鄒曉雪， 周 婷△， 李 妍， 李周洲， 付國慶， 劉躍偉， 葉方立， 張志兵，3

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢 4300652湖北省疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 4300793美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)系，里士滿 23298

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石英粉塵對(duì)小鼠氣道結(jié)構(gòu)及黏蛋白Muc5b表達(dá)的影響*

鄒曉雪1， 周 婷1△， 李 妍1， 李周洲1， 付國慶1， 劉躍偉2， 葉方立1， 張志兵1，3

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢 430065
2湖北省疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 4300793美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學(xué)婦產(chǎn)科學(xué)系，里士滿 23298

目的 探討石英粉塵對(duì)小鼠肺組織內(nèi)氣道結(jié)構(gòu)及黏蛋白Muc5b表達(dá)的影響。方法 將54只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、生理鹽水組、石英染塵組，每組18只?？瞻讓?duì)照組不作任何處理，生理鹽水組和石英染塵組分別給予一次性氣管灌注50 μL無菌生理鹽水和50 mg/mL石英粉塵懸液，于灌注后第1、7、28天每組分別處死6只。取小鼠右肺中葉置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進(jìn)行蘇木精-伊紅、AB-PAS和Masson染色，觀察小鼠肺組織內(nèi)支氣管結(jié)構(gòu)的改變，采用免疫組織化學(xué)法分析肺組織內(nèi)黏蛋白Muc5b的表達(dá)。結(jié)果 在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組和生理鹽水組小鼠肺組織內(nèi)支氣管結(jié)構(gòu)正常，表面分布有極少量黏蛋白；石英染塵組在灌注后第1天小鼠肺組織內(nèi)支氣管結(jié)構(gòu)基本正常，周圍炎性細(xì)胞浸潤，分泌少量黏蛋白；灌注后第7天肺組織內(nèi)支氣管壁增厚，管腔變窄，肺泡間隔增厚，內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，黏蛋白分泌量較多；灌注后第28天小鼠支氣管壁、肺泡間隔明顯增厚，部分支氣管完整性被破壞，周圍可見少量膠原沉積，偶見小塊狀纖維化，黏蛋白分泌量增多。石英染塵組小鼠肺組織內(nèi)黏蛋白Muc5b主要定位于支氣管黏膜層表面及肺泡間隔，其表達(dá)水平隨染毒時(shí)間的延長而逐漸升高，且均高于同期空白對(duì)照組和生理鹽水組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。結(jié)論 石英粉塵可導(dǎo)致小鼠肺組織內(nèi)支氣管壁增厚，管腔變窄，炎性反應(yīng)明顯，出現(xiàn)不同程度的纖維化改變，黏蛋白Muc5b表達(dá)量顯著增加。

石英粉塵； 氣道結(jié)構(gòu)； 黏蛋白； Muc5b

石英粉塵，俗稱矽塵，其主要成分是游離SiO2，不僅廣泛存在于礦山開采、金屬冶煉、機(jī)械制造及建筑等行業(yè)的工作場所空氣中，而且還可通過工業(yè)排放、沙塵暴及火山爆發(fā)等多種方式逸散到生活環(huán)境中。流行病學(xué)研究結(jié)果表明，雖然長期吸入含石英的粉塵可導(dǎo)致以肺組織纖維化為主的矽肺，但即使肺組織未出現(xiàn)矽肺的影像學(xué)特征，患者的肺功能也呈現(xiàn)不同程度的下降，出現(xiàn)慢性支氣管炎、肺氣腫及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)等多種以通氣功能障礙為主的呼吸系統(tǒng)疾病[1-6]。肺功能的下降會(huì)極大影響工人的勞動(dòng)能力及生活質(zhì)量，給勞動(dòng)者的家庭帶來嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，但目前對(duì)石英致肺功能下降的機(jī)制尚不十分清楚。正常的呼吸道結(jié)構(gòu)及氣道表面的黏液纖毛系統(tǒng)作為呼吸系統(tǒng)最重要的第一道防線，是維持肺組織正常通氣功能的重要因素，其中黏液層中黏蛋白Muc5b又是影響?zhàn)ひ豪w毛清除功能的核心組分[7-9]。因此，本研究選擇單次暴露式氣管灌注石英粉塵的染毒方法，探討石英粉塵對(duì)小鼠呼吸道結(jié)構(gòu)及黏蛋白Muc5b表達(dá)的影響，分析其在石英導(dǎo)致的以氣道通氣功能障礙為主的肺部疾病中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

超聲波清洗儀(華南超聲設(shè)備廠)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。Muc5b單克隆抗體(美國Abcam公司)，PAS染色試劑盒(珠海貝索生物)，Masson染色試劑盒(珠海貝索生物)，即用型免疫組化超敏SP試劑盒(邁新生物)。

1.2 石英粉塵來源及懸液制備

本研究使用的中國標(biāo)準(zhǔn)石英粉塵由中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與毒物控制所提供?；瘜W(xué)組分：游離SiO2含量>97%；粉塵粒徑分布：<1 μm 57%，1～ μm 34%，2～ μm 4.5%，3～ μm 3.0%，4～5 μm，1.5%。

稱取一定量的石英粉塵，高壓滅菌后用無菌生理鹽水配制成50 mg/mL的粉塵懸浮液，于染塵前超聲15 min使粉塵充分混勻。

1.3 動(dòng)物分組與染毒

SPF級(jí)C57BL/6健康雄性小鼠54只，體重(17±1)g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018，于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度20～24℃，濕度50%～60%，照明晝夜交替12 h/12 h，正常進(jìn)食與清潔飲水。將小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、生理鹽水組、石英染塵組，每組18只。采用單次暴露式氣管灌注法，生理鹽水組和石英染塵組分別給予50 μL無菌生理鹽水和50 mg/mL石英粉塵懸液，空白對(duì)照組不作任何處理。

1.4 肺組織的采集

各組小鼠分別于染毒后第1天、第7天和第28天進(jìn)行腹腔麻醉，眼球后靜脈叢放血處死，取出肺組織后，用4℃生理鹽水浸洗2次，將右肺中葉置于4%多聚甲醛固定液中固定和保存。

1.5 病理組織形態(tài)學(xué)檢查

將已固定的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片，采用蘇木精-伊紅(HE)及Masson染色觀察肺組織炎性反應(yīng)及纖維化的程度，采用阿爾辛藍(lán)-過碘酸雪夫(AB-PAS)染色觀察氣道黏液分泌的情況，中性黏液物呈紅色，酸性黏液物呈藍(lán)色，混合性黏液物呈紫紅色，于光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

各組肺組織纖維化結(jié)果根據(jù)Ashcroft 等[10]的方法分為4級(jí)：正常肺組織，計(jì)分為0；輕度纖維化，支氣管壁或肺泡壁有輕度纖維性增厚，但不伴有肺泡結(jié)構(gòu)的明顯破壞，計(jì)分為1；中度纖維化，支氣管壁或肺泡壁中度纖維性增厚，同時(shí)伴有肺泡結(jié)構(gòu)損傷，并有小的纖維條帶或者纖維塊生成，計(jì)分為2；重度纖維化，伴有肺泡結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p傷，并且形成大塊纖維化，造成肺實(shí)變，計(jì)分為3。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)黏蛋白Muc5b

將制備好的石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤1 h，經(jīng)二甲苯及不同濃度梯度的乙醇脫蠟復(fù)水，蒸餾水沖洗，95℃抗原修復(fù)30 min，37℃烘箱中血清封閉30 min；加Muc5b一抗(1∶200)4℃過夜，PBS沖洗3遍；加二抗37℃孵育30 min，PBS沖洗3遍；滴加生物素標(biāo)記的鏈霉素抗生物素蛋白，37℃孵育20 min，PBS沖洗3遍，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，清水洗凈、脫水、封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察黏蛋白Muc5b的表達(dá)并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，以平均吸光度值(A)作為檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠肺組織炎性反應(yīng)

由圖1可見，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組和生理鹽水組小鼠肺組織內(nèi)支氣管結(jié)構(gòu)正常，均未見炎性細(xì)胞浸潤。石英染塵組小鼠在灌注后第1天肺組織內(nèi)支氣管、肺泡間隔及肺泡結(jié)構(gòu)尚清晰，支氣管壁及周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁和肺泡間隔增厚，內(nèi)可見大量中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤；灌注后第7天，小鼠肺組織內(nèi)支氣管壁增厚，少部分脫落至氣道腔內(nèi)，管腔變窄，肺泡壁及肺泡間隔也增厚，內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)可見少量漿液性滲出物；灌注后第28天，小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，部分支氣管的完整性被破壞，肺組織內(nèi)支氣管壁、細(xì)支氣管壁、肺泡壁及肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內(nèi)聚集大量巨噬細(xì)胞、中心粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞，部分融合形成細(xì)胞性結(jié)節(jié)。

圖1 各組小鼠肺組織內(nèi)支氣管炎性反應(yīng)(蘇木精-伊紅染色，×400)Fig.1 Inflammatory changes of bronchioles in lung tissue of blank control group，saline group and silica dust group (HE staining，×400)

2.2 小鼠肺組織的纖維化改變

從圖2可以看出，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組和生理鹽水組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，支氣管壁及肺泡壁均未見纖維化改變。石英染塵組小鼠在灌注后第1天，肺組織內(nèi)支氣管壁及肺泡壁均未見纖維性增厚；灌注后第7天偶見小鼠肺內(nèi)支氣管壁周圍有少量膠原纖維沉積；灌注后第28天小鼠支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管壁周圍、肺泡間隔內(nèi)可見膠原沉積，出現(xiàn)小塊狀纖維化改變。我們對(duì)各組肺纖維化結(jié)果進(jìn)行分級(jí)評(píng)分發(fā)現(xiàn)：石英染塵組小鼠在灌注后第1、7、28天肺組織纖維化評(píng)分分別為(0.04±0.05)、(1.53±0.06)、(2.31±0.06)分；與空白對(duì)照組(0分)相比，石英染塵組小鼠在灌注后第7、28天肺組織纖維化評(píng)分明顯增高(均P<0.01)；且隨著染毒時(shí)間的延長，肺纖維化的程度逐漸加重，各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

2.3 小鼠肺組織內(nèi)黏液分泌

肺組織AB-PAS染色結(jié)果(圖3)可見，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組及生理鹽水組小鼠肺組織內(nèi)有極少量紫紅色的黏蛋白陽染顆粒。石英染塵組小鼠在灌注后第1天，肺組織內(nèi)支氣管周圍及增厚的肺泡間隔內(nèi)有明顯的紫紅色PAS陽性顆粒；灌注后第7天肺組織的炎性區(qū)域及支氣管黏膜層有較多紫紅色黏蛋白陽染顆粒；灌注后第28天肺組織內(nèi)增厚的支氣管及肺泡間隔區(qū)域有較多紫紅色黏蛋白陽染顆粒。

2.4 小鼠肺組織中黏蛋白Muc5b的表達(dá)

由圖4可見，黏蛋白Muc5b棕黃色陽染顆粒主要定位于肺組織的支氣管壁黏膜層表面、肺泡壁及肺泡間隔中。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白對(duì)照組和生理鹽水組，肺組織支氣管黏膜層及肺泡間隔可見極少量棕黃色顆粒。石英染塵組小鼠在灌注后第1天，肺組織支氣管壁及肺泡間隔內(nèi)有較明顯的棕黃色顆粒，灌注后第7、28天，支氣管壁黏膜層表面、肺泡間隔及肺泡壁分布的棕黃色顆粒均明顯增多。

我們對(duì)各組棕黃色顆粒進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，與同期空白對(duì)照組和生理鹽水組相比，在各個(gè)染毒時(shí)間石英染塵組小鼠肺組織內(nèi)黏蛋白Muc5b表達(dá)量明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；石英染塵組小鼠在灌注后第7、28天肺組織內(nèi)的Muc5b表達(dá)量明顯高于灌注后第1天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，而第28天和第7天之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體結(jié)果如表1所示。

組別染毒時(shí)間第1天第7天第28天空白對(duì)照組0.90±0.071.11±0.121.07±0.11生理鹽水組1.07±0.141.26±0.131.10±0.09石英染塵組3.35±1.29*#5.92±0.99*#△8.27±1.01*#△

與空白對(duì)照組比較，*P<0.01；與生理鹽水組比較，#P<0.01；與同組第1天比較，△P<0.01

3 討論

本研究通過單次暴露式氣管灌注石英粉塵的方法，探討石英粉塵對(duì)小鼠肺組織內(nèi)氣道結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織在石英粉塵暴露第1天即開始出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺內(nèi)支氣管及肺泡間隔均有大量黏液分泌，黏蛋白Muc5b的表達(dá)量增加，并隨染毒時(shí)間的延長呈逐漸上升趨勢(shì)；灌注后第7天小鼠肺內(nèi)開始出現(xiàn)支氣管管壁增厚，管腔變窄，支氣管周圍可見少量膠原沉積；至第28天小鼠肺組織內(nèi)支氣管及肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，支氣管壁周圍、肺泡間隔甚至出現(xiàn)小塊狀纖維化改變。

近來有研究發(fā)現(xiàn)，肺組織中小氣道的纖維化，是導(dǎo)致氣道出現(xiàn)阻塞性通氣功能障礙的重要因素[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)石英粉塵可引起小鼠肺組織內(nèi)支氣管壁及肺間隔明顯增厚，管腔變窄，部分支氣管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)斷裂，管壁周圍可見少量膠原沉積甚至小塊纖維化改變，與郭嘉麗等[13]研究結(jié)果一致。提示石英粉塵暴露早期致肺組織內(nèi)支氣管炎性反應(yīng)及纖維化的修復(fù)過程可能是引起以通氣功能障礙為主的呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。

正常氣道黏膜表面覆蓋有少量的黏液，主要由氣道上皮杯狀細(xì)胞及黏膜下腺體合成分泌的黏蛋白和氣道上皮細(xì)胞分泌的水及電解質(zhì)組成，對(duì)清除呼吸道異物、維持氣道微環(huán)境及通氣功能具有重要的作用[14]。但另一方面，慢性黏液高分泌是COPD的重要病理改變，在無腺體小氣道形成的“黏液栓”可致氣道阻塞，肺功能嚴(yán)重下降，是導(dǎo)致COPD患者死亡的潛在危險(xiǎn)因素[15-17]。臨床病理檢查結(jié)果顯示，COPD患者的無軟骨氣道表面“黏液栓”所占的比例(mucus-occupying ratio，MOR)達(dá)到20%，遠(yuǎn)高于正常人群的比例(<1%)[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自小鼠氣管內(nèi)灌注石英粉塵后第1天開始，支氣管壁及肺泡壁內(nèi)均出現(xiàn)較多紫紅色的黏蛋白陽性顆粒，隨著染毒時(shí)間的延長，黏蛋白的分泌量也增加，提示石英粉塵進(jìn)入機(jī)體后短時(shí)間內(nèi)即可引起肺組織內(nèi)氣道黏液分泌亢進(jìn)，黏蛋白表達(dá)量增加。早期研究結(jié)果顯示矽性蛋白沉著癥患者的肺泡腔內(nèi)也充滿了PAS陽染的黏蛋白顆粒[19]，我們的研究結(jié)果與之一致。因此，肺組織內(nèi)黏液分泌量增加可能是石英致通氣功能障礙性疾病發(fā)生的早期改變。

現(xiàn)有研究表明，黏蛋白(mucin，Muc)是呼吸道黏膜表面黏液層的重要組分，其中Muc5b是黏膜下黏液腺細(xì)胞分泌的主要黏蛋白，正常情況下主要表達(dá)在主支氣管[7-9]，從主支氣管到細(xì)支氣管Muc5b的表達(dá)量逐漸減少，至終末細(xì)支氣管及肺泡壁細(xì)胞基本無Muc5b的表達(dá)[20]，其對(duì)維持呼吸系統(tǒng)黏液纖毛清除功能及肺組織自身免疫平衡具有決定性的作用[21-22]。Roy等[21]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明Muc5b基因缺失小鼠氣道黏液纖毛清除功能明顯降低，上呼吸道通氣功能障礙，但下呼吸道通氣功能正常；然而Muc5b過表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)巨噬細(xì)胞活性增強(qiáng)，IL-23表達(dá)量顯著增加，明顯增強(qiáng)了肺部的炎性反應(yīng)。人群研究結(jié)果顯示，慢性支氣管炎、哮喘及COPD患者氣道內(nèi)腺體分泌的黏蛋白Muc5b明顯增加[23-24]，與健康人群相比，重度哮喘患者黏液腺管及氣道腔內(nèi)存在大量的黏蛋白Muc5b形成的“黏液栓”[9，25]。過量Muc5b會(huì)形成絲條或團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，改變了黏液流動(dòng)的動(dòng)力學(xué)特征，降低纖毛的協(xié)調(diào)擺動(dòng)能力，阻礙黏液纖毛轉(zhuǎn)運(yùn)功能[26]。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，COPD患者痰液中Muc5b/Muc5ac的比值顯著升高，且與肺功能指標(biāo)中的第1秒用力呼氣容積呈負(fù)相關(guān)[23，27]。本次研究結(jié)果顯示，石英染塵組小鼠肺組織內(nèi)支氣管表面及肺泡間隔內(nèi)Muc5b的表達(dá)量明顯增加，并隨著染毒時(shí)間的延長呈逐漸升高的趨勢(shì)，說明黏蛋白Muc5b表達(dá)異?？赡苁鞘⒎蹓m引起肺部炎性反應(yīng)及引發(fā)氣道通氣功能障礙的關(guān)鍵因素。

綜上所述，石英粉塵可導(dǎo)致小鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)小氣道管壁增厚，管腔變窄，炎性反應(yīng)明顯，出現(xiàn)不同程度的纖維化改變，黏蛋白Muc5b表達(dá)量顯著增加。黏蛋白Muc5b的過表達(dá)可能是石英致呼吸道黏液分泌異常及炎性反應(yīng)的主要誘因，對(duì)調(diào)控石英引發(fā)以通氣功能障礙為主的呼吸系統(tǒng)疾病具有重要的作用，但同時(shí)Muc5b缺失又會(huì)導(dǎo)致肺組織抗感染能力下降，增加死亡的概率[21]。因此，我們后期可進(jìn)一步探討不同程度地阻斷Muc5b對(duì)改善通氣功能及控制黏液分泌的作用，為分析黏蛋白Muc5b在石英致氣道損傷中的保護(hù)作用提供依據(jù)。

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(2016-08-20 收稿)

Influence of Silica Dust on Airway Structure and Expression of Muc5b in Mice

Zou Xiaoxue，Zhou Ting△，Li Yanetal

SchoolofPublicHealth，MedicalCollege，WuhanUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430065，China

Objective To explore the influence of silica dust on small airway structure and expression of Muc5b in lung tissue of mice.Methods Fifty-four male C57BL/6 mice were randomly divided into three groups：blank control group，saline group and silica dust group.The blank control group had no treatment，whereas the saline group and silica dust group were treated with 50 μL volume of sterile saline and 50 mg/mL silica dust suspension by single intratracheal instillation，respectively.Six mice were sacrificed in each group 1，7 and 28 days after the treatments.The middle lobe of right lungs was fixed in 4% paraformaldehyde and dyed by HE，AB-PAS and Masson staining after paraffin embedding procedure.The changes of bronchial structure in lung tissue were observed under microscope.Then the expression of Muc5b in lung tissue was analyzed by immunohistochemistry.Results At each time point，the bronchial structure of lung tissue in mice was normal，the surface of the bronchial structure was covered with very few mucins in blank control group and saline group.In silica dust exposure mice，the bronchioles of lung tissue were infiltrated with inflammatory cells and covered with a small number of mucins on the surface 1 day after treatment.It was observed that thickened bronchial walls and alveolar septum，narrowed lumens，infiltration of a large number of inflammatory cells and secreted mucins were presented in lung tissue of mice 7 days after silica dust exposure.The bronchial walls and alveolar septum were obviously thickened，integrity of some bronchi was broken，deposited slight collagen even small pieces of fibrosis could be observed and mucins were increased in the lung tissue 28 days after silica dust exposure.In addition，the mucin of Muc5b was mainly located in mucous membrane layer of bronchi and alveolar septum.The expression of Muc5b gradually increased with the prolonged time of silica dust exposure，and it was significantly higher than that in blank control group and saline group at the same time point(P<0.01).Conclusion Silica dust can not only result in thickened bronchial walls，narrowed lumen，marked inflammatory responses and varying degrees of fibrosis，but also significantly increase the expression of Muc5b in lung tissue of mice.

silica dust； airway structure； mucin； Muc5b

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81402659)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014CFB811)

R135.21

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.009

鄒曉雪，女，1991年生，碩士研究生，E-mail：437992506@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：skyting1219@126.com