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檢測牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

2017-01-11 08:22欒云艷林紅麗侯喜林
關(guān)鍵詞:布魯氏菌試管敏感性

欒云艷,林紅麗,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,大慶 163319)

檢測牛奶中布魯氏菌套式PCR方法的建立

欒云艷,林紅麗,侯喜林

(黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,大慶 163319)

為檢測牛奶中的布魯氏菌,通過對布魯氏菌外膜蛋白31 kDa的一段基因進行套式PCR擴增,建立從臨床奶樣中檢測布魯氏菌的方法。改進了奶樣中布魯氏菌基因組DNA的提取方法,通過正交試驗的方法優(yōu)化了套式PCR試驗的反應(yīng)條件,優(yōu)化后的一擴PCR反應(yīng)條件為:退火溫度56.4℃,Mg2+濃度1.5 mM,rTaq酶0.2 μL,引物0.3 μM,dNTP濃度0.2 mM;二擴PCR反應(yīng)條件為:退火溫度53.3℃,Mg2+濃度1.5 mM,rTaq酶0.25 μL,引物0.4 μM,dNTP濃度0.1 mM。其敏感性為8 CFU·mL-1,比細菌分離試驗敏感1 000倍;與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、隱秘桿菌和克雷伯氏菌均無交叉反應(yīng);與試管凝集試驗檢測布魯氏菌病的陽性符合率是100%,陰性符合率是86.36%。試驗建立的套式PCR方法可用于檢測奶樣中布魯氏菌。

布魯氏菌;套式PCR;奶樣;奶牛

布魯氏菌?。˙rucellosis)于1859年由Morston首次報道[1],是目前世界上流行最廣、危害最大的人獸共患病之一[2],給世界的畜牧業(yè)以及人類的健康帶來巨大的威脅,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)已將其列為需要通報的動物疫病,我國將其列為二類動物疫病[3]。

傳統(tǒng)的診斷方法有很多,包括平板凝集反應(yīng)、試管凝集反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)[4]等,上述方法均可檢測布魯氏菌病,而且操作較方便,但是敏感性不理想,實際臨床操作時往往需要多種方法結(jié)合應(yīng)用[9]。PCR技術(shù)[10]是快速、敏感的病原學診斷技術(shù),成為近年來的研究熱點。自1990年,F(xiàn)ekete等[5]最早利用PCR的方法擴增了布魯氏菌S19菌株的43 kDa蛋白的基因,并證實了他們研究的這種PCR方法擴增布魯氏菌外膜蛋白基因的特異性和敏感性以來,國內(nèi)外便有很多關(guān)于PCR方法的報道。2001年,Amin[15]等人用PCR方法對牛羊的精液樣品進行了檢測,證實了PCR方法遠比常規(guī)細菌分離技術(shù)敏感而快速;2007年,Stella Mitka等[14]通過用PCR的方法與細菌分離試驗、血清凝集試驗、補體結(jié)合試驗進行比較,證實了PCR方法已經(jīng)有超高的敏感性和特異性,并得出PCR是一種很有用的快速的檢測工具的結(jié)論。2008年,國內(nèi)的曹小安等[16]建立了檢測牛精液中布魯氏菌套氏聚合酶鏈式反應(yīng)檢測方法,該方法能夠應(yīng)用于感染布魯氏菌病后的病原分子生物學診斷。研究擬建立一種快速、準確的診斷患病牛奶樣中布魯氏菌病的套氏PCR方法,為在實際生產(chǎn)中通過檢測奶樣中布魯氏菌診斷布病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株

試驗菌株為S2型豬布魯氏菌疫苗株,購自內(nèi)蒙古金宇保靈生物藥品有限公司;參考菌株為牛布魯氏菌ha-1株,為實驗室分離自流產(chǎn)牛并鑒定保存。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、TaKaRa dNTPs、Buffer均購自寶生物工程(大連)有限公司、MERCK蛋白酶K,Sigma RNase A酶,瓊脂粉購自Spanish公司、CTAB/Na-Cl,SDS,葡萄糖,NET緩沖液,酚/氯仿/異戊醇以及其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 布魯氏菌基因組的提取

參照邱昌慶[6]和杜振昆[7]報道的方法,應(yīng)用CTAB/NaCl方法,并在此基礎(chǔ)上加以改進。提取布魯氏菌基因組[8]。

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)布魯氏菌的外膜蛋白(OMP)31 ku基因設(shè)計套氏PCR的引物,由北京華大基因科技技術(shù)有限公司合成,引物的序列如下:第一套引物,OMP1:5'-CTATGGCTGCCGACGTGGTTGTTT-3',OMP2:5'-CG GTGTAGAGGTATTCCGACTTGAGC-3',一擴后產(chǎn)物的預(yù)期片段大小為681 bp;第二套引物:OMP3:5'-GACAAGGAAGACAACGA-3',OMP4:5'-ATGGCATA TTCAGCACC-3',二擴后產(chǎn)物的預(yù)期片段大小是416 bp。

1.5 套式PCR擴增體系的優(yōu)化及循環(huán)參數(shù)

選擇正交試驗的方法,對套氏PCR的反應(yīng)條件進行優(yōu)化,正交實驗要素如下表:

表1 一擴PCR反應(yīng)體系正交試驗6因素5水平表Table 1 6 factors 5 levels of orthogonal test for the first PCR reaction system

表2 二擴PCR反應(yīng)體系正交試驗6因素5水平表Table 2 6 factors 5 levels of orthogonal test for the second PCR reaction system

根據(jù)以上兩個正交試驗的6因素5水平表格,可以設(shè)計出一個含有25組試驗的試驗方案,每組試驗都是不同因素不同水平的組合,套氏PCR的反應(yīng)參數(shù)如下:

一擴反應(yīng)體系采用25 μL體系,循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,退火1 min,72℃延伸1 min,35個循環(huán),最后72℃延伸10 min。

二擴反應(yīng)體系采用25 μL反應(yīng)體系,循環(huán)參數(shù)為:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 min,退火1 min,72℃延伸1 min,20個循環(huán),最后72℃延伸6 min。

分別取4 μL上樣進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠成像儀中觀察擴增結(jié)果。

1.6 敏感性試驗

對菌液進行細菌計數(shù),確定細菌數(shù)為8× 106CFU·mL-1,然后利用奶樣對菌液進行10倍連續(xù)稀釋,分別取1 mL進行基因組DNA提取和套式PCR擴增,產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像儀檢測擴增結(jié)果。

1.7 特異性試驗

對混有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、隱秘桿菌和克雷伯氏菌的奶樣與布魯氏菌參考菌株ha-1株奶樣一同進行DNA提取,并用上述最優(yōu)的套式PCR方法進行擴增,確定方法的特異性。

1.8 套式PCR方法與其他方法的符合性試驗

1.8.1 與細菌分離的符合性試驗

將菌液8×106CFU·mL-1用奶樣進行10倍連續(xù)稀釋后,分別取1 mL奶樣進行套式PCR檢測和細菌分離鑒定,細菌分離具體操作為:取1 mL帶菌奶樣于離心管中,10 000 rpm·min-1離心10 min,棄上清,取100 μL生理鹽水重懸沉淀,將混合物均勻涂于胰蛋白胨瓊脂平板上,放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,挑取單菌落制成抹片,用柯茲羅夫斯基染色法染色,鏡檢。

1.8.2 與試管凝集試驗的符合性試驗

實驗室低溫保存的采集自牛場的奶樣共60份,每份奶樣在采集時與之相對應(yīng)的血清樣品做了試管凝集試驗,其中有38份血清樣品的試管凝集試驗的結(jié)果為陽性,22份血清樣品的試管凝集試驗結(jié)果為陰性。將60份奶樣分別提取基因組,用研究中的套氏PCR進行檢測,最后查看試管凝集試驗和套氏PCR的符合性。

2 結(jié)果

2.1 PCR條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 套氏PCR一擴反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

0.156 5 Hz的狀態(tài)是直線塔和導、地線發(fā)生耦合振動,共振頻率為0.305 9 Hz,是耐張塔和導、地線發(fā)生耦合振動.與單塔模態(tài)分析的共振頻率相比,體系的耦合振動頻率明顯小很多.在對單塔的模態(tài)振動分析時,在前10階中沒有出現(xiàn)單塔的垂直向共振,說明在單塔模態(tài)時的垂直向1階共振頻率要高于水平向的2階共振頻率,但從塔-線體的耦合振動分析可以看出(見表3),垂直向的模態(tài)頻率為0.858 6 Hz時是小于2階橫向共振頻率0.958 8 Hz.由此說明,與單塔模態(tài)頻率相比,塔-線體系中單塔的垂直向共振頻率值比水平向共振頻率值降低得多.

由圖1試驗結(jié)果可以看出,第15組的目的條帶最亮,因此,選取第15組的PCR條件作為一擴反應(yīng)最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件,即退火溫度是56.4℃,Mg2+濃度是1.5 mM,酶是0.2 μL,引物是0.3 μM,dNTP濃度是0.2 mM。

圖1 套氏PCR一擴反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 The optimization PCR condition for the first primer sets

2.1.2 套氏PCR二擴反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

由圖2試驗結(jié)果可以看出,第19組目的條帶最亮,因此,選取第19組的PCR條件作為二擴反應(yīng)最優(yōu)的PCR反應(yīng)條件,即退火溫度是53.3℃,Mg2+濃度是1.5 mM,酶是0.25 μL,引物是0.4 μM,dNTP濃度是0.1 mM。

圖2 套氏PCR二擴反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果Fig.2 The optimization PCR condition for the second primer sets

2.2 敏感性試驗結(jié)果

應(yīng)用上述最優(yōu)的套式PCR方法進行的敏感性試驗檢測布魯氏菌的最少菌數(shù)為8 CFU·mL-1,結(jié)果見圖3。結(jié)果,當再加大稀釋倍數(shù)則不能檢測出陽性結(jié)果,而套式PCR的方法則能在奶樣被106倍稀釋時,即菌數(shù)為8 CFU·mL-1時,檢測出陽性結(jié)果,結(jié)果表明套式PCR檢測布魯氏菌比細菌分離方法敏感性高1 000倍。

圖3 套式PCR敏感性檢測Fig.3 Sensitivity test for the nested-PCR

2.3 特異性試驗結(jié)果

2.4 與細菌分離的符合性試驗結(jié)果

應(yīng)用套式PCR和細菌分離兩種方法檢測奶樣中布魯氏菌。結(jié)果顯示,細菌分離的方法在奶樣被103倍稀釋時,即菌數(shù)為8×103CFU·mL-1能檢測出陽性

圖4 特異性試驗Fig.4 Specificity test for the nested-PCR

2.5 與試管凝集試驗符合性試驗結(jié)果

應(yīng)用套式PCR方法檢測乳樣中的布魯氏菌,每份乳樣所對應(yīng)的牛血清用試管凝集試驗檢測,檢測結(jié)果見表3。結(jié)果顯示38份試管凝集試驗為陽性的奶樣,套氏PCR均為陽性,22份試管凝視試驗確定為陰性的奶樣中,套氏PCR檢測出3份陽性結(jié)果,19份陰性結(jié)果。建立的套氏PCR與試管凝集試驗檢測布魯氏菌病的陽性符合率是100%,陰性結(jié)果的符合率是86.36%。

表3 套式PCR和試管凝集試驗檢測布魯氏菌符合性試驗結(jié)果Table 3 Results of nested-PCR and tube agglutination test

3 討論與小結(jié)

(1)研究在邱昌慶[6]發(fā)表的奶牛布魯氏菌病PCR診斷技術(shù)的方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了提取DNA的步驟。應(yīng)用CTAB/NaCl方法,將蛋白酶K和RNaseA的終濃度都調(diào)整為600 μg·mL-1,共同作用2小時,這樣,一定程度的節(jié)省了成本,同時也節(jié)省了時間,提取DNA的效果好。

(2)對套式PCR條件進行了優(yōu)化,建立套氏PCR方法,反應(yīng)條件一定要優(yōu)化,它直接影響方法的特異性和敏感性。目前多數(shù)人選擇單因素變量法優(yōu)化PCR條件,2007年,楊蓮茹等[12]建立了檢測布魯氏菌病原的PCR方法,2015年,Mohsen Zamanian MSc 等[13]也用建立的PCR的方法對血液中的布魯氏菌進行了檢測。研究選擇了多因素正交試驗的方法,能夠?qū)τ绊慞CR結(jié)果的因素進行綜合的優(yōu)化,并對結(jié)果進行直觀的分析,優(yōu)化后套式PCR的敏感性可達8 CFU·mL-1,這種優(yōu)化方法的效率高,試驗設(shè)計科學,結(jié)果穩(wěn)定、可靠、敏感性好。

(3)細菌分離的方法仍然是確診布魯氏菌病的金標準,但是套式PCR試驗的敏感性比細菌分離的敏感性好很多,因為前者的檢測對象是細菌的染色體,受影響因素少,而細菌分離的結(jié)果受到存放條件、污染、操作人員技術(shù)和培養(yǎng)基等多因素影響,這些都會使細菌分離試驗的檢出率低。這與Stella Mitka[14]和Amin等[15]的結(jié)果一致。

(4)2007年,Stella Mitka等[14]對PCR的方法與血清凝集試驗進行比較研究,證實了PCR方法有超高的敏感性和特異性。研究應(yīng)用建立的套式PCR方法檢測農(nóng)場送檢的奶樣,并與奶樣對應(yīng)的血清樣本的試管凝集試驗進行比較。結(jié)果凝集試驗血清陽性樣本與對應(yīng)的奶樣的套式PCR檢測陽性結(jié)果100%符合,而從試管凝集試驗陰性結(jié)果的血清對應(yīng)的奶樣中PCR方法檢測出布魯氏菌的DNA片段,兩者的符合度達86.36%,說明套式PCR方法敏感性高于試管凝集試驗,這與Stella Mitka等的結(jié)果一致。此外,血清學方法中的ELISA方法也是具有高敏感性的一種檢測方法,但由于該方法不能夠?qū)⒁呙缰昱c田間毒株感染產(chǎn)生的抗體區(qū)分開來,所以,很多時候?qū)LISA方法應(yīng)用于對牛群的普查。

(5)研究建立的套式PCR方法快速、敏感、特異,能通過奶樣檢測布魯氏菌,可以很方便用于布魯氏菌病診斷。

[1]Mirnejad R M,Mohamadi M,Piranfar V,et al.A duplex PCR for rapid and simultaneous detection of Brucella spp. in human blood samples[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2013(6):453-456.

[2]Anne Mayer-Scholl,Angelika Draeger,Cornelia Gollner,et al.Adwancement of a multiplex PCR for the differentiation of all currently described Brucella species[J].Journal of Microbiological Methods,2010,80(1):112-114.

[3]Fabrizio De Massis,Giuliano Garofolo,Cesare Camma,et al.Genetic characterization of Brucella melitensis and Brucella abortus geographical clusters in Italy[J].Vet Ital,2015,51(3):225-233.

[4]孫婷婷,金京順,賈立軍.新孢子蟲與弓形蟲交叉抗原基因AMA 1的克隆及原核表達載體構(gòu)建[J].延邊大學農(nóng)學學報,2015(1):8-11.

[5]Fekete A,Bantle JA,Halling SM,et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction [J].Journal of Applied Bacteriology,1990,69(2):216-227.

[6]邱昌慶,曹小安,楊春華,等.乳牛布魯氏菌病病原DNA快速檢測技術(shù)的研究[J].中國獸醫(yī)科技,2005,35(2):85-89.

[7]杜振昆,郭軍慶,張妙仙,等.牛奶樣品布氏桿菌套式PCR檢測方法的建立[J].浙江大學學報,2008,34(2):169-174.

[8]C.Romero I,Lopez-Goni.Improved method for purification of bacterial DNA from bovine milk for detection of bucella spp.by PCR[J].Applied and Environmental Microbiology,1999(65):3735-3737.

[9]Anne,Praud,Olivier,et al.Evaluation of five serological tests for the diagnosis of porcine brucellosis in French Polynesia[J].Tropical Animal Health and Production,2013,45(4):931-933.

[10]王嵩,林紅麗,王宇鵬,等.牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學學報,2014,26(3):26-29.

[11]Betsy J,Bricker.PCR as a diagnostic tool for brucellosis [J].Veterinary Microbiology,2002(90):435-446.

[12]楊蓮茹,烏倫吉如嘎,王建明,等.奶牛布魯氏菌病病原PCR檢測方法的建立[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學學報,2007,28(2)1-5.

[13]Mohsen Zamanian MSc,Gholam Reza Hashemi Tabar,Mehrnaz Rad,et al.Evaluation of Different Primers for Detection ofBrucella in Human and Animal Serum Samples by Using PCR Method[J].Arch Iran Med,2015,18(1):44-50.

[14]Stella M,Constantine A,Efimia S,et al.Evaluation of different PCR Assays for Early Detection of Acute and Relapsing Brucellosis in Human in Comparison with Conventional methods[J].Journal of Clinical Microbiology,2007,45(4):1211-1218.

[15]Amin A S,Hamdy M E,Ibrahim A K.Detection of Brucella melitensis in semen using the polymerase chain reaction[J].Vet Micribiol,2001,83(1):37-44.

[16]曹小安,邱昌慶,周繼章,等.Nested-PCR試劑盒檢測牛精液中的布魯氏菌DNA[J].中國人畜共患病學報,2008,24(2):137-139.

Establishing the Method to Test Bacterium Burgeri in Milk Using Nested Polymerase Chain Reaction Assay

Luan Yunyan,Lin Hongli,Hou Xilin
(College of Animal Science and Technology,Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319)

In order to detect Bacterium burgeri in clinical milk samples,the nested PCR for Omp31 gene was established.The extraction method of the genomic DNA of Bacterium burgeri was improved and the nested PCR reaction sets were optimized by orthogonal test.The first optimized PCR reaction condition:annealing temperature 56.4℃,Mg2+concentration 1.5 mmol·L-1,the rTag DNA polymerase 0.2 μL,Primer 0.3 uM,dNTP concentration 0.2 mM.The second PCR optimization condition:annealing temperature 53.3℃,Mg2+concentration 1.5 mmol·L-1,the DNA polymerase 0.25 μL,Primer 0.4 uM and dNTP concentration 0.1 mM.The sensitivity of nested PCR was 8 CFU·mL-1which was 1 000 times higher than bacterial isolate method.The specificity test showed that there was no cross reaction with Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Yeast,Bacillus and Klebsiella.Compared with test tube agglutination,the positive coincidence rate was 100%and the negative coincidence rate was 86.36%.This nested PCR assay could be applied to detect the Bacterium burgeri in milk.

Bacterium burgeri;nested PCR;milk sample;dairy cow

S852.61

A

1002-2090(2016)05-0042-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.008

2015-12-08

國家科技計劃課題(2012BAD12B05-2)。

欒云艷(1988-),女,黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院2013級碩士研究生。

侯喜林,男,教授,博士研究生導師,E-mail:xly-hou@163.com。

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