王 川 綜述 肖苒曹 誼林 審校

組織工程皮膚血管化研究進展

王 川 綜述 肖苒曹 誼林 審校

血供對于皮膚的維持和移植至關(guān)重要，盡管組織工程皮膚已經(jīng)商業(yè)化并應(yīng)用于臨床，但仍未能很好地實現(xiàn)其血管化。目前，促進組織工程皮膚血管化主要是依靠促血管形成的種子細胞，以及多種生長因子的作用。隨著誘導(dǎo)多功能干細胞、靜電紡絲，以及生物打印技術(shù)的發(fā)展，也可以通過設(shè)計新型支架，并結(jié)合相應(yīng)的種子細胞和細胞因子，精確地模擬體內(nèi)生長環(huán)境，以促進組織工程皮膚的血管化。本文主要對近年來組織工程皮膚血管化的研究進展進行綜述。

皮膚組織工程血管形成干細胞細胞因子支架

組織工程皮膚的研究已取得了巨大的進展，目前已有多種商業(yè)化的組織工程皮膚應(yīng)用于臨床[1-2]。但是，這些產(chǎn)品大多是發(fā)揮及時覆蓋和促進創(chuàng)面愈合的作用，并不能滿足皮膚的全部功能[3]。完美的組織工程皮膚應(yīng)沒有毒性、不被人體排斥，具有正常的色澤、附屬器、血管以及神經(jīng)組織，并具有很好的柔韌性和一定的機械強度，能夠進行物質(zhì)和能量交換。組織工程血管化，特別是快速血管化問題，是制約皮膚組織工程發(fā)展的關(guān)鍵問題之一。目前，組織工程皮膚由于沒有血管結(jié)構(gòu)，其營養(yǎng)供應(yīng)主要依賴滲透作用，厚度受到一定的限制，當(dāng)移植皮膚厚度超過1.0 mm時，表皮層就不能夠很快得到血液供應(yīng)，進而發(fā)生部分表皮剝脫壞死[4]。促進血管形成和加快組織工程皮膚血管化的速度，一直都是皮膚組織工程研究的熱點。本文重點圍繞組織工程的三大要素：種子細胞、細胞因子、支架材料，闡述近幾年來組織工程皮膚血管化的一些新的研究進展。

1 新血管形成的兩種機制

一般認為，新血管形成（Neovascularization）的機制包括血管發(fā)生（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）兩個方面[5]。血管發(fā)生是指來源于骨髓的內(nèi)皮祖細胞逐步遷移和分化，進而重新形成新的血管。該過程是胚胎期形成復(fù)雜血管網(wǎng)絡(luò)的主要機制，但也可出現(xiàn)在成人組織中，特別是局部缺血的部位[6-7]。血管新生是指已存在的成熟血管，以生芽的方式逐步形成新的血管的過程，可以分為靜止期、激活期和決定期3個階段[5]。正常情況下，健康組織的血管處于靜止期，血管內(nèi)表面的內(nèi)皮細胞以方陣細胞的形式，緊密排列并形成屏障，以保證血液的流動；Ⅳ型膠原和層黏連蛋白構(gòu)成基底膜，基底膜被周皮細胞包覆并圍繞成熟的血管，保持血管的穩(wěn)定性和內(nèi)皮細胞的活性[8]。當(dāng)血管受到促血管形成因子的刺激后，內(nèi)皮細胞被激活，細胞間的緊密連接變得松散；同時，周皮細胞從血管外層分離，基質(zhì)金屬蛋白酶開始降解基底膜，為新血管的出芽提供通道；然后尖細胞作為一種特殊的內(nèi)皮細胞開始引導(dǎo)血管出芽，毗鄰的內(nèi)皮細胞，即莖細胞緊隨其后，不斷遷移和增殖來形成新的血管[5]。在血管新生的決定期，新生的血管芽將和臨近的血管芽相融合，然后建立血液灌注，而未形成血液灌注的血管芽將會消退，最后血管重新恢復(fù)到靜止期。

目前，血管新生被認為是創(chuàng)傷愈合過程中新血管形成的主要方式，這也是皮膚修復(fù)過程中血管化的主要研究方向。然而，在切割傷口和缺血皮瓣中，骨髓來源的細胞亦能夠?qū)е卵馨l(fā)生[7，9]，雖然血管發(fā)生在正常創(chuàng)傷愈合過程中的臨床重要性還不清楚，但仍值得我們深入研究。

2 組織工程皮膚血管化的構(gòu)建方法

目前，促進組織工程皮膚血管化的研究主要集中于：①通過種子細胞與支架結(jié)合，在體外構(gòu)建血管結(jié)構(gòu)，促進血管形成；②通過使用各種細胞因子，以及基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，促進組織工程皮膚的血管化；③通過設(shè)計新型支架來促進血管的長入，進而加速組織工程皮膚的血管化進程。

2.1 使用能夠促進血管化的種子細胞

內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血管的基本組分之一，目前使用細胞來促進組織工程皮膚血管化的大部分方法，都直接或間接地使用了內(nèi)皮細胞。Trembley等[10]使用內(nèi)皮細胞構(gòu)建了含有毛細血管樣結(jié)構(gòu)的組織工程真皮，將其移植到裸鼠創(chuàng)面，其與裸鼠組織結(jié)合只需要4 d，而對照組則需要14 d。雖然內(nèi)皮細胞來源豐富，然而其增殖率和利用率較低，限制了它的應(yīng)用。內(nèi)皮祖細胞是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，自從1997年發(fā)現(xiàn)成人內(nèi)皮祖細胞以來[11]，相關(guān)研究就應(yīng)用內(nèi)皮祖細胞開展了大量的實驗來促進血管形成。Zhang等[12]將來自于大鼠心臟血管組織的血管內(nèi)皮祖細胞，與Integral matrix結(jié)合后，移植于裸鼠背部全層皮膚缺損處，其血管化程度明顯高于對照組。

此外，各種干細胞在皮膚再生、創(chuàng)傷愈合等方面也起到很重要的作用[13]，在一定程度上能夠促進皮膚的血管化。Danner等[14]在支架上接種人汗腺干細胞，然后移植到裸鼠背部全層皮膚缺損上，結(jié)果顯示，接種人汗腺干細胞的支架材料血管化程度明顯高于對照組。脂肪干細胞聯(lián)合脫細胞真皮基質(zhì)（ADM）也能促進血管形成，加速裸鼠全層皮膚缺損的愈合[15]。Klar等[16]將脂肪基質(zhì)血管組分（svf）中的細胞與纖維蛋白凝膠結(jié)合培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程皮膚，并移植于免疫缺陷大鼠背部，發(fā)現(xiàn)其血管化程度明顯高于對照組。Kim等[17]使用人誘導(dǎo)多功能干細胞分化為內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，然后注射到裸鼠背部全層皮膚缺損周圍，發(fā)現(xiàn)能促進血管形成，進而促進創(chuàng)面愈合。

2.2 應(yīng)用各種細胞因子促進血管化

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、肝細胞生長因子（HGF）、血小板源性生長因子（PDGF）等多種生長因子，都具有很強的促進血管形成的作用，能夠直接或間接地激活內(nèi)皮細胞，并促進其遷移，進而導(dǎo)致新血管的形成和成熟[18]。在組織工程皮膚中添加各種生長因子，以促進血管形成，是一種簡便的方法。但各種生長因子降解周期較短，難以維持穩(wěn)定的生長環(huán)境，直接應(yīng)用于體內(nèi)還可能導(dǎo)致不可預(yù)料的后果。為了使各種生長因子能夠穩(wěn)定持續(xù)地在組織工程皮膚中發(fā)揮促血管形成作用，有研究應(yīng)用各種生物材料的緩釋系統(tǒng)，使生長因子在體內(nèi)定時、定量釋放，以刺激新生血管的形成。Hosseinkhani等[19]發(fā)現(xiàn)，可注射水凝膠包裹bFGF能夠促進小鼠皮膚血管化。此外，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠?qū)⒈磉_特定的生長因子的基因，轉(zhuǎn)染到特定的細胞中，從而使轉(zhuǎn)染后的細胞穩(wěn)定持續(xù)表達相應(yīng)的生長因子。Han等[20]將VEGF基因轉(zhuǎn)染人臍靜脈間充質(zhì)細胞，然后混合到組織工程真皮中，并用于修復(fù)小型豬背部皮膚缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF表達增加，并且組織工程真皮血管化程度明顯提高。

近年來，在組織工程皮膚方面，對MicroRNAs也進行了大量的研究[21]。MicroRNAs能夠通過影響基因的表達并控制細胞的行為，進而改變皮膚的生物活性環(huán)境；MicroRNA能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的遷移、增生以及形態(tài)發(fā)生，在促進血管形成方面起到重要作用[22]。Anand等[23]發(fā)現(xiàn)，MiR-132能夠抑制p120RasGAP的表達，進而激活Ras，從而促進血管形成。Devalliere等[24]將載有MiR-132的納米微粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞遷移和增殖能力提高，并且微血管化程度也升高了2倍。MiR-200b也能夠通過抑制GATA結(jié)合蛋白2和血管內(nèi)皮生長因子受體2，來抑制皮膚創(chuàng)面血管形成[25]。

2.3 改進支架的結(jié)構(gòu)或應(yīng)用新型技術(shù)

在組織工程研究中，有效的血管形成和智能的支架設(shè)計是密不可分的。不管是天然支架還是人工合成支架，都應(yīng)盡量模擬細胞外基質(zhì)的基本特性。支架的孔隙度、平均孔徑、機械強度、表面活性等都需要進行合理的設(shè)計，以促進血管的長入[26]。多孔的支鏈淀粉膠原水凝膠作為真皮支架，能夠促進間質(zhì)細胞的聚集、血管化和肉芽組織的形成，進而促進創(chuàng)面愈合[27]。Rustad等[28]發(fā)現(xiàn)，將仿生的支鏈淀粉膠原水凝膠結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細胞，移植到小鼠背部創(chuàng)面后，能夠提高VEGF和其他促血管形成因子的水平，進而促進血管形成，加速創(chuàng)面愈合。Wang等[29]用膠原、硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸按9∶1∶1比例混合制作新型組織工程真皮支架，發(fā)現(xiàn)其能促進細胞的黏附和增殖，提高皮膚血管化程度，進而促進大鼠創(chuàng)面的愈合。

靜電紡絲作為一種簡便有效的、可生產(chǎn)納米纖維的新型加工技術(shù)，可以模擬天然的細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和生物功能，促進細胞的遷移和增殖[30-31]。Yang等[32]將載有bFGF的質(zhì)粒和靜電紡絲結(jié)合，bFGF能夠緩慢持續(xù)釋放4周，移植于糖尿病大鼠創(chuàng)面后，創(chuàng)面血管化程度明顯增高。近幾年，生物打印技術(shù)發(fā)展迅速，可以個性化控制細胞的分布，并精確控制支架的形狀。Lee等[33]成功應(yīng)用3D生物打印技術(shù)，演示了將膠原、成纖維細胞和角質(zhì)細胞，層層裝配成組織工程皮膚的過程。通過生物打印技術(shù)來精確模擬細胞和細胞外基質(zhì)的生長環(huán)境，或許可以很好地提高組織工程皮膚血管化程度。

3 展望

目前，組織工程皮膚血管化的研究仍主要集中于利用各種血管生成細胞、生長因子和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，來促進血管形成。每種方法的有效性都有一定的局限性，都不能完美地解決組織工程皮膚血管化的問題。隨著對血管形成的機制和分子基礎(chǔ)的不斷了解和深入，我們或許能夠通過運用新技術(shù)構(gòu)建新型支架材料，進而將合適的細胞接種于支架材料中，并適時適量地輔以多種細胞因子，模擬天然組織生長環(huán)境的內(nèi)源性特征，最終較好地促進組織工程皮膚血管形成。

[1]Varkey M,Ding J,Tredget EE.Advances in skin substitutespotential of tissue engineered skin for facilitating anti-fibrotic healing[J].J Funct Biomater,2015,6(3)：547-563.

[2]Shevchenko RV,James SL,James SE.A review of tissueengineered skin bioconstructs available for skin reconstruction [J].J R Soc Interface,2010,7(43)：229-258.

[3]Boyce ST.Design principles for composition and performance of cultured skin substitutes[J].Burns,2001,27(5)：523-533.

[4]Sahota PS,Burn JL,Heaton M,et al.Development of a reconstructed human skin model for angiogenesis[J].Wound Repair Regen,2003,11(4)：275-284.

[5]Carmeliet P,Jain RK.Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis[J].Nature,2011,473(7347)：298-307.

[6]Takahashi T,Kalka C,Masuda H,et al.Ischemia-and cytokineinduced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization[J].Nat Med,1999,5(4)：434-438.

[7]Tepper OM,Capla JM,Galiano RD,et al.Adult vasculogenesis occurs through in situ recruitment,proliferation,and tubulization of circulating bone marrow-derived cells[J].Blood,2005,105(3)：1068-1077.

[8]Carmeliet P.Angiogenesis in health and disease[J].Nat Med, 2003,9(6)：653-660.

[9]Asahara T,Masuda H,Takahashi T,et al.Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization[J].Circ Res, 1999,85(3)：221-228.

[10]Tremblay PL,Hudon V,Berthod F,et al.Inosculation of tissueengineered capillaries with the host's vasculature in a reconstructed skin transplanted on mice[J].Am J Transplant,2005,5(5)：1002-1010.

[11]Asahara T,Murohara T,Sullivan A,et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis[J].Science,1997,275 (5302)：964-967.

[12]Zhang Z,Ito WD,Hopfner U,et al.The role of single cell derived vascular resident endothelial progenitor cells in the enhancement ofvascularizationinscaffold-basedskinregeneration[J]. Biomaterials,2011,32(17)：4109-4117.

[13]Ojeh N,Pastar I,Tomic-Canic M,et al.Stem cells in skin regeneration,wound healing,and their clinical applications[J]. Int J Mol Sci,2015,16(10)：25476-25501.

[14]Danner S,Kremer M,Petschnik AE,et al.The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration[J].J Invest Dermatol,2012,132(6)：1707-1716.

[15]Huang SP,Hsu CC,Chang SC,et al.Adipose-derived stem cells seeded on acellular dermal matrix grafts enhance wound healing in a murine model of a full-thickness defect[J].Ann Plast Surg, 2012,69(6)：656-662.

[16]Klar AS,Guven S,Biedermann T,et al.Tissue-engineered dermoepidermal skin grafts prevascularized with adipose-derived cells [J].Biomaterials,2014,35(19)：5065-5078.

[17]Kim KL,Song SH,Choi KS,et al.Cooperation of endothelial and smooth muscle cells derived from human induced pluripotent stem cells enhances neovascularization in dermal wounds[J]. Tissue Eng Part A,2013,19(21-22)：2478-2485.

[18]Yancopoulos GD,Davis S,Gale NW,et al.Vascular-specific growth factors and blood vessel formation[J].Nature,2000,407 (6801)：242-248.

[19]Hosseinkhani H,Hosseinkhani M,Khademhosseini A,et al. Enhanced angiogenesis through controlled release of basic fibroblast growth factor from peptide amphiphile for tissue regeneration[J]. Biomaterials,2006,27(34)：5836-5844.

[20]Han Y,Tao R,Han Y,et al.Microencapsulated VEGF genemodified umbilical cord mesenchymal stromal cells promote the vascularization of tissue-engineered dermis：an experimental study [J].Cytotherapy,2014,16(2)：160-169.

[21]Miller KJ,Brown DA,Ibrahim MM,et al.MicroRNAs in skin tissue engineering[J].Adv Drug Deliv Rev,2015,88：16-36.

[22]Suárez Y,Sessa WC.MicroRNAs as novelregulatorsof angiogenesis[J].Circ Res,2009,104(4)：442-454.

[23]Anand S,Majeti BK,Acevedo LM,et al.MicroRNA-132-mediated loss of p120RasGAP activates the endothelium to facilitate pathological angiogenesis[J].Nat Med,2010,16(8)：909-914.

[24]Devalliere J,Chang WG,Andrejecsk JW,et al.Sustained delivery of proangiogenic microRNA-132 by nanoparticle transfection improves endothelial cell transplantation[J].FASEB J,2014,28 (2)：908-922.

[25]Chan YC,Roy S,Khanna S,et al.Downregulation of endothelial microRNA-200b supports cutaneous wound angiogenesis by desilencing GATA binding protein 2 and vascular endothelial growth factor receptor 2[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012, 32(6)：1372-1382.

[26]Hollister SJ.Porous scaffold design for tissue engineering[J].Nat Mater,2005,4(7)：518-524.

[27]Wong VW,Rustad KC,Galvez MG,et al.Engineered pullulancollagen composite dermal hydrogels improve early cutaneous wound healing[J].Tissue Eng Part A,2011,17(5-6)：631-644.

[28]Rustad KC,Wong VW,Sorkin M,et al.Enhancement of mesenchymal stem cell angiogenic capacity and stemness by a biomimetic hydrogel scaffold[J].Biomaterials,2012,33(1)：80-90.

[29]Wang W,Zhang M,Lu W,et al.Cross-linked collagenchondroitin sulfate-hyaluronic acid imitating extracellular matrix as scaffold for dermal tissue engineering[J].Tissue Eng Part C Methods,2010,16(2)：269-279.

[30]Kluger PJ,Wyrwa R,Weisser J,et al.Electrospun poly(D/L-lactide-co-L-lactide)hybrid matrix：a novel scaffold material for soft tissue engineering[J].J Mater Sci Mater Med,2010,21(9)：2665-2671.

[31]Zhu X,Cui W,Li X,et al.Electrospun fibrous mats with high porosity as potential scaffolds for skin tissue engineering[J]. Biomacromolecules,2008,9(7)：1795-1801.

[32]Yang Y,Xia T,Chen F,et al.Electrospun fibers with plasmid bFGF polyplex loadings promote skin wound healing in diabetic rats[J].Mol Pharm,2012,9(1)：48-58.

[33]Lee V,Singh G,Trasatti JP,et al.Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting[J].Tissue Eng Part C Methods,2014,20(6)：473-484.

Research Advances of Neovascularization in Tissue Engineering SkinWANG Chuan,XIAO Ran,CAO Yilin.Research

Center,Plastic Surgery Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Beijing 100144, China.Corresponding author:XIAO Ran(E-mail:xiaoran@pumc.edu.cn);CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

Skin tissue engineering;Neovascularization;Stem cells;Cytokines;Scaffolds

Q813.1+2

B

1673－0364（2017）02－0106－03

2016年12月15日；

2017年2月22日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.02.014

100144北京市中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心。

肖苒（E-mail：xiaoran@pumc.edu.cn）；曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。

【Summary】Blood supply is the most important thing regarding skin's maintenance and transplantation,although tissue engineering skin have been commercialized and used in clinic,it has failed to achieve the vascularization.The neovascularization of tissue engineering skin at present is mainly rely on seed cells that can promote vascularization and a variety of growth factors.As the development of induced pluripotent stem cells,electrostatic spinning,and the biological printing technology,new scaffolds combined with the corresponding seed cells and cytokines can be designed to simulate the growing environment of body accurately to promote vascularization of tissue engineering skin.In this paper,the research progress of neovascularization in tissue engineering skin was reviewed.