF-α的蛋白量。結(jié)論：烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用。

烏腺金絲桃；黃芪；心肌缺血再灌注；抗氧化應(yīng)激；Caspase-3；TNF-α

冠狀動(dòng)脈管腔狹窄或阻塞，導(dǎo)致血流灌注量不足引起心肌功能受損、代謝異常以及結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而產(chǎn)生心肌缺血性損傷。損傷發(fā)生后及時(shí)盡早的恢復(fù)血液灌注供應(yīng)，可以減少心肌梗死面積、改善心肌功能代謝和可逆的結(jié)構(gòu)改變，然而心肌缺血后冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)可進(jìn)一步造成心肌損傷，導(dǎo)致本已存活的心肌細(xì)胞死亡[1]。Jennings等首次證明心肌再灌注損傷是一種不同于心肌缺血的病理學(xué)現(xiàn)象，并且這種損傷存在于人類當(dāng)中[2-3]。心肌缺血再灌注損傷成為影響心腦血管疾病治療的首要考慮因素，因此，深入研究心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制和尋找心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)藥物成為醫(yī)學(xué)和藥學(xué)工作者的重要研究方向[4-5]。

烏腺金絲桃是藤黃科金絲桃屬植物，常用于治療心悸，胸悶,胸痛[6-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明,烏腺金絲桃能夠改善缺血心肌損傷的心肌生理功能和降低脂質(zhì)過(guò)氧化,對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[8-9]。我們前期實(shí)驗(yàn)研究表明烏腺金絲桃對(duì)缺血性心臟病、心律失常療效顯著。因此本研究旨在探討烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用和兩者的最佳配比。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar大鼠，體質(zhì)量220～250 g，雌雄各半，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK黑2011001。

1.2 儀器

石蠟切片機(jī)和全自動(dòng)組織包埋機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；BX51生物顯微鏡(日本奧林巴斯)；雙激發(fā)熒光光電倍增系統(tǒng)(美國(guó)IonOptix公司)；TUNEL試劑盒(Roche公司)。

1.3 分組和給藥

將Wistar大鼠隨機(jī)分為8組，分別為烏腺金絲桃組(H)，黃芪組(AM)，烏腺金絲桃比黃芪1:1組(H:AM1:1)，烏腺金絲桃比黃芪1:2組(H:AM1:2)，烏腺金絲桃比黃芪2:1組(H:AM2:1)，預(yù)處理組(P)，模型組(M)，假手術(shù)組(Sham)，每組10只大鼠。給藥情況為H組(7.875 g/kg)、AM組(10 g/kg)、H+AM1:1組、H+AM1:2組、H+AM2:1組、Sham組、M組和P組連續(xù)灌胃14天，其中Sham組、M組和P組給予同體積的生理鹽水，Sham組只開(kāi)胸，不做缺血再灌注手術(shù)，P組在心肌缺血再灌注模型建立前首先進(jìn)行5 min缺血，5 min恢復(fù)灌注，重復(fù)4次。

1.4 心肌缺血再灌注損傷模型建立

資料[10-11]，Wistar大鼠經(jīng)25%烏拉坦麻醉，仰臥位固定，氣管插管，接實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸機(jī)，以通氣量7～8 ml/kg，通氣頻率65～70次/min，吸呼比1:2，壓力4～5 kPa進(jìn)行機(jī)械通氣 。左側(cè)開(kāi)胸，找到冠狀動(dòng)脈左前降支，手術(shù)線結(jié)扎，閉合胸腔，觀察心電圖T波高聳或倒置表明模型建立成功。結(jié)扎30 min后松開(kāi)結(jié)扎線，恢復(fù)心臟血流，再灌注60 min觀測(cè)指標(biāo)。再灌注結(jié)束后立即取出腹主動(dòng)脈血液和心臟。

1.5 血清中SOD活性和MDA含量測(cè)定

心肌缺血再灌注60 min后，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min，離心10 min，收集血清，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定SOD活性和MDA含量。

1.6 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)

大鼠處死后，于心尖附近取灌注區(qū)心肌組織，4%多聚甲醛固定, 梯度乙醇脫水, 二甲苯透明, 浸蠟, 石蠟包埋切片, 然后參照TUNEL檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡細(xì)胞染色。鏡下觀察, 凋亡細(xì)胞核為棕黃色或黃色, 陰性細(xì)胞核呈藍(lán)色。每例切片隨機(jī)選取視野內(nèi)細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞數(shù), 計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptosisindex,AI,AI=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100 %)。

1.7 免疫組化檢測(cè)Caspase-3、TNF-α蛋白表達(dá)

再灌注60 min結(jié)束后，取大鼠心肌組織，10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片常規(guī)脫蠟，3%過(guò)氧化氫孵育10 min，PBS沖洗3次，微波修復(fù)，加入一抗，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，加入二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素染色，中性樹(shù)膠封片，400×顯微鏡觀察，每組隨機(jī)分析6個(gè)高倍鏡視野，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)積分光密度(IOD)即陽(yáng)性面積×平均光密度進(jìn)行分析，IOD代表基因和蛋白相對(duì)表達(dá)量，表達(dá)的均值代表該照片的相對(duì)表達(dá)量。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性為黃色或黃棕色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 烏腺金絲桃和黃芪配伍對(duì)MIRI大鼠血清SOD活性和MDA含量影響

如表1所示，Sham組與M組比較，M組大鼠血清SOD活性明顯降低(P<0.01)；與M組比較，P組大鼠血清SOD活性顯著升高(P<0.01)，H+AM1：2與H+AM1:1組SOD活力升高明顯(P<0.05)，AM組、H組和H+AM2:1組中大鼠SOD活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Sham組與M組比較，M組大鼠血清中MDA含量明顯升高(P<0.01)；與M組比較，P組和H+AM1:2組大鼠血清中MDA含量明顯降低(P<0.01)，其他組大鼠血清中MDA含量略有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

組別SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)Sham組13.1±4.33**1.92±0.04**M組75.24±2.533.73±0.15P組124.65±8.77**2.01±0.04**AM組93.82±2.213.17±0.05H組94.99±2.653.21±0.07H+AM1:1組105.71±3.49*2.69±0.06H+AM2:1組86.97±2.662.88±0.08H+AM1:2組118.7±2.11*2.1±0.07**

注：與M組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 TUNEL檢測(cè)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況

由表2和圖1可知，與Sham組比較，M組的大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增高(P<0.01)，與M組比較，P組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.01)，H+AM1:2組的大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05)，其他組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)略有降低但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P>0.05)。

組別ApoptoticIndex(%)Sham組11.12±0.62**M組46.78±0.53P組15.02±0.46**AM組31.09±0.61H組32.99±1.09H+AM1:1組25.27±0.78H+AM2:1組29.70±0.71H+AM1:2組17.43±0.20*

注：與M組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 烏腺金絲桃和黃芪配伍對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞影響

2.3 烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)MIRI大鼠心肌組織Caspase-3和TNF-α蛋白表達(dá)

由表3和圖2可知，Sham組與M組比較，M組中Caspase-3和TNF-α的IOD值明顯升高(P<0.01)；與M組比較，H+AM1:2組中Caspase-3和TNF-α的 IOD值明顯下降(P<0.05)，P組中Caspase-3和TNF-α的IOD值下降最為明顯(P<0.01)，其他組與M組比較IOD都有下降的趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

組別Caspase-3TNF-αSham組38345.73±363.08**341.66±317.11**M組71271.69±309.9246733.58±331.72P組42820.09±258.03**36522.92±115.12**AM組59899.89±114.7741907.64±334.42H組49130.18±368.6343723.21±343.14H+AM1:1組47222.65±342.2640211.12±335.63H+AM2:1組58582.38±281.99456.57±234.03H+AM1:2組44843.09±336.82*38367.11±222.76*

注：與M組比較，*P<0.05,**P<0.01。

3 討論

心肌缺血再灌注時(shí)激活內(nèi)皮細(xì)胞或心肌細(xì)胞的NADPH氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量的ROS，超過(guò)內(nèi)源性氧自由基清除能力，激發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，對(duì)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮和內(nèi)腔的細(xì)胞造成損傷，從而損傷心肌。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，反映心肌脂質(zhì)過(guò)氧化的程度指標(biāo)。SOD是體內(nèi)氧自由基清除劑，活性高低反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA 與 SOD共同調(diào)節(jié)心肌組織的抗氧化損傷水平。已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[12-13]，心肌缺血再灌注損傷時(shí)，MIRI大鼠模型血清中MDA 含量增高、SOD活力降低，說(shuō)明此時(shí)心肌組織的氧化及抗氧化系統(tǒng)障礙。本研究發(fā)現(xiàn)H+AM1:2組能夠明顯提高M(jìn)IRI模型大鼠血清中SOD活性和降低MDA含量，這可能降低大量氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，其作用機(jī)制可能與抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、維持心肌組織氧化及抗氧化系統(tǒng)的平衡有關(guān)。這與Chang研究結(jié)果相類似[14]。

圖2 MIRI大鼠心肌組織Caspase-3和TNF-α蛋白表達(dá)影響

Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中起到關(guān)鍵性蛋白，高度表達(dá)激活細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)凋亡蛋白質(zhì)產(chǎn)生，加重心肌細(xì)胞的損傷，TNF-α是促炎細(xì)胞因子，作用于內(nèi)皮細(xì)胞，激活白細(xì)胞趨化黏附因子，導(dǎo)致炎癥和損傷的進(jìn)一步發(fā)展，同時(shí)TNF-α也能激活黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生ROS，進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，H+AM1:2組能明顯降低Caspase-3和TNF-α蛋白表達(dá)，對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡起到抑制作用，具有保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用，這可能是通過(guò)下調(diào)Caspase-3與TNF-α表達(dá)，阻斷通過(guò)激活TNF-α由Caspase-3執(zhí)行的細(xì)胞凋亡過(guò)程，降低由TNF-α介導(dǎo)所產(chǎn)生的ROS，以減少心肌細(xì)胞凋亡。

本研究以MIRI大鼠為模型，研究烏腺金絲桃與黃芪配伍對(duì)心肌缺血再灌注損傷的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H+AM1:2能夠明顯提高SOD活性、降低MDA含量、下調(diào)Caspase-3和TNF-α的蛋白表達(dá)，對(duì)心肌缺血再灌注的損傷具有一定保護(hù)作用，進(jìn)一步揭示中藥能夠從多個(gè)靶點(diǎn)對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury[J]. N Engl J Med,2007, 7(11):1121-1135.

[2] Jennings R,Sommers H,Smyth G,et al.Myocardial necrosis induced by temporary occlusion of a coronary artery in the dog[J]. Arch Pathol,1960,70:68-78.

[3] Staat P,Rioufol G, Piot C,et al. Postconditioning the human heart[J].Circulation,2005,112(14):2143-2148.

[4] 李冀，王秀珍，李在斯,等.中藥治療心肌缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2015,43(2):107-109.

[5] 李冀，丁瑩，王呈祥，等.淺談心肌缺血再灌注損傷的中醫(yī)新進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2016,44(2):105-107.

[6] 吳鑫宇，高彥宇，朱潔宜,等.烏腺金絲桃對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠NO及VEGF表達(dá)的影響[J].中醫(yī)藥信息，2016,33(4):4-6.

[7] 李冀，隋姝婷，胡曉陽(yáng),等.烏腺金絲桃與當(dāng)歸配伍對(duì)MIRI大鼠的保護(hù)作用研究[J].中醫(yī)藥信息，2016,33(4):12-14.

[8] 高彥宇,李冀,滕琳.烏腺金絲桃提取物對(duì)大鼠離體心臟左心室功能的影響[J]. 中醫(yī)藥信息,2009,26(4):84-86.

[9] 李冀,滕林,高彥宇.烏腺金絲桃提取物對(duì)小鼠心肌缺血的保護(hù)作用[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2009,16(1):38-39.

[10] Xu Z,Alloush J,Beck E,et al. A murine model of myocardial ischemia- reperfusion injury through ligation of the left anterior descending artery[J].J Vis exp,2014,86:1-7.

[11] Dongworth RK,Mukherjee UA,Hall AR,et al.DJ-1 protects against cell death following acute cardiac ischemia-reperfusion injury[J].Cell Death and Disease,2014,5:1-7.

[12] Mei Yang,Jianchang Chen,Jing Zhao.Etanercept attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury by decreasing inflammation and oxidative stress[J].Plos one,2014,9(9):1-9.

[13] Ping Liu,Ji-zhou Xiang,Lei Zhao,et al.Effect of β2-adrenergic agonist clenbuterol on ischemia/reperfusion injury in isolated rat hearts and cardiomyocyte apoptosis induced by hydrogen peroxide[J]. Acta Pharmacologica Sinica,2008,9:661-669.

[14] Ruiiao Chang,Yong Li,Xingxin Yang,et al.Protective role of deoxyschizandrin and schisantherin A against myocardial ischemia- reperfusion injury in rats[J].Plos one,2013,8(4):1-10.

Protective Effect of Compatibility of Hypericum Attenuatum and Astragalus Mongholicus on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury

FU Yin, GAO Yan-yu, CAO Ming-ming, WANG Yan-li, LI Ji*

(HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China)

Objective：To investigate the protective effect of compatibility of Hypericum attenuatum and Astragalus mongholicus on myocardial ischemia reperfusion injury (MIRI). Methods：Myocardial ischemia reperfusion injury models were established by ligation of the left anterior descending artery of the coronary artery. Speroxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content were determined in rats’ serum. TUNEL method was used to detect the apoptosis of myocardial cells. Caspase-3 and TNF-α proteins were determined by immunohistochemistry in myocardial cells of myocardial ischemia and reperfusion. Results：Compared with the model group, the pretreatment group and the H+AM1:2group could significantly increase SOD activity and reduce MDA content,and H+AM1:2group could significantly reduce the myocardial apoptosis index in rats. The apoptosis index of myocardial cells was significantly reduced in the pretreatment group. Compared with sham operation group and model group, the protein amount of Caspase-3 and TNF-α in model group was significantly increased. Compared with the model group, H+AM1:2group and pretreatment group could significantly reduce Caspase-3 and TNF-α protein amount. Conclusion：It has a protective effect of compatibility of Hypericum attenuatum and Astragalus mongholicus on myocardial ischemia reperfusion injury.

Hypericum attenuatum; Astragalus mongholicus; Myocardial ischemia reperfusion; Anti-oxidative stress; Caspase-3; TNF-α

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No.813733536)

付殷(1985-)，女,博士，黑龍中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)博士后科研流動(dòng)站在站工作人員。

李冀*(1960-)，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向: 方劑配伍規(guī)律及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2016-07-31

R285.5

A

1002-2406(2017)01-0006-04

修回日期：2016-08-10