樊磊，于長(zhǎng)青，姚笛，張明玉，李琳

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

植物乳桿菌Lp基因表達(dá)時(shí)內(nèi)參基因的選擇

樊磊，于長(zhǎng)青，姚笛，張明玉，李琳

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

實(shí)驗(yàn)以植物乳桿菌Lp為實(shí)驗(yàn)材料，用熒光定量PCR技術(shù)分析16S r RNA、Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas、L-lactate dehydrogenase以及recA protein四個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)情況。應(yīng)用兩種軟件geNorm和NormFinder程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在植物乳桿菌Lp中，穩(wěn)定值最小的是16S ribosomal RNA，用NormFinder軟件分析，穩(wěn)定值最小的也是16S ribosomal RNA。揭示16S ribosomal RNA適合做植物乳桿菌正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的內(nèi)參基因。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR；植物乳桿菌Lp；內(nèi)參基因

植物乳桿菌是一類(lèi)既古老又新穎重要的細(xì)菌，是一種革蘭氏陽(yáng)性菌。這類(lèi)細(xì)菌廣泛分布在自然界中，尤其在生物體內(nèi)分布較多[1]。由于這種廣泛分布的優(yōu)勢(shì)，人們獲得植物乳桿菌的途徑也增多，因此能更好的將植物乳桿菌應(yīng)用到人們的日常生活中。目前乳植物乳桿菌已被人們大規(guī)模應(yīng)用到日常生活中，在工業(yè)中尤其在食品工業(yè)中，植物乳桿菌發(fā)揮著很重要的作用。植物乳桿菌能夠促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，改善腸道菌群，因此作為助消化的乳酸菌可被做成乳酸菌素片以及助消化的其他類(lèi)藥物[2]。總之，乳植物乳桿菌與人類(lèi)生活息息相關(guān)，在人類(lèi)生活的各個(gè)領(lǐng)域有很好的應(yīng)用價(jià)值，受到人們的極大重視[3]。因此探究植物乳桿菌基因功能的研究迫在眉睫。

熒光定量PCR技術(shù)常用語(yǔ)基因表達(dá)的研究，該技術(shù)融匯了PCR技術(shù)的核酸高效擴(kuò)增，光譜技術(shù)的高敏感性記憶探針技術(shù)的高特異性等優(yōu)點(diǎn)[4]，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增過(guò)程中捕獲熒光信號(hào)的變換，來(lái)獲得定量的結(jié)果。這是PCR技術(shù)從定性到定量的一個(gè)質(zhì)的飛躍[5]。而且它的特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高，使用范圍也更加廣闊[6]。隨著熒光定量PCR技術(shù)的不斷進(jìn)步，該技術(shù)已經(jīng)逐步應(yīng)用到微生物領(lǐng)域中。在熒光定量PCR中，有兩種定量方法，一種是絕對(duì)定量，一種是相對(duì)定量[7]；絕對(duì)定量的宗旨是通過(guò)建立樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)得未知樣品的濃度，相對(duì)定量是選定一個(gè)常用的內(nèi)參基因做基準(zhǔn)，把目的基因與內(nèi)參基因的比值作為結(jié)果進(jìn)行比較。所以選擇一個(gè)內(nèi)參基因?qū)τ谘芯炕虮磉_(dá)是很重要的。熒光定量PCR需要有作為校準(zhǔn)的內(nèi)參基因[8]，經(jīng)過(guò)大量的研究表明，沒(méi)有表達(dá)絕對(duì)穩(wěn)定的基因，任何一種內(nèi)參基因的恒定表達(dá)都只是在一定的細(xì)胞內(nèi)或者是規(guī)定的實(shí)驗(yàn)條件下[9]。所以在進(jìn)行熒光定量PCR前選擇一個(gè)合適的內(nèi)參基因是十分必要的通過(guò)大量的研究，發(fā)現(xiàn)適合做植物乳桿菌的內(nèi)參基因有 16S rRNA、rpoA、gyrB、GAPDH、Ldh、Actin、recA等，實(shí)驗(yàn)選其中的 16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA作為候選基因來(lái)確定最適合做植物乳桿菌正常生長(zhǎng)狀態(tài)下表達(dá)的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 菌種

植物乳桿菌Lp由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

Trizol、DL-2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR定量試劑盒等購(gòu)自寶生物（大連）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

表1 內(nèi)參基因引物信息Table 1 The primer of four reference genes

1.3.2 總RNA提取

實(shí)驗(yàn)用Trizol法提取總RNA：8 000 r·min-1，4℃，5 min收集菌體細(xì)胞2 mL；倒入液氮研磨成粉狀，迅速加入1 mL Trizol，反復(fù)抽吸混勻菌體；12 000 r·min-1，4℃，10 min離心收集上清液；將上清液轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管，室溫靜置5 min；加入約0.2 mL的氯仿，用力搖15 s，室溫靜置3 min；120 000 r·min-1，4℃，離心15 min；將全部液體轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管，加入約0.5 mL異丙醇，室溫靜置10 min；120 000 r·min-1，4℃，離心10 min；棄去上清液，加入1 mL 75%乙醇混勻，7 500 r·min-1，4℃，離心5 min，棄去上清液，室溫放置10 min；30 μL RNase-free水重溶，60℃水浴10 min，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 cDNA的合成

為了避免RNA的降解，可迅速將瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證成功的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄利用PrimeScriptTM試劑盒進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)步驟如下：預(yù)先配制反應(yīng)體系為10 μL的混合液：dNTP Mixture （10 mM each）1 μL；Random 6mers（20 μM）1 μL；Template RNA 5 μL；RNase Free dH2O 3 μL。將上述體系置于PCR儀上進(jìn)行65℃，5 min的變性、退火反應(yīng)。將上述產(chǎn)物在Microtube管中配制成反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)體系20 μL：上述反應(yīng)液10 μL；5×Prime－ScriptTM Buffer 4 μL；RNase Inhibitor（40 U·μL-1）0.5 μL；PrimeScriptTM（for 2 Step）0.5 μL；RNase Free dH2O 5 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：30℃，10 min；42℃，30 min；95℃，5min；4℃。得到的cDNA樣本于-20℃保存。

1.3.4 內(nèi)參基因的普通PCR驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)選取4個(gè)內(nèi)參基因作為試驗(yàn)的候選基因，通過(guò)普通PCR驗(yàn)證在兩株植物乳桿菌中存在這4個(gè)內(nèi)參基因。

表2 普通PCR反應(yīng)體系Table 2 The ordinary PCR reaction system

將上述物質(zhì)混勻后放入PCR儀，設(shè)置PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，65℃退火30 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72℃，1 min。

1.3.5 內(nèi)參基因的RT-PCR

對(duì)驗(yàn)證成功的內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，以cDNA為模板，配制熒光定量PCR反應(yīng)體系，配制過(guò)程中要最后添加熒光染料，添加染料時(shí)要注意避光，盡量不要反復(fù)凍融，完全解凍后才能添加，保證染料的均勻。

表3 內(nèi)參基因PCR反應(yīng)體系Table 3 The reference gene of PCR reaction system

在小EP管中加入上述物質(zhì)，每個(gè)模板做三個(gè)重復(fù)。溶液配制過(guò)程在冰浴上進(jìn)行，將配置好的樣品放入熒光定量PCR儀中設(shè)置反應(yīng)條件為：95℃，30 sec預(yù)變性；95℃，5 sec，60℃，20 sec，40次循環(huán)；Melt Curve。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及軟件分析

用Excel2003計(jì)算熒光定量PCR所得到的Ct值，得到各基因的相對(duì)表達(dá)量。然后利用geNorm （http：//medgen.ugentbe/～jvdesomp/genorm）軟件分析各內(nèi)參的表達(dá)穩(wěn)定性，利用NormFinder軟件（http：// www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm）對(duì)各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)兩個(gè)軟件的相互配合確定最合適的內(nèi)參基因，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的校正基因。

2 結(jié)果

2.1 植物乳桿菌總RNA的提取

植物乳桿菌Lp總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，條帶清晰完整23S RNA和16S RNA條帶清晰可見(jiàn)，經(jīng)Nanodrop ND-1 000檢測(cè)，樣品的OD260/ OD280比值為1.86，表明總RNA提取效果較好?？捎糜诤罄m(xù)的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。

圖1 植物乳桿菌Lp總RNA提取結(jié)果Fig.1 Total of RNA extraction of lactobacillus plantarum Lp

2.2 內(nèi)參基因的普通PCR驗(yàn)證

內(nèi)參基因的普通PCR驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖2條帶1、2，3、4，5、6，7、8分別是16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA四種內(nèi)參基因在植物乳桿菌Lp中的表達(dá)，可以看出4種內(nèi)參基因都有條帶，目的條帶清晰可見(jiàn)，片段大小符合所設(shè)計(jì)的大小，說(shuō)明驗(yàn)證成功，可進(jìn)行后續(xù)的熒光定量PCR。

圖2 內(nèi)參基因在植物乳桿菌Lp中的PCR擴(kuò)增Fig.2 The PCR amplification of reference genes in lactobacillus plantarum Lp

2.3 內(nèi)參基因的熔解曲線

圖316 S rRNA熔解曲線Fig.3 The melting curve of 16s rRNA

圖4 GAPDH熔解曲線Fig.4 The melting curve of GAPDH

圖5 Ldh熔解曲線Fig.5 The melting curve of Ldh

圖6 recA熔解曲線Fig.6 The melting curve of recA

圖7 對(duì)照組Fig.7 The control group

從上述圖中可以看出，各內(nèi)參基因在熒光定量PCR時(shí)，都只產(chǎn)生單一的熔解峰，樣品間的曲線重復(fù)性好，而作為參照的未加入模板的無(wú)任何信號(hào)產(chǎn)生。通過(guò)上述結(jié)果，說(shuō)明引物設(shè)計(jì)的特異性良好，熒光定量PCR反應(yīng)的特異性高，結(jié)果精確可靠。

2.4 geNorm軟件和NormFinder軟件分析結(jié)果

圖8 geNorm軟件分析植物乳桿菌Lp各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Fig.8 The stable expression of each reference gene of lactobacillus plantarum Lp value by geNorm

在4個(gè)備選內(nèi)參基因中想要得到其中較為穩(wěn)定的作為內(nèi)參基因，利用geNorm軟件對(duì)四個(gè)內(nèi)參基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，以植物乳桿菌Lp的cDNA為模板的情況下，得到的結(jié)果如圖8。在植入乳桿菌Lp中，16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定的平均值依次為0.236、0.485、1.032、0.536，表達(dá)穩(wěn)定性排序即為 16S rRNA＞GAPDH＞recA＞Ldh；用NormFinder軟件進(jìn)行分析，在植物乳桿菌Lp中，各內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值最小的為16S rRNA。

通過(guò)geNorm和NormFinder對(duì)四個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果都證明，在兩株菌中16S rRNA的表達(dá)穩(wěn)定值最小，Ldh的穩(wěn)定值最大。穩(wěn)定值越小，內(nèi)參基因越穩(wěn)定，因此可選擇16S rRNA作為熒光定量PCR的內(nèi)參基因。

表4 NormFinder軟件分析各內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值Table 4 The expression stability values of the reference genes calculated by NormFinder

3 討論

對(duì)目的基因進(jìn)行熒光定量PCR前，需要進(jìn)行內(nèi)參基因的選擇。內(nèi)參基因的選擇通常需要遵循一些原則。如：內(nèi)參基因在不同類(lèi)型的細(xì)胞、組織中的表達(dá)量是相對(duì)穩(wěn)定的；目的基因與內(nèi)參基因的表達(dá)量應(yīng)接近且內(nèi)參基因應(yīng)該呈中度表達(dá)；內(nèi)參基因應(yīng)為真基因，在細(xì)胞中均能夠穩(wěn)定表達(dá)。實(shí)驗(yàn)選擇植物乳桿菌中常用的四個(gè)內(nèi)參基因16S rRNA、GAPDH、Ldh、recA作為候選基因。對(duì)候選基因進(jìn)行熒光定量PCR，通過(guò)兩個(gè)軟件geNorm和NormFinder對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。geNorm軟件是通過(guò)計(jì)算基因的表達(dá)穩(wěn)定值M對(duì)基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序，M值越小，表明穩(wěn)定性越高。NormFinder軟件與geNorm的不同之處是，它可以綜合計(jì)算內(nèi)參基因在同組內(nèi)及不同組間的表達(dá)穩(wěn)定性。兩個(gè)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理后得到的結(jié)果顯示16S rRNA的穩(wěn)定值最小，所以16S rRNA在兩株植物乳桿菌中最適合做內(nèi)參基因。通過(guò)兩種軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析能夠排除一個(gè)軟件分析的獨(dú)斷性，得到的結(jié)果更有說(shuō)服力。

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Reference Gene Selection of Gene Expression in Lactobacillus Plantarum Lp

Fan Lei，Yu Changqing，Yao Di，Zhang Mingyu，Li Lin
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The fluorescence quantitative PCR was used to detect the gene expression level of four genes（16S rRNA，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenas，L-lactate dehydrogenase and recA protein）in Lactobacillus plantarum Lp.The experimental results were analyzed with two kinds of software geNorm and NormFinder program.The result showed that the stable minimum value was 16s rRNA in the two software.16s rRNA was suitable for the reference gene in Lactobacillus plantarum Lp.

real-time fluorescence quantitative PCR；Lactobacillus plantarum Lp；reference gene

Q78

A

1002-2090（2016）05-0051-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.010

2015-03-10

黑龍江省自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目資助（ZD201207）；黑龍江省博士后專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助（LBH-Q13133）。

樊磊（1989-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

于長(zhǎng)青，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：spxypjb@126.com。