王國保，沈群弟

（浙江省紹興市第七人民醫(yī)院，紹興 312000）

·論著·

尋常型銀屑病患者檢測分泌型磷脂酶A2－ⅡA的意義

王國保，沈群弟

（浙江省紹興市第七人民醫(yī)院，紹興 312000）

目的探討分泌型磷脂酶A2－ⅡA（sPLA2－ⅡA）的表達(dá)與銀屑病皮損發(fā)病的關(guān)系。方法 依據(jù)PASI評(píng)分將銀屑病患者40例分為3組，輕度組12例，中度組14例，重度組14例。非銀屑病對(duì)照組患者35例。免疫組化法檢測銀屑病患者皮損組織和對(duì)照組健康人群組織切片中sPLA2－ⅡA表達(dá)情況。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）檢測銀屑病患者皮損組織和對(duì)照組皮膚組織sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 對(duì)照組sPLA2－ⅡA表達(dá)陽性率5．7%（2/ 35），銀屑病患者皮損組織中陽性率90%（36/40），2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53．05，P＜0．01）。銀屑病皮損組織比對(duì)照組皮膚組織中sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)升高，2組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=15．98，P＜0．01）。銀屑病患者輕度組、中度組和重度組sPLA2－ⅡA表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14．62～24．93，P＜0．01），且sPLA2－ⅡA表達(dá)與PASI評(píng)分成顯著的正相關(guān)（rs=0．87，P＜0．01）。3組間sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33．47，P＜0．01），即銀屑病患者皮損嚴(yán)重度加大即PASI評(píng)分越高，sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)越顯著。3組之間兩兩比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=6．37～11．74，P＜0．01）。結(jié)論 sPLA2－ⅡA可能是銀屑病發(fā)病的靶標(biāo)。

分泌型磷脂酶A2－ⅡA；銀屑??；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

銀屑?。≒soriasis，PS）是一種多基因遺傳的慢性免疫性皮膚病，其病因發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未闡明其發(fā)病機(jī)制[1]。近年來磷脂酶在促炎癥中的作用引起關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)分泌型磷脂酶（Secretory phospholipase A2，sPLA2）作為磷脂酶超家族重要成員之一與銀屑病皮損的發(fā)生關(guān)系密切[2]。特別其亞型sPLA2－ⅡA在銀屑病患者表皮的表達(dá)顯著高于正常人群[3]。故本研究以尋常型銀屑病患者為研究對(duì)象，觀察sPLA2－ⅡA在患者皮損組織中表達(dá)的變化，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本院門診收治的尋常型銀屑病皮損患者40例作為疾患組，其中男21例，女19例，年齡21～78歲，平均（45．2±5．3）歲。同時(shí)選取無銀屑病的健康體檢者35例作為對(duì)照組，其中男18例，女17例，年齡25～75歲，平均（46．2±4．9）歲。2組差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0．034 1，P＜0．05）?；颊吒鶕?jù)銀屑病患者皮損面積及病變嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI評(píng)分）分為輕度組12例（PASI≤24），中度組14例（PASI為24～48），重度組14例（PASI≥48）[4]。對(duì)照組織標(biāo)本來自外科手術(shù)軀干或四肢部位的正常組織。標(biāo)本部分留取制蠟塊切片，余下液氮凍存待進(jìn)行相關(guān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 sPLA2－ⅡA引物(上海生工生物公司)；sPLA2－ⅡA單克隆抗體（Cayman Chemical公司）；免疫組化試劑盒（中杉金橋公司）；基因提取和擴(kuò)增試劑盒（大連寶生物公司）；SunRise RC酶標(biāo)儀；HydroFlex洗板機(jī)（奧地利TECAN公司）；Olympus IX70顯微鏡（日本Olympus）；凝膠成像儀（美國Kodak公司）。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測尋常型銀屑病患者皮損和對(duì)照組皮膚標(biāo)本中sPLA2－ⅡA的表達(dá) 皮損處用4 mm環(huán)鉆常規(guī)取材，標(biāo)本置10%福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟最后行免疫組化染色。染色后的切片在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。結(jié)果判定以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。采用雙盲法統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯微鏡下每張切片隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野（×400），計(jì)算每個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，陽性細(xì)胞為0定為陰性（－），陽性細(xì)胞1%～10%為輕度陽性（+）；陽性細(xì)胞11%～49%為中度陽性（++），陽性細(xì)胞≥50%為強(qiáng)陽性（+++）。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測sPLA2－ⅡA表達(dá) ①RNA提取及cDNA合成 按照基因提取試劑操作說明進(jìn)行。提取物溶入DEPC水，分裝低溫保存?zhèn)溆?。②引物設(shè)計(jì)合成 sPLA2－ⅡA表達(dá)所需的引物序列上游為：5’－CCATGGAATTTGGTGAATT TCCAC－3’下游為：5’－GAATTCTTAGCAACGAGG GGTGCT－3’。③聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增sPLA2－ⅡA mRNA PCR反應(yīng)體系50 μL：5×buffer 5 μL，Mg2+5 μL，dNTP 4 μL，TaqMen 2 μL，目的基因和β－actin上下游引物各1 μL，ample 2 μL，dH2O 28．0 μL；反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃5 s，60℃50 s，50個(gè)循環(huán)后72℃延伸5 min。④測定經(jīng)密度掃描儀測定計(jì)算OD比值（sPLA2－ⅡA/β－actin）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所用數(shù)據(jù)資料用SPSS 11．0軟件進(jìn)行處理，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病患者皮損和對(duì)照組皮膚組織中sPLA2－ⅡA表達(dá) 對(duì)照組正常皮膚組織切片sPLA2－ⅡA僅表達(dá)陽性率（+）為5．7%（2/35），而尋常型銀屑病皮損患者sPLA2－ⅡA表達(dá)的陽性率為90%（36/40），其中陽性率（+）～（+++）分別為40%（16/40），15%（6/40）和35%（14/40）。2組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 53．05，P＜0．01）。尋常型銀屑病皮損患者的角質(zhì)層細(xì)胞sPLA2－ⅡA表達(dá)很低，主要在真皮層中高表達(dá)，真皮乳頭血管周圍細(xì)胞漿中可見棕黃色顆粒，見圖1。

圖1 銀屑病皮損和對(duì)照組皮膚組織sPLA2-ⅡA表達(dá)

2.2 銀屑病患者sPLA2－ⅡA表達(dá)與PASI評(píng)分關(guān)系 依據(jù)PASI評(píng)分重度組sPLA2－ⅡA表達(dá)（+++）陽性率為85．71%，（++）陽性率為14．29%。中度組sPLA2－ⅡA表達(dá)（+++）陽性率為14．29%，（++）陽性率為28．57%，（+）陽性率為57．14%。輕度組sPLA2－ⅡA僅表達(dá)（+）陽性率為66．67%。可見3組sPLA2－ⅡA表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=14．62～24．93，P＜0．01）。且sPLA2－ⅡA表達(dá)與PASI評(píng)分成顯著的正相關(guān)（rs=0．87，P＜0．01）。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT－PCR）擴(kuò)增sPLA2－ⅡA的mRNA 銀屑病皮損組織和對(duì)照組皮膚組織中sPLA2－ⅡA的mRNA（β－actin作為內(nèi)參照）RT－PCR產(chǎn)物電泳后置紫外分析儀下拍照。對(duì)照組皮膚組織幾乎無sPLA2－ⅡA表達(dá)，sPLA2－ⅡA/ β－actin比值（0．05±0．00），而銀屑病皮損組sPLA2－ⅡA高表達(dá)，比值（1．65±0．55），2組相比差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=15．98，P＜0．01），見圖2。

2.4 尋常型銀屑病患者不同病變組sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá) 銀屑病患者輕度組、中度組和重度組sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 33．47，P＜0．01）。輕度組sPLA2－ⅡA/β－actin比值（0．55±0．03），明顯低于中度組（1．39±0．02）和重度組（1．84±0．03）。3組之間兩兩比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=6．37～11．74，均P＜0．01）。即PASI評(píng)分越高，sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)越顯著。

圖2 （上）銀屑病皮損組和對(duì)照皮膚組sPLA2-AmRNA的RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳(下)銀屑病皮損組和對(duì)照皮膚組sPLA2-A/β-actin比值柱形圖

3 討論

銀屑病是免疫系統(tǒng)性疾病，外來的超抗原物質(zhì)刺激銀屑病患者機(jī)體免疫系統(tǒng)，特別是皮膚免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，導(dǎo)致皮膚炎癥細(xì)胞浸潤，表皮良性增生，皮膚周身可出現(xiàn)密集紅斑丘疹和表皮脫屑。在這一系列變化中，國外學(xué)者報(bào)道sPLA2各亞型表達(dá)不同所起的決定也不同[3]。文獻(xiàn)強(qiáng)調(diào)在sPLA2的十一種亞型中sPLA2－ⅡA與PS發(fā)病關(guān)系甚密。在過度增生的銀屑病上皮的角化細(xì)胞中sPLA2－ⅡA的表達(dá)升高，在銀屑病真皮中也檢測到sPLA2－ⅡA的高表達(dá)。在炎性皮膚表面，作為外源性酶sPLA2－ⅡA被加入后，可促進(jìn)皮膚表面前列腺素E2（PGE2）的形成。表明sPLA2－ⅡA與銀屑病炎性皮損的發(fā)生有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道通過免疫熒光定位sPLA2－ⅡA在銀屑病表皮下層特別是真皮層中強(qiáng)表達(dá)[3]。本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)sPLA2－ⅡA在真皮層中高表達(dá)，真皮乳頭血管周圍細(xì)胞漿中可見棕黃色顆粒。

sPLA2－ⅡA作用皮膚表面膜磷脂釋放亞油酸的同時(shí)誘導(dǎo)釋放花生四烯酸已得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可。一旦銀屑病皮損處磷脂酶活性升高即刻誘導(dǎo)一系列反應(yīng)發(fā)生[5]。因此表皮釋放花生四烯酸是導(dǎo)致銀屑病發(fā)病的重要事件。在銀屑病皮損處產(chǎn)生游離的花生四烯酸過程中sPLA2－ⅡA作用明顯。故尋求抑制sPLA2－ⅡA表達(dá)的手段是治愈銀屑病的新途徑。

本研究通過半定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)發(fā)現(xiàn)sPLA2－ⅡA的mRNA表達(dá)水平與尋常型銀屑病患者皮損的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。從組織學(xué)和分子生物學(xué)角度共同印證sPLA2－ⅡA可能是銀屑病發(fā)病的重要靶點(diǎn)。

[1] 于娟．銀屑病發(fā)病的研究進(jìn)展[J]．濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，33（4）: 296－298．

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Significance of Detection Secretory Phospholipase A2-ⅡA in Psoriasis Vulgaris Patients

Wang Guobao,Shen Qundi
Shaoxing No.7 People's Hospital,Shaoxing 312000,China

ObjectiveIn order to investigate relationship between the expression of secretory phospholipase A2－ⅡA (sPLA2－ⅡA)and the pathogenesis of psoriasis vulgaris lesions．MethodsAccording to psoriasis area severity index(PASI)，40 psoriasis vulgaris patients were divided into three groups:mild group(n=12)，moderate group(n=14)and severe group(n= 14)，and then compared with the non－psoriasis control group(n=35)．Psoriasis vulgaris patients and the normal control sPLA2－ⅡA level expressions were detected using immunohistochemistry methods．mRNA expression levels of sPLA2－ⅡA were detected by RT－PCR．ResultsThe expression rates of sPLA2－ⅡA in the control group and psoriasis lesion’s group were 5．7%and 90%respectively and displayed statistical significance（χ2=53．05，P＜0．01）．The mRNA expression of sPLA2－ⅡA in the psoriasis lesion's group was significantly higher than that in the healthy control（q=15．98，P＜0．01）．Among the three groups (mild group，moderate group and severe group)，there was significant difference in positive rates of sPLA2－ⅡA(χ2=14．62～24．93，P＜0．01)，which also displayed positive correlation with PASI（rs=0．87，P＜0．01）．The differences in mRNA expression of sPLA2－ⅡA were statistically significant（F=33．47，P＜0．01）．There was statistical significance（q=6．37～11．74，P＜0．01)among three groups．Conclusion sPLA2－ⅡA may be a target for psoriasis vulgaris diagnosis．

Secretory phospholipase A2－ⅡA;Psoriasis;Reverse transcriptase polymerase chain reaction

R758.63

A

1672－0709（2016）05－0270－03

2016－02－01）