呂 磊， 袁敬東， 黃 韜， 吳 維， 黃遂斌， 章傳華

武漢市第一醫(yī)院泌尿外科，武漢 430022

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USP22 aiRNA通過Mdm2-p53通路抑制膀胱癌耐藥細(xì)胞株T24/MMC的增殖*

呂 磊， 袁敬東△， 黃 韜， 吳 維， 黃遂斌， 章傳華

武漢市第一醫(yī)院泌尿外科，武漢 430022

目的 研究沉默泛素特異肽酶22(USP22)基因?qū)Π螂装㏕24絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)耐藥細(xì)胞株(T24/MMC)生長活性的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法 采用MTT法檢測不同濃度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)對T24和T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響。實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株、T24和T24/MMC細(xì)胞中USP22 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。采用非對稱性小RNA(aiRNA)干擾技術(shù)沉默USP22，MTT法和吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)雙重染色法分別檢測沉默USP22后MMC對T24細(xì)胞、T24/MMC細(xì)胞生長活性和凋亡的影響。實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法分別檢測p53和Mdm2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 采用不同濃度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)處理細(xì)胞24 h后，T24細(xì)胞的生長活性分別為82.4%、68.7%、44.2%、25.4%和4.7%，與未經(jīng)MMC處理組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。然而，0～160 μg/mL的MMC對T24/MMC細(xì)胞的生長活性無明顯影響。與SV-HUC-1細(xì)胞比較，USP22在T24及T24/MMC細(xì)胞中高表達(dá)，且T24/MMC細(xì)胞中USP22表達(dá)顯著高于T24細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。沉默USP22后，MMC對T24細(xì)胞的生長活性抑制作用更顯著。且當(dāng)MMC濃度在20～160 μg/mL時，沉默USP22后T24/MMC細(xì)胞的生長活性也明顯受到抑制，其生長活性分別為85.1%、70.3%、63.2%和47.8%。同時，AO/EB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，沉默USP22后給予80 μg/mL的MMC處理24 h，可誘導(dǎo)T24及T24/MMC細(xì)胞凋亡。實(shí)時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果進(jìn)一步顯示，轉(zhuǎn)染USP22 aiRNA 24 h后，T24/MMC細(xì)胞中p53基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，Mdm2表達(dá)水平下調(diào)。結(jié)論 USP22 aiRNA通過調(diào)控Mdm2-p53通路增強(qiáng)MMC抑制T24細(xì)胞增殖的敏感性，同時也能夠逆轉(zhuǎn)T24/MMC對MMC的耐藥。

膀胱腫瘤； 耐藥； 泛素特異肽酶22； 細(xì)胞增殖； 基因表達(dá)調(diào)控

非肌層浸潤性膀胱癌在經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)(TUBRT)術(shù)后有很高的復(fù)發(fā)率，部分患者甚至進(jìn)展為肌層浸潤性膀胱癌[1]。術(shù)后行膀胱灌注化療是預(yù)防非肌層浸潤性膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)和進(jìn)展的重要手段。絲裂霉素為常見的膀胱灌注化療藥物之一，在我國臨床應(yīng)用廣泛。由于膀胱癌具有起源多中心性，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等生物學(xué)特性，部分患者長期行膀胱灌注化療后出現(xiàn)對化療藥物抵抗，從而加速腫瘤的進(jìn)展，導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡[2]。因此，如何逆轉(zhuǎn)膀胱腫瘤的化療耐藥成為膀胱癌臨床治療的關(guān)鍵問題。泛素特異肽酶22(USP22)基因是最近發(fā)現(xiàn)的泛素水解酶家族的一個新成員，被認(rèn)為是癌致死標(biāo)簽，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演者重要的角色[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，USP22在膀胱癌中異常高表達(dá)，與膀胱癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥相關(guān)[4]。本文通過已建立的膀胱癌T24絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)耐藥細(xì)胞株(T24/MMC)，應(yīng)用非對稱小RNA(asymmetric structure of interfering RNA，aiRNA)干擾技術(shù)沉默USP22，觀察其對T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響，并探討其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、0.25%胰酶購自美國Gibco公司；Trizol試劑、LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；MTT試劑盒、蛋白裂解液、BCA試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(electrochemilum-inescence，ECL)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MMC購自浙江海正藥業(yè)；凋亡檢測試劑盒(AO/EB)購自南京凱基生物公司；兔抗人USP22、GAPDH多克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司；Control aiRNA、USP22 aiRNA由上海吉瑪公司合成及純化；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人膀胱癌細(xì)胞株T24、T24/MMC耐藥細(xì)胞株和人膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中。以6孔板為例，轉(zhuǎn)染前1 d，用2 mL不含抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合率達(dá)到50%～70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參考LipofectamineTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行分組：空白對照組(control)，轉(zhuǎn)染非特異性aiRNA的陰性對照組(negative control aiRNA，NC aiRNA)，轉(zhuǎn)染靶序列USP22 aiRNA組(USP22 aiRNA)。

1.3 USP22 aiRNA設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank(NM_015276)中USP22基因序列和siRNA設(shè)計原則，先設(shè)計針對USP22基因的3條特異性siRNA靶序列，選取其中一條沉默效率最高的USP22 siRNA序列，在此序列基礎(chǔ)上設(shè)計USP22 aiRNA序列，并設(shè)計陰性對照aiRNA(NC aiRNA)，具體設(shè)計方法參考前期研究結(jié)果[5]。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞生長活性

收集轉(zhuǎn)染24 h后的T24、T24/MMC細(xì)胞，將細(xì)胞重懸，以5×103/孔接種于96孔板，100 μL/孔，各3個復(fù)孔，用不同濃度的MMC處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，采用MTT法檢測每孔的吸光度值(A值)，計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組A490 nm/空白對照組A490 nm×100%。

1.5 吖啶橙和嗅乙啶(AO/EB)雙染色檢測細(xì)胞凋亡

用0.25%胰酶+0.02%的EDTA消化處理后的T24、T24/MMC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為107個/mL，制備單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液，加入3 μL AO(100 μg/mL)和3 mL EB(100 μg/mL)。充分混勻后，置1滴于載玻片上，上覆蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并計數(shù)500個細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞/所觀察的細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測目的基因mRNA的表達(dá)水平

收集處理后的各組細(xì)胞，采用Trizol兩步法提取細(xì)胞的總RNA，以2 μg的總RNA為模板，使用Invitrogen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，實(shí)時定量PCR法檢測目的基因的mRNA表達(dá)水平，GAPDH作為內(nèi)參對照。USP22基因上游引物5′-GACAACTGGAAGCAGAACC-3′，下游引物5′-CGTACATCAGATCAATGGC-3′；p53基因上游引物5′-GCTGCTCAGATAGCGATGG-3′，下游引物5′-AGGACAGGCACAAACACG-3′；Mdm2基因上游引物5′-AAGAAGCAGTAGCAGTGAAT-3′，下游引物5′-GAAGTTGATGGCTGAGAATAG-3′；G-APDH上游引物5′-TGAAGGTCGGAGTCAAC-GG-3′，下游引物5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性2 min；95℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。

1.7 Western blot法檢測目的基因蛋白的表達(dá)水平

收集處理后的各組細(xì)胞，裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取等量蛋白30 μg上樣于12% SDS-PAGE膠。以120 V恒壓電泳1 h，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。含5%脫脂奶的TBST室溫封閉1 h，加入稀釋一抗4℃封閉過夜；次日TBST洗膜10 min×3次，加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，ECL發(fā)光、X線膠片曝光、洗片。采用AlphaEaseFC 4.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析，以目的基因/GAPDH條帶吸光度比值代表目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的MMC對T24、T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響

采用不同濃度的MMC(20、40、80、160、320 μg/mL)處理細(xì)胞24 h，T24細(xì)胞的生長活性分別為82.4%、68.7%、44.2%、25.4%和4.7%，與未經(jīng)MMC處理組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。然而，當(dāng)MMC濃度在0～160 μg/mL時，T24/MMC細(xì)胞的生長活性無明顯差異(圖1)。

與0 μg/mL MMC比較，*P<0.05圖1 MMC對膀胱癌T24、T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響Fig.1 Effect of MMC on the cell viability in bladder cancer T24 and T24/MMC cells

2.2 USP22 aiRNA對USP22基因表達(dá)水平的影響

實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測結(jié)果(圖2)顯示，與SV-HUC-1比較，USP22在T24及T24/MMC中高表達(dá)，且T24/MMC中USP22表達(dá)顯著高于T24細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染USP22 aiRNA后，T24及T24/MMC細(xì)胞中的USP22表達(dá)水平顯著降低(圖3)。

A：實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果；B：Western blot法檢測結(jié)果；與SV-HUC-1比較，*P<0.05；與T24比較， △P<0.05圖2 實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測USP22 mRNA和蛋白在SV-HUC-1、T24、T24/MMC細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 The expression levels of UPS22 mRNA and protein in SV-HUC-1，T24 and T24/MMC cells were determined by qRT-PCR and Western blotting，respectively

A、B：實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測膀胱癌T24細(xì)胞中USP22 mRNA和蛋白表達(dá)水平；C、D：實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測膀胱癌T24/MMC細(xì)胞中USP22 mRNA和蛋白表達(dá)水平；與空白對照組比較，*P<0.05圖3 USP22 aiRNA對膀胱癌T24細(xì)胞和T24/MMC細(xì)胞中USP22 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 The effect of USP22 aiRNA on the USP22 mRNA and protein in T24 and T24/MMC cells

2.3 沉默USP22對MMC抑制T24和T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響

MTT結(jié)果(圖4)顯示，與空白對照組、NC aiRNA比較，轉(zhuǎn)染USP22 aiRNA后，MMC對T24細(xì)胞的生長活性抑制作用更顯著。且當(dāng)MMC濃度在20～160 μg/mL時，轉(zhuǎn)染USP22 aiRNA后，T24/MMC細(xì)胞的生長活性也明顯受到抑制。MMC濃度為20、40、80、160 μg/mL時T24/MMC細(xì)胞的生長活性分別為85.1%、70.3%、63.2%和47.8%。同時，AO/EB實(shí)驗(yàn)(圖5)進(jìn)一步顯示，沉默USP22后給予80 μg/mL的MMC處理24 h，T24及T24/MMC的凋亡誘導(dǎo)增加，其細(xì)胞凋亡率分別為80.3%和34.5%。

2.4 USP22 aiRNA對p53和Mdm2 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與空白對照組、轉(zhuǎn)染NC aiRNA組比較，轉(zhuǎn)染USP22 aiRNA后給予MMC 80 μg/mL處理24 h，T24/MMC細(xì)胞的p53 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Mdm2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低。說明沉默USP22逆轉(zhuǎn)T24/MMC對MMC的耐藥可能是通過下調(diào)Mdm2，上調(diào)p53的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

與空白對照組比較，*P<0.05圖4 沉默USP22對膀胱癌T24細(xì)胞、T24/MMC細(xì)胞生長活性的影響Fig.4 Effect of silencing USP22 by USP22 aiRNA on the viability of bladder cancer T24 and T24/MMC cells

圖5 沉默USP22后MMC對膀胱癌T24細(xì)胞和T24/MMC細(xì)胞凋亡的影響(AO/EB染色，×100)Fig.5 After silencing USP22 by USP22 aiRNA，the effect of MMC on the apoptosis of bladder cancer T24 and T24/MMC cells(AO/EB staining，×100)

A：實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果；B：Western blot法檢測結(jié)果；與空白對照組比較，*P<0.05圖6 沉默USP22對膀胱癌T24/MMC細(xì)胞中p53和Mdm2表達(dá)水平的影響Fig.6 Effect of silencing USP22 by USP22 aiRNA on the mRNA and protein expression of p53 and Mdm2 in bladder cancer T24/MMC cells

3 討論

MMC是膀胱癌術(shù)后行灌注化療的常用藥物，膀胱癌的化療耐藥是其治療失敗的主要原因。關(guān)于癌細(xì)胞在化療過程中如何獲得耐藥性而逃避甚至抵抗化療藥物的攻擊，國內(nèi)外既往已有大量研究，部分學(xué)者認(rèn)為腫瘤內(nèi)P-糖蛋白過度表達(dá)，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶含量變化等因素導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞耐藥[6-7]，但其具體作用機(jī)制尚不明確。在腫瘤的化療耐藥形成過程中，可能涉及到多種基因的激活與表達(dá)。腫瘤干細(xì)胞是最近化療耐藥研究的熱點(diǎn)，目前認(rèn)為，這些具有自我更新、多方向分化潛能的干細(xì)胞，在腫瘤化療耐藥中扮演著重要的角色[8]。USP22是最近發(fā)現(xiàn)的一種潛在的干細(xì)胞標(biāo)記物，也被稱為“癌致死標(biāo)簽”，屬于癌癥死亡相關(guān)基因，與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥密切相關(guān)。大量的研究證明，USP22在多種腫瘤組織中表達(dá)增高，并且發(fā)現(xiàn)異常高表達(dá)的USP22預(yù)示著腫瘤即將在體內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移及出現(xiàn)化療耐藥[9]。目前，已研究發(fā)現(xiàn)USP22與DNA轉(zhuǎn)錄、Myc和p21介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期變化有著密切聯(lián)系[10]。同時，USP22基因編碼了一種與腫瘤相關(guān)的、能調(diào)控基因表達(dá)幅度變化的水解酶[11]。而且，USP22可與人轉(zhuǎn)錄復(fù)合物SAGA(human Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase)結(jié)合，乙?；M蛋白H2A及H2B，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄[12]。但到目前為止，USP22的生物功能尚未完全明確。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，USP22在膀胱癌組織中異常高表達(dá)，且與膀胱癌的病理分級、臨床分期、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及化療耐藥密切相關(guān)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，USP22在SV-HUC-1中微弱表達(dá)，而在T24及T24/MMC中高表達(dá)，且在T24/MMC中的表達(dá)顯著高于T24細(xì)胞，進(jìn)一步證實(shí)了前期的研究結(jié)果。同時，本研究將不同濃度的MMC作用于T24及T24/MMC細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著MMC濃度增加(0～320 μg/mL)，T24細(xì)胞的生長活性逐漸降低，且呈劑量依賴方式。然而，濃度低于160 μg/mL的MMC對T24/MMC細(xì)胞的生長活性卻無明顯影響，說明膀胱癌耐藥細(xì)胞株T24/MMC對MMC具有耐藥性。通過aiRNA沉默USP22后，增強(qiáng)了MMC誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的敏感性，同時也逆轉(zhuǎn)了T24/MMC對MMC的耐藥。本實(shí)驗(yàn)選擇aiRNA而不是傳統(tǒng)的siRNA沉默USP22基因的表達(dá)，是基于本課題組前期的研究成果，發(fā)現(xiàn)相對于siRNA，aiRNA不僅能夠提高靶基因的沉默效率，同時也能夠更有效地降低RNA干擾中“競爭效應(yīng)”和“濃度飽和效應(yīng)”的影響[13]。

進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，沉默USP22后，T24/MMC細(xì)胞中p53基因mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，而Mdm2表達(dá)水平降低。p53是一個關(guān)鍵的腫瘤抑制蛋白，在人類腫瘤中也是最常見的突變基因。p53主要受轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，包括磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化、類泛素化等不同的修飾[14]。其中泛素化修飾是調(diào)控p53轉(zhuǎn)錄后水平的一個重要機(jī)制。p53可以被多種E3泛素連接酶修飾，包括Pirh2、ARF結(jié)合蛋白、Mdm2蛋白等。其中，Mdm2蛋白是p53基因的一個關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[15]。Mdm2屬于E3連接酶環(huán)指結(jié)構(gòu)家族中的一員，環(huán)指結(jié)構(gòu)可以結(jié)合E2泛素連接酶，從而將靶蛋白泛素化降解[16]。Stevenson等[17]研究發(fā)現(xiàn)USP2a通過Mdm2調(diào)控p53的表達(dá)，抑制內(nèi)源性USP2a的表達(dá)使Mdm2表達(dá)不穩(wěn)定，從而使p53蛋白聚集，促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄后激活。USP22與USP2a同屬于泛素水解酶家族，在結(jié)構(gòu)上兩者也具有相似之處。因此，推測沉默USP22可能通過Mdm2上調(diào)p53基因的表達(dá)，抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和阻滯細(xì)胞周期的分布，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥。

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默USP22可以通過調(diào)控Mdm2-p53信號通路增加MMC抑制T24細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的敏感性，同時也可以逆轉(zhuǎn)T24/MMC耐藥細(xì)胞株對MMC的耐藥。靶向沉默USP22基因有望成為治療化療耐藥性膀胱癌的一種新途徑。

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(2016-03-24 收稿)

USP22 aiRNA Inhibits Proliferation of Drug-resistant Bladder Cancer Cell Line T24/MMC through Mdm2-p53 Signaling Pathway

Lv Lei，Yuan Jingdong△，Huang Taoetal

DepartmentofUrology，WuhanFirstHospital，Wuhan430022，China

Objective To investigate the effect of USP22 aiRNA on the proliferation of drug-resistant bladder cancer cell line T24/MMC，and to explore its underlying mechanism.Methods After treated by different concentrations of MMC(20，40，80，160，320 μg/mL)，the cell proliferation of T24 and T24/MMC was detected by MTT assay.The expression levels of USP22 mRNA and protein in SV40-immortalized human urothelial cells(SV-HUC-1)，T24 and T24/MMC cells were determined by using qRT-PCR and Western blotting，respectively.The expression of USP22 was inhibited by specific asymmetric structure of interfering RNA.The effect of USP22 aiRNA on cell proliferation of T24 and T24/MMC was detected by MTT assay and the cell apoptosis was detected by AO/EB assays.Moreover，after transfection with USP22 aiRNA，the mRNA and protein levels of p53 and Mdm2 were determined by qRT-PCR and Western blotting，respectively.Results After treated with different concentrations of MMC(20，40，80，160，320 μg/mL)，the cell viability of T24 cells was 82.4%，68.7%，44.2%，25.4% and 4.7%，respectively(P<0.05).However，MMC did not affect the cell proliferation of T24/MMC cells at 0-160 μg/mL(P>0.05).As compared with SV-HUC-1，the expression level of USP22 was up-regulated in T24 and T24/MMC cells.Moreover，the USP22 expression level of T24/MMC cells was higher than that of T24 cells.After silencing USP22 by USP22 aiRNA，the inhibitory effect of MMC on the cell proliferation in T24 cells was increased.Meanwhile，MMC significantly suppressed the viability of T24/MMC cells at 0-160 μg/mL(P<0.05).The cell viability of T24/MMC cells was 85.1%(20 μg/mL)，70.3%(40 μg/mL)，63.2%(80 μg/mL)and 47.8%(160 μg/mL)，respectively(P<0.05).The AO/EB result showed that silencing USP22 could sensitize T24/MMC to MMC-induced apoptosis.Furthermore，24 h after transfection with USP22 aiRNA，the mRNA and protein levels of p53 were increased，but the mRNA and protein levels of Mdm2 were reduced significantly(P<0.05).Conclusion USP22 aiRNA enhances the inhibitory effect of MMC on the proliferation in T24 cells and reverses drug resistance in MMC-resistant T24 cells.

bladder neoplasms； drug resistance； ubiquitin specific pepetidase 22； cell proliferation； gene expression regulation

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81502204)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2014CFB399)；湖北省衛(wèi)生計生委科研資助項(xiàng)目(No.WJ2015MB136)

R737.14

10.3870/j.issn.1672-0741.2016.06.002

呂 磊，男，1981年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：teecars@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：YuanJD97@163.com