翟慧娟，朱明明，楊廷桐

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院病理教研室，新鄉(xiāng) 453003）

·論著·

Integrin-β1與p53基因在皮膚發(fā)育過程中差異性表達(dá)

翟慧娟1，朱明明1，楊廷桐2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院病理教研室，新鄉(xiāng) 453003）

目的觀察不同發(fā)育時(shí)期人皮膚內(nèi)表皮干細(xì)胞的分布、增殖分化特征，并探討Integrin-β1與p53基因在皮膚發(fā)育過程中的差異性表達(dá)，以期為皮膚創(chuàng)傷的愈合提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。方法 分別采用組織的HE、IHC和RT－PCR方法檢測胎兒，少兒及成人皮膚中表皮干細(xì)胞在皮膚發(fā)育不同階段的分布特點(diǎn)，以及Integrin-β1和p53在不同時(shí)期的表達(dá)情況。結(jié)果隨著皮膚從胎兒、少兒到成人逐步發(fā)育成熟，表皮逐漸增厚，功能逐漸完善；Integrin-β1主要存在于皮膚基底部，其表達(dá)數(shù)量隨著年齡的增大逐漸減少；p53主要分布于皮膚基底層和中層，其數(shù)量隨著年齡的增大逐漸增加。RT－PCR顯示Integrin-β1與p53的基因表達(dá)與IHC表達(dá)趨勢一致，且胎兒與成人相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論隨著年齡的逐漸增大，皮膚表皮的結(jié)構(gòu)和功能日趨完善，Integrin-β1和p53在皮膚中的表達(dá)趨勢呈負(fù)相關(guān)，這可能與不同年齡階段皮膚損傷的修復(fù)方式不同有關(guān)。

皮膚；干細(xì)胞；分化；Integrin－β1；p53

表皮干細(xì)胞（Epidermal stem cells，ESCs）具有高度自我更新能力和終末分化特征，是皮膚修復(fù)外傷、感染等因素所致缺損的基礎(chǔ)。在胎兒、少兒以及成年人的皮膚發(fā)育成熟過程中，該細(xì)胞以不對稱分裂方式既保持了皮膚的自我更新，又維護(hù)了表皮的正常穩(wěn)態(tài)[1－2]。皮膚的完整性主要依賴于機(jī)體內(nèi)多基因之間的相互作用，通過其對細(xì)胞增殖、分化和凋亡的調(diào)控，維持皮膚的正常穩(wěn)態(tài)[3]。Integrin-β1和p53是表皮干細(xì)胞的主要標(biāo)記分子，但是其在皮膚動(dòng)態(tài)發(fā)育過程中的分布特點(diǎn)及作用卻鮮見報(bào)道[4]。本文重點(diǎn)研究了兩者與皮膚發(fā)育及分化之間的關(guān)系，以期為臨床皮膚創(chuàng)傷后的無瘢痕愈合提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 皮膚來源 皮膚分別來源于終止妊娠中期21周胎兒、12～16歲少兒和25～35歲成人，每組各取10例，均采取背部全層皮膚。標(biāo)本經(jīng)無菌取材后，一部分立即液氮凍存，用于RT－PCR檢測，另一份即刻用4%的甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，保存待測。該研究經(jīng)院方倫理委員會(huì)通過并征得家屬同意。

1.2 組織學(xué)觀察 石蠟切片（4 μm）脫蠟后用蘇木精－伊紅（HE）染色，在顯微鏡（Olympus，日本）下觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)。

1.3 免疫組化染色

1.3.1 試劑 鼠抗人單克隆抗體Integrin-β1、鼠抗人單克隆抗體p53和SP試劑盒均購于邁新公司。

1.3.2 染色 實(shí)驗(yàn)操作按試劑盒說明書進(jìn)行，組織切片脫蠟至水，3%H2O210 min，PBS洗3次，高壓鍋內(nèi)行抗原修復(fù)，滴加對應(yīng)一抗后4℃過夜，PBS洗3次，滴加二抗，37℃孵育30 min，PBS洗3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染；PBS為陰性對照。

1.3.3 組織學(xué)觀察 在400倍光鏡下觀察，Integrin-β1陽性為胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒，p53陽性為核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。每張玻片隨機(jī)選取5個(gè)視野，利用計(jì)算機(jī)圖像分析儀（LUSEX－F Japan）進(jìn)行灰度掃描，分別取其平均值，灰度值范圍0～255，灰度值越小，免疫組化的染色程度越高，即蛋白的表達(dá)量越多。

1.4 RT－PCR檢測基因表達(dá) 組織在液氮內(nèi)研磨后，TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA合格后按照RT－PCR試劑盒操作說明檢測Integrin-β1和p53基因表達(dá)。目的基因及內(nèi)參照β－actin引物見表1。反應(yīng)條件：94℃變性3 min；94℃3 s，60℃3 s，72℃3 s，延伸72℃10 min，30個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5 μL，1．5%瓊脂糖電泳后紫外光下掃描，凝膠圖像分析儀（UVPGDS800）測定目的基因表達(dá)，以目的基因灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的基因表達(dá)量。

表1 Integrin-β1、p53和β-actin的引物序列和目的片段長度

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，SPSS12．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用Student－Newman－Keul方法檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察 妊娠中期胎兒（21周）皮膚增至4層，表皮呈扁平狀，真皮內(nèi)汗腺，毛囊，皮脂腺結(jié)構(gòu)已經(jīng)形成，但尚未完全成熟，血管少，真皮層疏松。少兒（12～15歲）皮膚表皮由多層扁平上皮組成，上皮腳與真皮乳頭相互交錯(cuò)，真皮層內(nèi)膠原纖維排列整齊，汗腺，毛囊，皮脂腺結(jié)構(gòu)成熟，數(shù)量明顯增多，血管增多，形態(tài)完整成熟。成人（25～35歲）皮膚表皮有復(fù)層扁平上皮組成，較少兒層次增厚，明顯角化?；讓觾?nèi)色素較少兒增多，上皮腳形成犬齒狀與真皮交錯(cuò)排列，真皮內(nèi)汗腺，毛囊，皮脂腺排列有序，形態(tài)結(jié)構(gòu)功能均正常，血管散在。結(jié)果見圖1。

圖1 不同時(shí)期的皮膚結(jié)構(gòu)（HE染色×200）

2.2 免疫組化染色 妊娠中期胎兒（21周）Integrin-β1主要在基底層中彌漫性高表達(dá)，p53幾乎不表達(dá)。少兒（12～16歲）時(shí)Integrin-β1主要在基底層中斷續(xù)性的表達(dá)，p53灶狀性少量表達(dá)。成人（25～35歲）時(shí)Integrin-β1主要在基底層中呈現(xiàn)灶狀性的低表達(dá)，p53在底中層散在性表達(dá)。結(jié)果見表2，圖2。

表2 不同組別中免疫組化的表達(dá)情況 （s）

表2 不同組別中免疫組化的表達(dá)情況 （s）

注：aP＜0．05與少兒和成人相比。

組別胎兒少兒成人Integrin-β1p53 98．4±6．5a162．6±4．5a142．3±2．5 112．7±3．5 176．6±3．5 86．5±1．5 n 10 10 10

2.3 RT－PCR檢測基因表達(dá) 在妊娠中期胎兒（21周）中Integrin-β1mRNA呈現(xiàn)高表達(dá)量，與少兒（12～16歲）和成人相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)義，（P＜0．05）；但是胎兒p53 mRNA表達(dá)量較低，與少兒和成人相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)義，（P＜0．05）。結(jié)果見表3，圖3。

表3 不同組別中RT-PCR檢測結(jié)果 （s）

表3 不同組別中RT-PCR檢測結(jié)果 （s）

注：aP＜0．05與少兒和成人相比。

組別Integrin-β1p53 n 10 10胎兒 少兒 成人0．169±0．03a0．118±0．01 0．051±0．02 0．042±0．03a0．122±0．03 0．156±0．03

3 討論

ESCs主要來源于胚胎外胚層，具有分化成為表皮各種細(xì)胞的潛能，屬于表皮組織中的專能干細(xì)胞，是進(jìn)行表皮干細(xì)胞研究的良好組織材料[5]。但迄今為止，不同年齡階段中ESCs的分布特點(diǎn)及變化規(guī)律尚不清楚，也少有文獻(xiàn)報(bào)道。p53抑癌基因是生物體內(nèi)一種抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞的基因，對于維持細(xì)胞正常生長、抑制惡性增殖起著重要作用。目前，國內(nèi)外比較公認(rèn)的干細(xì)胞標(biāo)記物有Integrin-β1，CK19，p63，PCNA，CD34等[6]。本研究通過探討ESCs在不同年齡階段中分布，及皮膚發(fā)育過程中ESCs的Integrin-β1與p53基因和蛋白差異性表達(dá)的臨床意義，揭示不同年齡組皮膚的形狀和代謝改變與這些蛋白和基因之間的關(guān)系[7－8]。

圖2 不同年齡皮膚組織Integrin-β1和p53表達(dá)（IHC SP染色×400）

圖3 RT-PCR電泳產(chǎn)物灰度結(jié)果

常規(guī)組織HE染色觀察證實(shí)從胎兒、少兒到成人皮膚的發(fā)育成熟過程中，皮膚由扁平到多層并伴有上皮腳形成且與真皮乳頭相互交錯(cuò)，出現(xiàn)明顯角化。皮膚真皮內(nèi)的汗腺、毛囊和皮脂腺結(jié)構(gòu)逐漸發(fā)育成熟和功能愈加完善，血管由少逐漸增多。不同年齡階段皮膚中均存在表皮干細(xì)胞[8]。

Integrin-β1屬于皮膚干細(xì)胞和短暫增殖細(xì)胞的陽性標(biāo)志物[9－10]。Integrin-β1在ESCs和短暫擴(kuò)增細(xì)胞表面呈高表達(dá)，而在終末分化的表面細(xì)胞不表達(dá)，是區(qū)分兩者的主要標(biāo)志物[11]。Integrin-β1受體在皮膚表皮中不僅對細(xì)胞的分化，增殖起重要作用，并對胞外基質(zhì)的黏附，生長起重要作用；同時(shí)也調(diào)節(jié)細(xì)胞終末分化，在基底細(xì)胞向上層移動(dòng)過程中有著重要的作用。免疫組化方法發(fā)現(xiàn)胎兒皮膚的基底細(xì)胞層高表達(dá)Integrin-β1，與成人組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RT－PCR方法結(jié)果與免疫組化一致。說明胎兒皮膚具有極強(qiáng)的增殖和修復(fù)潛能，同時(shí)也證明胎兒皮膚中存在著較多的干細(xì)胞和短暫擴(kuò)增細(xì)胞。另外研究也發(fā)現(xiàn)，在胎兒皮膚中p53蛋白與基因表達(dá)均極低，由于這兩種蛋白和基因的改變，調(diào)控皮膚細(xì)胞在這階段主要以增殖為主，從而來完成皮膚的形態(tài)結(jié)構(gòu)功能和附屬器的不斷完善，逐漸的趨于成熟，在這期間細(xì)胞很少出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。推測這可能是胎兒皮膚無瘢痕愈合機(jī)制之一[12－13]。

本研究提示從形態(tài)學(xué)的改變結(jié)合免疫組化和RT－PCR的方法檢測，表明ESCs參與皮膚的發(fā)育，分化，成熟全過程[14]，p53和Integrin-β1基因在調(diào)控皮膚的分化和保持細(xì)胞之間的相對平衡起著十分重要的作用。但是，ESCs與其他表皮細(xì)胞相互的調(diào)控機(jī)制如何，以何種方式激活干細(xì)胞并增加短暫擴(kuò)充細(xì)胞的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)皮膚形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，依然是今后研究的主要方向。

[1] 翟慧娟，楊廷桐．胎兒皮膚β1整合素與基質(zhì)金屬蛋白酶－2及其組織抑制因子－2表達(dá)的意義[J]．臨床皮膚科雜志，2008，37（11）：708－710．

[2] Demhri S，Kopan R．Notch signaling in bulge stem cells is not required for selection of hair follicle fate[J]．Development，2009，36: 891－896．

[3] Blanpain C，F(xiàn)uchs E．Epidermal homeostasis:a balancing out of stem cells in the skin[J]．Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10:207－217．[4] Jones PH，Watt FM．Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression[J]．Cell，1993，73:713－724．

[5] Dahl MV．Stem cells and the skin[J]．J Coset Dermatol，2012，11: 297－306．

[6] Balkwill F．The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4[J]．Semin Cancer Biol，2004，14:171－179．

[7] Yang GP，Lim IJ，Phan TT，et al．From scarless fetal wounds to keloids:molecular studies in wound healing[J]．Wound Repair Regen，2003，11:411－418．

[8] Chen W，F(xiàn)u XB，Ge S，et al．Ontogeny of expression of transforming growth factor－Beta and its receptors and their possible relationship with scarless healing in haman fetal skin[J]．Wound Repair Regen，2005，13:68－75．

[9] Inoue K，Aoi N，Sato T，et al．Differential expression of stem－cellassociated markers in human hair follicle epithelial cells[J]．Lab Invest，2009，89:844－856．

[10]Potten CS，Booth C．Keratinocyte stem cells:a commentary[J]．J Invest Dermatol，2002，119:888－899．

[11]賴麒，熊愛兵．表皮干細(xì)胞的生物學(xué)特性及應(yīng)用[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（36）:6813－6816．

[12]Williams SJ，Shynlova O，Lye SJ，et al．Spatiotemporal expression of alpha(1)，alpha(3)and beta(1)integrin subunits is altered in rat myometrium during pregnancy and labour[J]．Reprod Fertil Dev，2010，22:718－732．

[13]Cabodi S，Leal S，Mdel P，et al．Integrins and signal transdaction[J]．Adv Exp Med Biol，2010，674:43－54．

[14]Fuch E，Chen T．A matter of life and death:self－renewal in stem cells[J]．EMBO Rep，2013，14:39－48．

Differential Expression of Integrin-β1and p53 in Development Process of Skin

Zhai Huijuan1,Zhu Mingming1,Yang Tingtong2
1.the Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China;2.the Sanquan School Attached to Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China

ObjectiveIn order to observe the distribution characteristics of epidermal stem cells of human skin in different developmental stages，and the differential expression of Integrin-β1and p53 were investigated at the same time in order to provide the further theoretical basis of skin wound healing．MethodsThe distribution characteristics of epidermal stem cells were detdcted by HE staining．Meanwhile，IHC and RT－PCR were used to study the expression of Integrin-β1and p53 respectively．ResultsThe epidermis gradually became thicker and the function were gradually improving with the mature of skin from fetal to adult．The Integrin-β1mainly existed in the basal layer of the skin，and the expression gradually diminished with advancing age．The number of p53 which mainly distributed in the basal layer and the middle layer of the skin developed gradually with age．The expression trend of Integrin-β1and p53 obtained by the RT－PCR were consistent with IHC，and showed significant difference between fetal and adult(P＜0．05)．ConclusionThe structure and function of skin is becoming more and more perfect with age．The negative correlation of expression of Integrin-β1and p53 may be the main reason of the reconstructive method in different age stages of skin．

Skin;Stem cells;Differentiation;Integrin-β1;p53

R75

A

1672－0709（2016）05－0267－04

2015－12－23）

新鄉(xiāng)市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目；項(xiàng)目編號(hào)：09S034

楊廷桐，E-mail:yangtt@xxmu.edu.cn