姚爽，王志慧，滕井勝，李春秋，張思瑤，邊秀東，張立春，郭東華

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院）

2014～2015年黑龍江牡丹江地區(qū)犬博卡病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查

姚爽1，王志慧1，滕井勝2，李春秋1，張思瑤1，邊秀東1，張立春1，郭東華1

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院）

為了調(diào)查黑龍江牡丹江地區(qū)犬博卡病毒流行情況，在2014年5月至2015年4月，在黑龍江牡丹江地區(qū)采集40份腹瀉犬的糞便拭子樣品，利用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定和混合感染檢測(cè)，進(jìn)一步做進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行分析。檢測(cè)結(jié)果顯示，在40份樣品中，8份樣品為CBoV陽(yáng)性（20%，8/40）；在8份CBoV陽(yáng)性樣品中，與CPV-2、CCoV、CaKV混合感染率分別為37.3%（3/8）、25%（2/8）、25%（2/8）。序列分析表明，8個(gè)CBoV毒株的NS1片段在核苷酸水平的同源性為94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性為91.7%～100%。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，與韓國(guó)、美國(guó)、德國(guó)和中國(guó)香港的CBoV毒株相比，8個(gè)中國(guó)CBoV毒株表現(xiàn)出遺傳多樣性。研究揭示了黑龍江牡丹江地區(qū)流行的CBoV毒株顯示出遺傳多樣性以及與其他腸道病毒的混合感染情況。

犬博卡病毒；混合感染；遺傳多樣性

博卡病毒（Bocaviruses）具有廣泛的哺乳動(dòng)物宿主范圍，包括人、牛、豬、大猩猩、黑猩猩、加利福尼亞海獅、犬、貓、蝙蝠和貂鼠[1-10]。博卡屬于細(xì)小病毒亞科（Parvovrinae），存在特殊的含有第三個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）NP1，博卡病毒基因組大小約5 kb左右，為單鏈線性DNA，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白和衣殼蛋白。博卡病毒能引起嚴(yán)重的下呼吸道感染和胃腸道癥狀，是人和多種動(dòng)物病毒性腹瀉的主要致病因素。大量研究顯示，在豬、犬、貓中鑒定了新型動(dòng)物博卡病毒，具有不同的遺傳進(jìn)化特性[6-7，10]。這些研究結(jié)果提示，不同宿主來(lái)源的博卡病毒也許具有高度的遺傳多樣性。因此，博卡病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，對(duì)該病毒遺傳演化的理解具有重要的意義。

在中國(guó)，人和豬的博卡病毒感染及遺傳演化已經(jīng)被報(bào)道[11-14]。然而，犬博卡病毒（canine bocavirus，CBoV）在中國(guó)流行情況和遺傳演化仍然不清楚，進(jìn)化分析是研究物種間親緣關(guān)系的一種方法[15]。鑒于此，研究對(duì)CBoV NS1基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)黑龍江牡丹江地區(qū)腹瀉犬糞便樣品的CBoV感染情況進(jìn)行調(diào)查，進(jìn)一步進(jìn)行了進(jìn)化性分析。研究的目的旨在揭示黑龍江牡丹江地區(qū)CBoV感染情況及遺傳演化特性，增加CBoV分子流行病學(xué)信息，為CBoV致病性相關(guān)研究提供基礎(chǔ)信息。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

采樣管（3.5 mL）購(gòu)自北京友康生物科技有限公司，基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，PCR預(yù)混酶、瓊脂糖（Agarose）、DNA Marker DL2000均購(gòu)自TaKaRa公司，axyprep膠回收試劑盒購(gòu)自吳江康寧生命科學(xué)有限公司。

1.2 樣品采集

2014年5月至2015年4月，利用病毒采樣管在黑龍江牡丹江地區(qū)某寵物醫(yī)院收集腹瀉犬的糞便拭子樣品，總計(jì)40份。將40份糞便拭子樣品按順序（1～40）標(biāo)記并分裝出1 mL，保存于-80℃冰箱備用。

1.3 NS1基因的引物設(shè)計(jì)

研究利用DNAMAN 6.0軟件，對(duì)Genbank中6 個(gè)CBoV病毒株（GenBank登錄號(hào)分別為JN648103、JQ692588、JQ692589、JQ692590、JQ692591和KF77-1828）的NS1基因序列進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，確定NS1基因保守區(qū)。根據(jù)GenBank中發(fā)布的CBoV全基 因 組 病 毒 株 HK880N（GenBank登 錄 號(hào)JQ692588），利用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，根據(jù)NS1基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，NS1-F：5' CTTCAGATGGTTCACATTAAGAT 3'（1 244 nt～1 266 nt），NS1-R：5'GGCAGYAGCTGAGAGTCTTT 3'（1 664 nt～1 683 nt），擴(kuò)增的目的片段大小為440 bp。引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 NS1基因的序列分析

取200 μL糞便拭子樣品按照北京天根生化科技有限公司基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA。并以提取的DNA樣品為模板，按照50 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：0.1 μM上游引物、0.1 μM下游引物、4 μL基因組DNA、25 μL PCR 2×Premix預(yù)混酶，用滅菌超純水補(bǔ)足50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 min，置4℃保存。然后將PCR陽(yáng)性產(chǎn)物用axyprep膠回收試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物使用Sanger方法測(cè)序，每個(gè)樣品重復(fù)三次。將所有序列遞交NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，它們的編號(hào)如下：KR998480、KR998481、KR998482、KR998483、KR998484、KR998485、KR998486和KR998487。

1.5 NS1基因的進(jìn)化樹(shù)分析

為了分析鑒定的CBoV毒株NS1基因分子進(jìn)化性，在Genbank中選取發(fā)表的CBoV NS1基因作為參考序列，利用MEGA 6.06軟件NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[16]。參考毒株的 Genbank登錄號(hào)如下：KP281715、KP281716、KP281717、KP281718、KP281719、KP281720、JQ692588、JQ692589、JQ692590、JQ692591、KF771828、JN648103、KC580640和AF495467。

1.6 其他犬腸道病毒的檢測(cè)

利用PCR或RT-PCR的方法篩查CBoV陽(yáng)性樣品中犬細(xì)小病毒2型（CPV-2）、犬冠狀病毒（CCoV）、犬星狀病毒（CaAstV）、犬諾瓦克病毒（CNoV）、犬嵴病毒（CaKV）和輪狀病毒A型（RV-A）的感染情況，從而獲得CBoV與其他犬腸道病原體的混合感染情況。

2 結(jié)果

2.1 CBoV的PCR檢測(cè)

以CBoV的NS1基因?yàn)榘谢?，通過(guò)PCR方法，對(duì)黑龍江牡丹江地區(qū)40份犬腹瀉糞便樣品進(jìn)行了檢測(cè)與分析。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，40份犬腹瀉糞便樣品中有8株CBoV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為20%。8株CBoV陽(yáng)性樣品中，CPV-2的陽(yáng)性率為37.3%（3/8），CCoV陽(yáng)性率為25%（2/8），CaKV陽(yáng)性率為25%（1/8）。序列分析顯示，8個(gè)CBoV毒株的NS1片段在核苷酸水平的同源性為94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性為91.7%～100%。

2.2 CBoV毒株進(jìn)化樹(shù)分析

利用MEGA 6.06軟件對(duì)研究鑒定的8株CBoV NS1基因片段（440 bp）分子進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，MDJ-15、MDJ-27、MDJ-21、MDJ-23形成一個(gè)單獨(dú)的亞群，MDJ-26、MDJ-17、MDJ-12、MDJ-13與韓國(guó)、香港、德國(guó)、美國(guó)參考株在一個(gè)分支上，其中MDJ-12、MDJ-13親緣關(guān)系很近，聚在一個(gè)單獨(dú)的分支上，MDJ-17、MDJ-26與韓國(guó)、香港、德國(guó)、美國(guó)參考株親緣關(guān)系較近，其中以與香港參考株關(guān)系為最近（圖1）。

表1 牡丹江地區(qū)CBoV毒株信息Table 1 Characteristics of the CBoV strains identified in Mudanjiang area

圖1 CBoV NS1基因進(jìn)化樹(shù)分析Fig.1 Evolutionary tree analysis of CBoV NS1 gene

3 討論

在過(guò)去幾年中，不同的博卡病毒毒株在動(dòng)物和人中的鑒定，在世界范圍內(nèi)引起了廣泛關(guān)注。在研究中，黑龍江牡丹江地區(qū)采集的患有腹瀉癥狀的40份犬糞便樣品中，CBoV的陽(yáng)性率為20%，高于之前Lau 等[6]報(bào)道的4.6%。通過(guò)與其他犬腸道病原體的篩查發(fā)現(xiàn)，在8份CBoV陽(yáng)性樣品中，CPV-2陽(yáng)性率為37.3%（3/8），CCoV陽(yáng)性率為25%（2/8），CaKV陽(yáng)性率為25%（2/8）。可見(jiàn)CBoV與其他犬腸道病原體有較高的混合感染情況，推測(cè)CBoV可能多以混合感染的形式致病。研究的數(shù)據(jù)提示CBoV作為一個(gè)潛在的腸道病原體可能與犬的病毒性腹瀉密切相關(guān)。

最近，新型博卡病毒株已經(jīng)在貓和犬中被報(bào)道[6，17]，在研究中，牡丹江地區(qū)8個(gè)CBoV毒株NS1基因序列分析表明，8株CBoV毒株NS1片段在核苷酸水平的同源性為94.2%～100%，在氨基酸水平的同源性為91.7%～100%。進(jìn)一步進(jìn)化樹(shù)分析顯示，8株CBoV毒株在進(jìn)化樹(shù)中被劃分到不同的分支，表現(xiàn)出遺傳多樣性。牡丹江地區(qū)CBoV毒株遺傳演化分析結(jié)果提示，CBoV在腹瀉犬糞便中可能以多種基因型存在。為了明確CBoV遺傳演化情況，CBoV廣泛的流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測(cè)是十分必要的。Bodewes等人[17]報(bào)道在健康犬體內(nèi)也能檢測(cè)到博卡病毒的存在，可見(jiàn)該病可能存在致病性上的差異，也可能與犬只日齡不同，抵抗力不同有關(guān)，這需要進(jìn)一步的研究確證。

4 結(jié)論

黑龍江省牡丹江地區(qū)腹瀉犬中CBoV毒株表現(xiàn)出遺傳多樣性，CBoV陽(yáng)性犬糞便中存在CPV-2、CCoV和CaKV混合感染。

［1］李建寧，姚青，孫玉寧.博卡病毒屬基因組特征與致病的分子機(jī)制［J］.微生物學(xué)報(bào)，2013，53（5）：421-428.

［2］Chen KC，Shull B C，Moses E A，et al.Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus［J］.Journal of Virology，1986，60（3）：1085-1097.

［3］王建科，芮萍，程悅寧，等.貉源犬瘟熱病毒昌黎株的分離鑒定及其H基因序列分析［J］.河北科技師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，29（3）：12-16.

［4］Sharp C P，LeBreton M，Kantola K，et al.Widespread infection with homologues of human parvoviruses B19，PARV4，and human bocavirus of chimpanzees and gorillas in the wild ［J］.Journal of Virology，2010，84（19）：10289-10296.

［5］Li L，Shan T，Wang C，et al.The fecal viral flora of California sea lions［J］.Journal of Virology，2011，85（19）：9909-9917.

［6］Lau S K，Woo P C，Yeung H C，et al.Identification and characterization of bocaviruses in cats and dogs reveals a novel feline bocavirus and a novel genetic group of canine bocavirus［J］.The Journal of General Virology，2012，93：1573-1582.

［7］Kapoor A，Mehta N，Dubovi E J，et al.Characterization of novel canine bocaviruses and their association with respiratory disease［J］.The Journal of General Virology，2012，93：341-346.

［8］Van den Brand J M，van Leeuwen M，Schapendonk C M，et al.Metagenomic analysis of the viral flora of pine marten and European badger feces［J］.Journal of Virology，2012，86（4）：2360-2365.

［9］Wu Z，Ren X，Yang L，et al.Virome analysis for identification of novel mammalian viruses in bat species from Chinese provinces［J］.Journal of Virology，2012，86（20）：10999-11012.

［10］Jiang Y H，Xiao C T，Yin SH，et al.High prevalence and genetic diversity of porcine bocaviruses in pigs in the USA，and identification of multiple novel porcine bocaviruses［J］.The Journal of General Virology，2014，95：453-465.

［11］周宇，唐連飛，朱事康.豬博卡病毒的研究進(jìn)展［J］.畜牧與獸醫(yī)，2014，46（11）：126-128.

［12］Liu M，Li Y，Sun D，et al.Detection and genetic analysis of porcine bocavirus in different swine herds in North CentralChina［J］.The Scientific World Journal，2014，94：7084.

［13］瞿小旺，漆正宇，段招軍，等.兒童急性呼吸道博卡病毒感染［J］.病毒學(xué)報(bào)，2006，22（2）：79-82.

［14］梁洪祥，許偉良.“高純度大豆低聚肽”對(duì)動(dòng)物血糖影響與LD50試驗(yàn)［J］.長(zhǎng)春大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，24（12）：1696-1698.

［15］常巧呈，鄭旭，段紅，等.基于核糖體18S和ITS2序列探討胰闊盤(pán)吸蟲(chóng)的分子進(jìn)化地位［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，27（4）：50-53.

［16］Tamura K，Stecher G，Peterson D，et al.MEGA6：Molecularevolutionary geneticsanalysisversion 6.0［J］. MolecularBiologyandEvolution，2013，30（12）：2725-2729.

［17］Bodewes R，Lapp S，Hahn K，et al.Novel canine bocavirus strain associated with severe enteritis in a dog litter［J］.Veterinary Microbiology，2014，174（1-2）：1-8.

Molecular Epidemiology Investigation of Canine Bocavirus in Mudanjiang Area of Heilongjiang Province from 2014 to 2015

Yao Shuang1，Wang Zhihui1，Teng Jingsheng2，Li Chunqiu1，Zhang Siyao1，Bian Xiudong1，Zhang Lichun1，Guo Donghua1
（1.College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Heilongjiang Agricultural Economy Vocational College）

To investigate the evolution of CBoV strains circulating in Northeast China，40 fecal samples from rectal swabs of diarrheic dogs collected from May 2014 to April 2015 in Mudanjiang area.PCR amplification method was used to identify co-infection detection and phylogenetic analysis.The PCR results indicated that 8 of the 40 fecal samples（20%）were positive for CBoV，co-infction of CPV-2，CCoV，and CaKV was 37.3%，25%，and 25%，respectively.Sequence analysis revealed that the partial NS1 genes of the 8 CBoV strains exhibited 94.2%～100%nucleotide identity，and 91.7%～100%amino acid identity.Phylogenetic analysis revealed that genetic diversity of the 8 CBoV strains from China compared with strains of CBoV from South Korea，the USA，Germany，and Hong Kong of China.The data revealed the presence of co-infection and genetic groups among the CBoV strains circulating in Mudanjiang area.

canine bocaviruses；co-infection；genetic diversity

S852.655

A

1002-2090（2016）05-0047-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.009

2016-03-19

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（YJSCX2015-Y28）。

姚爽（1991-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2014級(jí)碩士研究生。

郭東華，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：dh_guo@126.com。