田麗貞 周美菊 張松照 薛靜?

強(qiáng)直性脊柱炎患者血清硬骨素水平與骨影像學(xué)變化的相關(guān)性分析

田麗貞 周美菊 張松照 薛靜?

目的 探討強(qiáng)直性脊柱炎（AS）患者血清硬骨素水平與脊柱影像學(xué)變化的關(guān)系。方法 選擇門診AS患者58例，同期門診類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者25例及健康體檢者25例作為對(duì)照組。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各組血清硬骨素水平。評(píng)估AS患者血清硬骨素水平與各項(xiàng)臨床指標(biāo)、影像學(xué)進(jìn)展之間的相關(guān)性。運(yùn)用Pearson相關(guān)性分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 AS組血清硬骨素濃度（65.9±21.7）pmol/L高于健康對(duì)照組（51.2±25.7）pmol/L，差異有顯著性（P=0.0349）；AS組血清硬骨素水平與患者年齡、病程、ASDAS評(píng)分、性別等均無關(guān)（P＞0.05），但與mSASSS評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.7）。結(jié)論 AS患者血清硬骨素水平對(duì)疾病診斷有一定的意義，同時(shí)可作為AS影像學(xué)進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物之一，反應(yīng)患者脊柱骨化程度。

強(qiáng)直性脊柱炎 骨化 硬骨素

強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)﹑脊椎關(guān)節(jié)，導(dǎo)致異位骨化［1］。新近研究發(fā)現(xiàn)參與骨代謝最主要的機(jī)制之一為Wnt信號(hào)通路的異常，硬骨素是Wnt信號(hào)通路的抑制劑，其可能通過干預(yù)Wnt通路進(jìn)而介導(dǎo)AS中新骨的形成［2］。本研究采用修訂后的斯托克AS脊柱評(píng)分（mSASSS評(píng)分）系統(tǒng)評(píng)價(jià)患者的影像學(xué)進(jìn)展，分析AS患者的血清硬骨素水平與mSASSS評(píng)分及AS相關(guān)臨床指標(biāo)間的關(guān)系，以期探討血清硬骨素水平與AS病理性成骨的關(guān)系，為研究AS的發(fā)病機(jī)制及治療提供臨床依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2015年1月至12月期間就診于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診的AS患者58例，其中男38例，女20例；平均年齡（36.5±13.5）歲；平均病程（10.4±10.3）年。所有病例均符合1984年修訂的紐約AS分類標(biāo)準(zhǔn)；25例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者來自同時(shí)期門診，設(shè)為對(duì)照組，均符合2010年ACR修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)；另將25例年齡性別相匹配的健康志愿者設(shè)為健康對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其它可能影響硬骨素分泌的疾病患者，如嚴(yán)重感染﹑惡性腫瘤﹑﹑嚴(yán)重臟器疾患者﹑其他骨代謝疾病等。

1.2 方法 （1）檢測(cè)方法及標(biāo)本保存：血清硬骨素采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定，所有入選患者及健康志愿者抽取空腹靜脈血2ml，經(jīng)抗凝，低溫離心，分離血漿后置于-30℃冰箱保存，統(tǒng)一測(cè)定。硬骨素試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司，嚴(yán)格按照試劑盒提供的操作方法和步驟完成。（2）ASDAS-CRP評(píng)分：記錄患者的主客觀指標(biāo)，包括CRP及晨僵時(shí)間﹑背痛程度評(píng)分﹑患者整體評(píng)估（PGA）﹑外周關(guān)節(jié)腫痛評(píng)分等，根據(jù)ASDAS評(píng)分軟件計(jì)算得出分值。（3）新修訂版斯托克評(píng)分mSASSS評(píng)分：所有AS患者均拍攝全脊柱X線片，分別由兩位醫(yī)生根據(jù)msASSS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法評(píng)分。mSASSS評(píng)分由腰椎評(píng)分和頸椎評(píng)分組成，總分0～72分。腰椎評(píng)分：根據(jù)12胸椎﹑5個(gè)腰椎﹑骶椎上段側(cè)位片評(píng)分。0分：正常；1分：侵蝕﹑硬化或方形變；2分：韌帶骨贅；3分：全椎體骨橋形成，竹節(jié)樣脊柱。所有病變點(diǎn)評(píng)分取平均值，乘以12為總分（0～36）。頸椎評(píng)分：根據(jù)第2～7頸椎側(cè)位片，第3頸椎由于其生理性凹面較小，方形變不評(píng)分，其余病變?cè)u(píng)分。評(píng)分方法與腰椎相似。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用r檢驗(yàn)；通過ROC曲線分析確定硬骨素作為AS診斷指標(biāo)的截?cái)帱c(diǎn)，并確定其在該點(diǎn)的診斷特異性﹑敏感性﹑曲線下面積（AUC）﹑Youden指數(shù)。診斷效力評(píng)級(jí)：AUC≤0.7為低級(jí)，0.7＜AUC＜0.9為中級(jí)，AUC≥0.9為高級(jí)。相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清硬骨素水平比較 AS組血清硬骨素濃度（65.9±21.7）pmol/L高于健康對(duì)照組（51.2±25.7）pmol/L，差異有顯著性（P=0.0349），高于RA組（59.9±35.8）pmol/L，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.3429）。RA組與健康對(duì)照組血清硬骨素水平無明顯差異（P＞0.05）。

2.2 AS患者血清硬骨素水平與各指標(biāo)的相關(guān)性 pearson相關(guān)分析顯示，AS組患者血清硬骨素水平與病程﹑年齡﹑性別﹑CRP﹑ESR﹑PGA﹑背痛時(shí)間﹑ASDAS均無明顯相關(guān)性（r＜0.3），說明血清硬骨素水平與AS患者病程﹑性別﹑年齡及疾病活動(dòng)度無關(guān)。但與影像學(xué)mSASSS評(píng)分有明顯相關(guān)性（r=0.7）。

2.3 AS組患者相關(guān)性分析 AS組患者msASSS評(píng)分平均為（18.6±8.2）分，與年齡﹑病程有明顯相關(guān)性（r均=0.6），說明AS患者脊柱關(guān)節(jié)硬化與年齡﹑病程呈線性相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)及病程的延長(zhǎng)，AS患者脊柱關(guān)節(jié)不斷骨化。與背痛時(shí)間有弱相關(guān)性（r=0.32）；與ESR﹑CRP﹑ASDAS均無明顯相關(guān)性（r＜0.3）。（1）按性別將AS組分為兩組：男38例，女20例。男性：平均年齡（34.9±13.0）歲，平均病程（11.3±11.1）年，平均硬骨素（66.5±20.5）pmol/L。女性：平均年齡（36.3±12）歲，平均病程（9.8±7.4）年，平均硬骨素（65.1±21.3）pmol/L，不同性別血清硬骨素水平無顯著差異（P=0.7）。但男性組msASSS評(píng)分與硬骨素水平明顯相關(guān)（r值=0.7），msASSS評(píng)分與ASDAS﹑性別﹑年齡﹑病程無明顯相關(guān)性（r均＜0.3）。女性組msASSS與硬骨素﹑性別﹑病程﹑ASDAS無明顯相關(guān)性（r均＜0.1），但msASSS評(píng)分與年齡明顯相關(guān)（r=0.6），說明在女性患者中，年齡對(duì)骨化有一定的影響。（2）按病程中位數(shù)10分為兩組，＜10年25例，男16例，女9例，平均年齡（31.5±11.0）歲，平均硬骨素（62.6±20.8）pmol/L，≥10年33例，男22，女11例，平均年齡（31.5±13.0）歲，平均硬骨素（68.4±22.4）pmol/L，兩組不同病程患者中，硬骨素的血清濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）按年齡中位數(shù)33分為兩組：＜33歲組28例，男19例，女9例，平均硬骨素（62.2±20.5）pmol/L；≥33歲組30例，男19例，女11例，平均硬骨素（69.4±22.7）pmol/L。不同年齡組硬骨素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（4）按msASSS評(píng)分中值19.5分為兩組：＜19.5分組20例，男11例，女9例，平均硬骨素（64.8±19.1）pmol/L；＞19.5分組38例，男27例，女11例，平均硬骨素（66.5±23.2）pmol/L。不同評(píng)分AS患者硬骨素水平無顯著性差異（P＞0.05），但msASSS＜19.5分組r（msASSS與硬骨素）=0.8（明顯相關(guān)性），msASSS＞19.5分組r（msASSS與硬骨素）=0.7（明顯相關(guān)性）。

2.4 用ROC曲線確定血清硬骨素最佳臨界點(diǎn) 以健康對(duì)照和AS人群為分析人群，將所有可能的切點(diǎn)作為閾值進(jìn)行靈敏度和特異度計(jì)算后，以靈敏度為縱坐標(biāo)，（1-特異性）為橫坐標(biāo)作出ROC曲線。曲線下面積為0.687，P值為0.01，硬骨素的最佳臨界值為68.5pmol/L，其敏感性為61%，特異性為75%，說明硬骨素在AS骨化患者中有一定的診斷價(jià)值。

3 討論

Wnt蛋白是一類參與胚胎發(fā)生，器官發(fā)生，形態(tài)發(fā)生等過程的分泌性糖蛋白家族。Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled（卷曲蛋白）受體結(jié)合，引發(fā)不同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，Wnt信號(hào)通路調(diào)節(jié)的失?？梢鸲喾N病理變化。當(dāng)Wnt通路未啟動(dòng)時(shí)，β-連環(huán)蛋白與支架蛋白，腸腺瘤息肉蛋白，糖原合酶激酶3β（GSK-3β）形成降解復(fù)合物，促進(jìn)了β-連環(huán)蛋白的磷酸化，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白降解；當(dāng)Wnt蛋白與卷曲蛋白-低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）復(fù)合受體結(jié)合，Wnt信號(hào)通路啟動(dòng)，激活胞內(nèi)的Dvl（蓬亂蛋白），抑制GSK-3β的激活，使降解復(fù)合物失去活性，抑制了β-連環(huán)蛋白的磷酸化，β-catenin在胞內(nèi)累積，而后由胞漿進(jìn)入胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子轉(zhuǎn)錄因子家族成員結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［3］。近年對(duì)Wnt信號(hào)通路的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號(hào)通路與骨代謝有著密切的聯(lián)系。其一方面參與調(diào)節(jié)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，同時(shí)抑制其向脂肪細(xì)胞或軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖及分化；另一方面也可以抑制成骨細(xì)胞的程序性死亡，間接影響破骨細(xì)胞的功能。因此，Wnt信號(hào)通路在維持骨組織的平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，Wnt通路及其相關(guān)蛋白也已經(jīng)成為目前研究骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)疾病的熱點(diǎn)之一。

硬骨素是一種分泌型的富含胱氨酸的糖蛋白，由SOST基因編碼，是骨細(xì)胞特異性的蛋白質(zhì)，其由骨細(xì)胞分泌后通過微管轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合細(xì)胞膜上的LRP5/6受體，導(dǎo)致Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）的經(jīng)典激活途徑受阻，從而抑制成骨細(xì)胞增值﹑分化，抑制骨形成。試驗(yàn)表明，SOST基因敲除的小鼠骨骼的骨密度﹑骨小梁和皮質(zhì)骨的骨量均顯著增加；硬化性狹窄患者因硬骨素基因功能缺陷，骨量進(jìn)行性增加［4-5］。研究表明，硬骨素作為Wnt通路的調(diào)節(jié)蛋白，其在脊柱關(guān)節(jié)病患者血清中表達(dá)升高或是降低，是否與病程﹑疾病活動(dòng)度﹑骨贅形成與否等病變亞型進(jìn)一步相關(guān)，目前尚無統(tǒng)一的結(jié)論［6-9］。

本研究結(jié)果顯示，AS患者組血清硬骨素水平高于對(duì)照組，差異有顯著性；本研究還發(fā)現(xiàn)血清硬骨素水平與病程﹑年齡﹑性別﹑CRP﹑ESR﹑PGA﹑背痛時(shí)間﹑ASDAS均無明顯相關(guān)性，但與msASSS評(píng)分有明顯相關(guān)性（r=0.7），說明硬骨素在AS患者骨化中有明顯的促進(jìn)作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同性別患者硬骨素水平無明顯差異，但男性組msASSS評(píng)分與SOST明顯相關(guān)（r=0.7），女性組msASSS評(píng)分與年齡明顯相關(guān)（r=0.6），說明在女性患者中，年齡對(duì)骨化有一定的影響，可能與隨著年齡的增長(zhǎng)，雌激素水平下降導(dǎo)致骨代謝失衡有關(guān)。分別按病程﹑年齡﹑msASSS評(píng)分中位數(shù)分組，發(fā)現(xiàn)不同病程組患者中，硬骨素的血清濃度有明顯差異性，不同年齡組及不同msASSS評(píng)分組血清硬骨素水平無明顯差異。本研究采用ROC曲線分析方法確定硬骨素水平在AS診斷的價(jià)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，曲線下面積為0.687，P值為0.01，硬骨素的最佳臨界值為62.5pmol/L，其敏感性為61%，特異性為75%，說明硬骨素在AS骨化患者中有一定的診斷價(jià)值，但診斷準(zhǔn)確性為低等。

目前臨床上對(duì)AS骨化的評(píng)估主要依賴影像學(xué)表現(xiàn)，修訂后的斯托克AS脊柱評(píng)分mSASSS評(píng)分系統(tǒng)被認(rèn)為是目前評(píng)價(jià)AS韌帶骨化的最敏感有效的影像學(xué)指標(biāo)，mSASSS評(píng)分的高低與AS患者的韌帶骨化程度具有良好相關(guān)性，能較準(zhǔn)確地反映AS的骨化程度［10］。本研究表明msASSS與年齡﹑病程有明顯相關(guān)性，r均為0.6，說明AS患者韌帶骨化與年齡﹑病程呈線性相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)及病程的延長(zhǎng)，AS患者脊柱關(guān)節(jié)骨化加重；本研究檢測(cè)了AS組患者硬骨素水平，并觀察了其與放射學(xué)評(píng)分之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，血清硬骨素水平與msASSS評(píng)分有明顯相關(guān)性，但不同msASSS評(píng)分組血清硬骨素水平無顯著性差異?？傊?，本研究結(jié)果提示AS患者血清硬骨素水平作為一種新的反映骨化進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物有一定的價(jià)值，尤其在AS骨化病程早期（mSASSS低者相關(guān)性更高）。因此，AS患者硬骨素水平可能具有一定的診斷參考價(jià)值，同時(shí)作為AS脊柱骨化和新骨形成標(biāo)記物，還需進(jìn)一步大樣本深入研究。

［1］ 黃烽．強(qiáng)直性脊柱炎．北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:8-20．

［2］ Eisenmann DM．Wnt signaling．Worm Book,2005,25:1-17．

［3］ Rao TP, Kühl M． An updated overview on Wnt signaling pathways: a prelude for more．Circ Res,2010,106(12):1798-1806．

［4］ Ominsky MS,Vlasseros F,Jolette J,et al．Two doses of sclerostin antibody in cynomolgus monkeys increases bone formation,bone mineral density,and bone strength．J Bone Miner Res,2010, 25(5): 948-959．

［5］ Stolina M,Dwyer D,Niu QT,et al．Temporal changes in systemic and local expression of bone turnover markers during six months of sclerostin antibody administration to ovariectomized rats．Bone,2014,67C:305-313．

［6］ Ustun N,Tok F,Kalyoncu U,et al．Sclerostin and DKK1 in patient with ankylosing spondylitis．Acta Reumatol port,2014,39(2):146-151．

［7］ Rossini N,Viapiana O,Idolazzi L,et al．Higher level of Dickkopf-1 is associated with low bone mineral density and higher prevalence of vertebral fractures in patients with ankylosing spondylitis．Calcif Tissue Int,2016,98(5):1-8．

［8］ 謝建民,趙成．強(qiáng)直性脊柱炎患者血清硬骨素水平與放射學(xué)變化的相關(guān)分析．中華醫(yī)學(xué)雜志,2015,95(17):1300-1304．

［9］ 陳枝瓊,李向培,厲小梅,等．強(qiáng)直性脊柱炎患者血清中Dickkopf-1和硬骨素的表達(dá)及臨床意義．安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,48(6):671-674．

［10］ Ramire S,Van Tubergen A,Stolwijk C,et al．Scoring radiographic progression in ankylosing spondylitis: should we use the modified Stoke Ankylosing Spondylitis Spine Score(mSASSS)or the Radiographic Ankylosing Spondylitis Spinal Score(RASSS)? Arthritis Res Ther,2013,15(1):R14．

Objective To study the relationship between serum levels of sclerostin and spine heterotopic ossifi cation in patients with ankylosing spondylitis（AS）. Methods 58 outpatient cases with AS，25 with rheumatoid arthritis（RA） and 25 healthy controls were collected. Enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）was applied to detect the serum levels of sclerostin in different groups. Further analysis to identify the correlation between serum levels of sclerostin and imaging progression of spine were evaluated in AS group. Pearson correlation analysis was performed for statistical analysis. Results Serum levels of sclerostin in AS patients（65.9±21.7）pmol/L were signifi cantly higher than that of healthy controls［（51.2±25.7）pmol/L，P=0.0349］. There was positive correlation between serum sclerostin level and spine mSASSS score in AS patients（r=0.7），but without correlation with age，disease duration，AS disease activity scores and different genders（P＞0.05）. Conclusion Serum sclerostin level can be one of the useful indicators for diagnosis of AS，and may be a biological marker in imaging progression which can lead to evaluate the degree of spine ossifi cation in AS.

Ankylosing Spondylitis Ossifi cation Sclerostin

321000 浙江省金華市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科（田麗貞）310009浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（周美菊 張松照薛靜）

*通信作者