王思懌, 郭旭虹, 陳凱敏

(1.上海化工研究院檢測中心,上海200062; 2.華東理工大學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)工程聯(lián)合國家重點實驗室,上海200237; 3.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,上海201620)

特約綜述

聚合物刷與生物分子相互作用的研究進展

王思懌1, 郭旭虹2, 陳凱敏3

(1.上?；ぱ芯吭簷z測中心,上海200062; 2.華東理工大學(xué)化工學(xué)院,化學(xué)工程聯(lián)合國家重點實驗室,上海200237; 3.上海工程技術(shù)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,上海201620)

聚合物刷是由一端緊密接枝在一個曲面或平面的聚合物鏈組成的大分子結(jié)構(gòu)。近年來,隨著聚合物制備方法和表面修飾技術(shù)的不斷發(fā)展,聚合物刷的應(yīng)用范圍也在不斷拓寬,相關(guān)研究已成為功能高分子材料領(lǐng)域的熱點之一。具有特殊結(jié)構(gòu)和功能的聚合物刷在生物分子固定、蛋白質(zhì)分離、酶催化、藥物控釋等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本文綜述了聚合物刷與生物分子相互作用及應(yīng)用的最新研究進展,并展望了今后的發(fā)展方向。

聚合物刷; 生物分子; 相互作用; 蛋白固定化; 酶催化

上世紀50年代,人們發(fā)現(xiàn)在膠體粒子表面接枝聚合物鏈可有效阻止凝聚效應(yīng)的發(fā)生[1-3],從而避免相鄰膠體粒子的團聚,提高膠體粒子的穩(wěn)定性[4],由此聚合物刷開始引起人們的關(guān)注[5]。聚合物刷由一端固定在表面或界面的聚合物鏈組裝而成。當聚合物鏈間距很小,即接枝密度很高時,體積排除效應(yīng)使聚合物鏈的自由端向遠離基底表面或界面的方向伸展[6]。聚合物刷的鏈伸展是平衡條件下無需外加場誘導(dǎo)的自組裝行為,該行為不僅影響聚合物刷的空間構(gòu)象,還催生了許多聚合物刷特有的功能性[7]。

近年來,蛋白質(zhì)、酶、抗體在固體基質(zhì)表面的吸附及固定,一直都受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注[8-10],該過程能應(yīng)用于生物分子分離純化[11-12]、藥物控釋[13]、細胞黏附、生物傳感器[14]等領(lǐng)域。作為生物分子的優(yōu)良載體必須具備兩個前提條件：(1)能夠極大地保留生物分子的功能和活性[15];(2)能夠提供一個足夠大的表面以結(jié)合大量的生物分子。在水溶液中,可通過吸附的方法將生物分子固定在一個表面上。Czeslik[16-18]、Kusumo[19]和 de Vos[20-21]等都研究了蛋白質(zhì)在平面聚合物刷上的吸附,通過調(diào)節(jié)溶液pH、離子強度、聚合物刷的接枝密度可改變蛋白質(zhì)的吸附量。平面聚合物刷的吸附會導(dǎo)致酶活性的損失[22],而且難以在生物體內(nèi)進行運輸和傳遞。

與平面聚合物刷相比,小尺寸的球形聚合物刷具有更大的比表面積,可通過表面修飾選擇性地吸附大量的蛋白質(zhì)、酶、核酸、多糖和脂類等生物分子,而且納米尺寸的聚合物刷能被注入到人體血液中,并到達目標器官和細胞,實現(xiàn)在體內(nèi)的應(yīng)用[23-25]。在各類聚合物刷中,納米球形聚電解質(zhì)刷兼具聚電解質(zhì)和高比表面積的特性,特別適合在溶液中固定生物分子。Ballauff等從物理化學(xué)的角度對納米球形聚合物刷與生物分子的相互作用進行了系統(tǒng)而深入的研究,證實聚合物刷對生物分子的吸附不會引起生物分子結(jié)構(gòu)和功能的改變[26-29]。在適宜的pH和離子強度下,聚合物刷能有效吸附并固定大量的生物分子。通過改變體系的pH或離子強度,聚合物刷還能可控地釋放所固定的生物分子[30-33]。制備特殊結(jié)構(gòu)的聚合物刷并對其進行表面修飾能賦予聚合物刷特殊的響應(yīng)性和功能性,例如磁性聚合物刷能實現(xiàn)生物分子的磁導(dǎo)向分離純化、催化劑的回收利用[34-37]。溫敏性的聚合物刷可通過改變體系溫度控制水相中生物分子的傳導(dǎo)和運輸[38-39]。兩性聚電解質(zhì)刷能抗生物分子吸附,用作抗菌材料。表面修飾后的聚合物刷能選擇性地與目標細胞結(jié)合,應(yīng)用于靶向給藥、疾病診斷和納米生物傳感器等領(lǐng)域[40-43]。

1 聚合物刷的結(jié)構(gòu)與性能

不同種類的聚合物刷具有不同的結(jié)構(gòu)、特性和功能。根據(jù)聚合物刷基體曲率的大小,可以將聚合物刷分為平面聚合物刷、球形聚合物刷和星形聚合物刷(如圖1)。當基體表面曲率半徑遠遠大于聚合物鏈的尺寸時,聚合物刷看似連接在一個平面上,故被稱為平面聚合物刷[44-47]。當基體表面曲率半徑與聚合物鏈的尺寸相當時,就形成了球形聚合物刷[48-52]。當聚合物鏈的尺寸遠遠大于基體表面曲率半徑時,就構(gòu)成了星形聚合物刷。球形聚合物刷的尺寸介于平面聚合物刷和星形聚合物刷之間,是研究聚合物刷性質(zhì)的橋梁。

圖1 聚合物刷的曲率及其形態(tài)[53]Fig.1 Curvature and structure of polymer brushes[53]

為了使聚合物鏈盡可能地向遠離固定端方向伸展,形成厚的聚合物刷層,人們開始關(guān)注帶電荷的聚電解質(zhì)刷。除空間位阻效應(yīng)外,聚電解質(zhì)刷鏈間的電荷排斥力和反離子產(chǎn)生的高滲透壓使聚電解質(zhì)鏈進一步伸展。由于受到靜電相互作用、鹽離子屏蔽效應(yīng)等影響,聚電解質(zhì)刷的鏈伸展、鏈層厚度、構(gòu)象等隨體系的pH、鹽濃度、反離子價態(tài)等外界因素的改變而改變。聚電解質(zhì)刷的這些特性受到了科學(xué)家的高度關(guān)注[54],也為其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。近年來,有關(guān)聚合物刷的文章平均每篇引用次數(shù)從4次增加到了7次,其中,研究聚合物刷與生物分子的文章占到了10%～15%,平均每篇文章的引用次數(shù)為10～15次?？梢?聚合物刷與生物分子的相互作用已逐步成為研究熱點。

1.1 平面聚合物刷

平面聚合物刷是由高密度接枝在平面基質(zhì)上的聚合物鏈組裝而成的高分子結(jié)構(gòu)。當接枝的聚合物鏈尺寸均勻且緊密排列在基質(zhì)表面上時,空間位阻效應(yīng)使聚合物鏈垂直于基質(zhì)平面向外伸展,避免了聚合物鏈間的重疊,構(gòu)成了聚合物刷的微觀結(jié)構(gòu)。平面聚電解質(zhì)刷的概念最早由Pincus[55]和Borisov等[56]提出,當接枝的聚合物鏈為強電解質(zhì)時,聚電解質(zhì)刷的鏈伸展不隨溶液pH和離子強度而改變;當接枝弱電解質(zhì)鏈時,聚電解質(zhì)刷的鏈伸展受電離平衡控制,隨溶液pH和離子強度變化。Biesalski等[57]研究了聚氮甲基吡啶平面刷在碘離子存在下的鏈伸展和塌陷,當聚電解質(zhì)鏈層厚度大于100 nm時,聚電解質(zhì)刷內(nèi)部束縛的反離子帶來高滲透壓使聚電解質(zhì)鏈伸展。平面聚電解質(zhì)刷的空間位阻效應(yīng)和靜電相互作用等特性使其在金屬離子吸附和生物分子固載等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

1.2 球形聚合物刷

在平面聚合物刷的研究開始不久之后,人們開始對球形聚合物刷的制備及性能展開研究。在膠體顆?；蚪饘倭Ｗ拥缺砻娼又酆衔镦溈尚纬汕蛐尉酆衔锼ⅰ．斁酆衔镦溑c體系介質(zhì)具有良好相溶性時,聚合物鏈構(gòu)成了相對獨立的界面,阻礙了膠體顆粒間的接近和團聚。聚合物鏈的伸展和收縮主要取決于聚合物刷內(nèi)部空間和外表面區(qū)域的能量平衡。這種自發(fā)的平衡態(tài)使聚合物刷不同于自由狀態(tài)的聚合物鏈,表現(xiàn)出不同的特性和功能。1999年,Guo和Ballauff等[50]首次采用光乳液聚合成功制備了納米球形聚電解質(zhì)刷,并使用動態(tài)光散射(DLS)對球形聚電解質(zhì)刷的空間尺寸進行了系統(tǒng)的研究[58]。他們通過改變?nèi)芤蝴}濃度,并結(jié)合Daoud-Cotton模型,研究了離子強度對強電解質(zhì)刷和弱電解質(zhì)刷伸展和塌陷的影響。研究表明:聚電解質(zhì)刷鏈層中反離子的富集和釋放使聚合物刷的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致聚合物鏈的伸展和塌陷。與強聚電解質(zhì)刷相比,弱聚電解質(zhì)刷的鏈伸展隨pH和鹽濃度的變化更明顯[59]。束縛于聚電解質(zhì)刷中的反離子產(chǎn)生高滲透壓使聚合物刷“溶脹”,可為反離子富集和生物分子固定提供空間。球形聚電解質(zhì)刷內(nèi)部能保持pH和離子強度相對穩(wěn)定,吸附大量的生物分子后能極大地保留生物分子的功能和活性。與平面聚合物刷相比,納米球形聚合物刷具有良好的分散性,且尺寸可調(diào),便于在生物體內(nèi)的傳遞和運輸。

1.3 聚合物刷對環(huán)境的響應(yīng)性能

在基體表面接枝聚合物鏈能顯著改善基體的性能,由此聚合物刷可應(yīng)用于許多生物和化工領(lǐng)域,例如黏附材料[60]、抗蛋白吸附[61]、色譜儀[62]、潤滑劑[63]、表面活性劑[7]和增溶劑等。科研工作者對聚合物刷的結(jié)構(gòu)進行精心設(shè)計和修飾,制備了具有特殊響應(yīng)性和功能性的聚合物刷。聚合物刷作為智能材料受到人們廣泛的關(guān)注。Ito等報道了pH響應(yīng)[64]、光敏性[65]、氧化還原敏感性[66]的聚合物刷。Guo等[30,32-36]報道了pH、離子強度響應(yīng)的聚合物刷。Ballauff等[38-39]報道了溫敏性的納米交聯(lián)聚合物刷。Chen等[34-35]報道的磁響應(yīng)性聚合物刷,可應(yīng)用于核磁共振成像、磁導(dǎo)向生物分離、靶向給藥、高熱磁療等領(lǐng)域。

1.3.1 pH響應(yīng)性聚合物刷 聚電解質(zhì)刷不同于非離子型聚合物刷,其結(jié)構(gòu)中帶有可電離的電荷,強聚電解質(zhì)刷在水溶液中完全電離,而弱聚電解質(zhì)刷的電離程度隨體系pH改變[50,58,68-69]。弱聚電解質(zhì)刷對pH極其敏感,可通過改變體系pH來調(diào)控電荷密度及聚電解質(zhì)間的相互作用(見圖2)。當聚電解質(zhì)刷達到電離平衡時,整個體系以聚合物鏈間的排斥作用為主導(dǎo)力,促進了聚合物鏈的伸展,保證了體系的穩(wěn)定性,有利于納米金屬顆粒富集及生物分子吸附。當外界溶液的pH或離子強度發(fā)生改變時,原本的電離平衡被打破,聚合物鏈層的電荷及反離子重新分布,最終達到新的電荷平衡。通過改變體系的pH或離子強度,pH響應(yīng)性的聚合物刷能在溶液中對生物分子進行可控的吸附和脫附。

1.3.2 溫度響應(yīng)性聚合物刷 溫度能夠控制一些聚合物鏈在溶液中的溶解性,從而影響聚合物的構(gòu)象變化和聚合物刷與生物分子的相互作用。Lu等[38]采用光乳液聚合方法將溫敏性的聚N-異丙基丙烯酰胺鏈(PNIPA)緊密地接枝在聚苯乙烯核表面,通過加入交聯(lián)劑N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(BIS),使PNIPA發(fā)生交聯(lián)并形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),制備了溫敏性的PS@PNIPA納米球形聚合物刷。該溫敏性聚合物刷的合成路線如圖3所示。溫敏性聚合物刷具有一個最低臨界溶解溫度(LCST)。當體系溫度低于LCST時,溫敏性聚合物刷具有良好的水溶性,聚合物鏈呈現(xiàn)伸展狀態(tài),可在此狀態(tài)下吸附生物分子。而當體系溫度高于LCST時,PNIPA結(jié)構(gòu)中的氫鍵力減弱,疏水力增強,使聚合物鏈發(fā)生收縮,可將吸附的生物分子固定在聚合物鏈層。

圖2 聚電解質(zhì)刷的pH響應(yīng)性[67]Fig.2 pH response of polyelectrolyte brushes[67]

圖3 交聯(lián)的溫敏性聚合物刷的合成路線[38]Fig.3 Synthetic scheme of cross-linked thermosensitive polymer brushes[38]

1.3.3 磁響應(yīng)性聚合物刷 Chen等首次在納米球形聚合物刷的核內(nèi)部引入磁性粒子,使聚合物刷具有良好的磁響應(yīng)性。聚合物刷的磁功能化拓寬了聚合物刷的應(yīng)用范圍。比如,利用聚合物刷可吸附水溶液中的金屬離子[70-72],但吸附后的分離難以進行。在聚合物刷內(nèi)部引入磁性顆粒后,在外加磁場下磁性聚合物刷可進行富集和回收(如圖4)[73]。移除外加磁場后,脫附金屬離子后的磁性聚合物刷仍能保持良好的分散性。采用磁性聚合物刷吸附特定的生物分子能大大提高生物分子的分離效率[36-37]。另一方面,催化劑的回收再利用可以降低工業(yè)催化的成本。在球形聚合物刷層中原位合成的納米粒子具有很高的催化活性[63-64,67-69]。在水相催化體系中,采用磁性聚合物刷固載催化劑,在催化反應(yīng)結(jié)束后通過磁導(dǎo)向富集可實現(xiàn)催化劑的回收及循環(huán)使用。

圖4 聚合物刷的磁響應(yīng)性[73]Fig.4 Magnetic response of polymer brushes[73]

2 聚合物刷與生物分子相互作用的表征方法

2.1 濁度滴定

1980年,Kokufuta等[74]采用“膠體濁度滴定”的方法,通過觀察體系的濁度變化來研究聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)的締合作用[75]。隨著聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)締合作用的增強,出現(xiàn)相分離的凝聚層,因為體系濁度取決于溶解相中聚集態(tài)大分子的數(shù)量和尺寸。濁度的最大值與體系的pH、離子強度、主-客體分子的化學(xué)計量比有關(guān)[76]。pH和離子強度控制著電荷的化學(xué)計量比,通過改變大分子的電荷數(shù)量,可以控制主-客體分子結(jié)合的程度以及電中和的程度。

濁度(τ)通常采用透光率進行表達,即τ=-lnT/x=2.3A/x(其中:T為透光率,A為吸光度,x為透光距離(cm))。測量時的光學(xué)精度為±0.001,因此濁度的靈敏度為%T±0.02,能用于檢測蛋白質(zhì)二聚體的形成[77]。利用比色計探頭獲得的平均檢測信號可觀察聚電解質(zhì)-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成。當濁度隨pH變化曲線的斜率偏離零時,即聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)形成了可溶性復(fù)合物。該點的pH被定義為pHc,而形成不溶性凝聚物的臨界pH則被定義為pHφ。當體系中不存在聚電解質(zhì)時,濁度法還能用于檢測蛋白質(zhì)的自聚[78]。Wang等[30,32-33]通過觀察體系濁度隨pH的變化,分析了聚合物刷與蛋白質(zhì)相互作用的過程(見圖5),研究表明兩者的相互作用在不同的pH區(qū)域可分為吸附平衡、復(fù)合物聚集、蛋白質(zhì)釋放及聚集體分解4種狀態(tài)。通過調(diào)節(jié)體系的pH、鹽濃度、化學(xué)計量比,聚合物刷能可控地吸附及脫附生物分子,而體系的穩(wěn)定性及生物分子的活性并未受到影響。

圖5 陽離子聚合物刷與牛血清蛋白混合溶液的濁度和粒徑隨pH的變化[32]Fig.5 Turbidity and size change of cationic polymer brush and BSA complexes as a function of pH[32]

2.2 動態(tài)光散射

動態(tài)光散射(DLS)是研究大分子間相互作用的重要方法,約35%的已發(fā)表論文采用DLS研究聚合物與生物分子的締合作用。DLS能用于檢測自由狀態(tài)的生物分子、聚合物-生物分子復(fù)合物、聚合物間的可溶性聚集體在溶液中的尺寸。Boeris等[79]研究表明,當pH為3.0時,殼聚糖與胃蛋白酶的締合作用不會使殼聚糖的尺寸(400 nm)發(fā)生改變；而當pH為4.0時,締合作用使殼聚糖的尺寸減小了2倍。

DLS還能檢測聚合物納米粒子的粒徑和粒徑分布,用于研究聚合物刷與生物分子相互作用對微觀結(jié)構(gòu)的影響。如圖5所示,DLS與濁度滴定的觀察結(jié)果保持高度一致。在無相互作用和吸附動態(tài)平衡的pH區(qū)域內(nèi),聚合物刷-蛋白質(zhì)復(fù)合物的尺寸與空白聚合物刷的粒徑基本一致。隨著相互作用的增強,聚合物刷-蛋白質(zhì)復(fù)合物之間形成大的聚集態(tài)使復(fù)合物的粒徑迅速增加[30,32-33]。然而,進一步改變體系pH,蛋白質(zhì)釋放和聚集態(tài)分解的共同作用使復(fù)合物的粒徑顯著減小。由于分辨率的關(guān)系,DLS無法區(qū)分吸附動態(tài)平衡區(qū)域內(nèi),聚合物刷吸附蛋白質(zhì)后尺寸上的細微變化。濁度滴定法雖然可以檢測出吸附動態(tài)平衡區(qū),也不能給出具體的吸附細節(jié)。動態(tài)平衡區(qū)聚合物刷與生物分子的相互作用,可以利用小角X光散射進行表征和分析。

2.3 小角X光散射

小角X光散射(SAXS)能用于表征聚合物刷-蛋白質(zhì)復(fù)合體系的結(jié)構(gòu)和尺寸,其所能達到的測量范圍是靜態(tài)光散射所無法比擬的。由于SAXS提供了非常寬泛的散射因子(矢量)(q)范圍,遠超于靜態(tài)光散射的范圍,所以SAXS能十分有效地提供復(fù)合物的結(jié)構(gòu)信息,其中,q=4πsinθ/λ,q是入射峰與散射峰波矢之差的模,散射峰強度為I(q),θ為X射線散射角,λ為入射光波長。通過選擇不同的模型,SAXS還能給出被測體系的形態(tài)信息,例如單體液珠、聚合物鏈和聚集體。SAXS現(xiàn)已被廣泛地應(yīng)用在分析聚合物刷吸附生物分子的研究中[25,77,80]。通常情況下,當聚合物刷吸附蛋白質(zhì)后會引起散射曲線的明顯變化,通過散射強度和電子密度數(shù)據(jù)的變化能揭示蛋白質(zhì)在聚合物刷中的徑向分布和蛋白質(zhì)吸附總量(τads)。將SAXS數(shù)據(jù)與其他表征數(shù)據(jù)相結(jié)合[28,76],可以更深入地了解聚合物刷與生物分子的相互作用過程。

圖6顯示了球形聚合物刷吸附牛血清蛋白的SAXS測試結(jié)果。聚合物刷吸附蛋白質(zhì)后,聚合物鏈層的電子密度顯著增加[25],導(dǎo)致SAXS的散射信號增強，即散射峰強度I(q)增加。同時,散射曲線左邊第1個峰的峰值向q值減小的方向遷移,說明蛋白質(zhì)的吸附使聚合物刷的回轉(zhuǎn)半徑有所增加。

圖6 球形聚丙烯酸刷吸附牛血清蛋白的SAXS曲線[33]Fig.6 SAXS curves of spherical poly(acrylic acid) brush and its complexes with BSA[33]

2.4 等溫滴定量熱

等溫滴定量熱法(ITC)能精準地檢測出聚合物刷吸附生物分子過程中熱力學(xué)參數(shù)的變化,獲得的等溫吸附線能揭示相互作用的本質(zhì)[81]。當每一滴蛋白質(zhì)注入到聚合物刷溶液中時,結(jié)合產(chǎn)生的熱量(Q)隨時間而變化。ITC可檢測生物分子-聚合物刷濃度比與熱量變化(ΔQ)之間的關(guān)系。由于一個聚合物刷能吸附大量的生物分子,且每個聚合物刷上含有許多能與生物分子相結(jié)合的點,可以假設(shè)每個生物分子與聚合物刷結(jié)合產(chǎn)生的熱量都是相等的?；谶@些假設(shè),采用獨立結(jié)合模型對ITC熱力學(xué)數(shù)據(jù)進行擬合,就能計算出焓變(ΔH)、結(jié)合常數(shù)(Kb)、結(jié)合濃度比(N)[82-83],從而得到每根聚合物鏈上結(jié)合的蛋白質(zhì)數(shù)量[84]。ΔH反映出配體與基質(zhì)的結(jié)合能力[85],再由ΔH和ΔG可以計算得到結(jié)合熵(ΔS)。原則上,Kb隨溫度變化的關(guān)系可由范德霍夫方程計算得到:

(dln Kd/dT-1)p=-ΔH/R

(1)

ΔS由溫度與吉布斯自由能推得：

dΔG/dT=-ΔS

(2)

ΔG=ΔH - TΔS

(3)

通過分析這些熱力學(xué)參數(shù),可以找到聚合物刷與生物分子相互作用過程的驅(qū)動力。靜電相互作用和疏水作用是放熱的過程。如果吸附過程中不存在疏水作用,那么放熱過程通常由靜電作用引起。對此有大量相關(guān)的研究及文獻報道[86-87]。

Karayianni、Romanini和Braia等通過研究聚丙烯酸(PAA)-溶菌酶、聚乙烯硫酸(PVS)-溶菌酶[89]和PVS-胰蛋白酶體系[90],觀察到聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是強烈的靜電作用,該過程放熱并伴隨熵減。與弱聚電解質(zhì)PAA相比,強聚電解質(zhì)PVS與蛋白質(zhì)的靜電作用更強,結(jié)合的放熱量更大。他們還研究了帶有疏水基團的陰離子PAA樹脂L100,其疏水作用導(dǎo)致了明顯的放熱過程[91]。然而,Welsch等[88]使用ITC觀察到溶菌酶與負電性的微凝膠結(jié)合是熵驅(qū)動的過程(圖7),主要由微凝膠層中溶菌酶的質(zhì)子化作用引起，且離子強度能影響結(jié)合強度,這說明結(jié)合過程中也涉及到靜電相互作用?？傊?ITC為聚合物刷與生物分子相互作用的熱力學(xué)研究提供了有效的途徑。

圖7 在298 K、pH 7.2、10 mmol/L MOPS緩沖溶液中,負電性的微凝膠吸附溶菌酶的等溫滴定量熱曲線[88]Fig.7 ITC data of binding of lysozyme to negatively charged microgel particles at 298 K in 10 mmol/L MOPS buffer with pH 7.2[88]

2.5 顯微鏡技術(shù)

用于研究聚合物刷-生物分子復(fù)合體系的形態(tài)和動力學(xué)規(guī)律的常規(guī)顯微鏡技術(shù)包括原子力顯微鏡(AFM)、電子顯微鏡(EM)和透射電鏡(TEM)等。其中,AFM是最常用的表面結(jié)構(gòu)表征手段,具有納米級的分辨率[92]。平均表面粗糙度(rms)可定性研究生物分子吸附于聚合物刷表面的情況(圖8)。此外,吸附于AFM表面的大顆粒三維特征能用于定量分析[93]。AFM所測得的力與距離的曲線能用于研究生物分子的吸附和表面柔軟度。測試時使探針帶有與基質(zhì)相同的聚合物鏈,測得的力與距離曲線用于分析蛋白質(zhì)吸附于表面時的分子間相互作用力[94]。Olanya等[95]使用AFM測定力與距離之間的關(guān)系,研究表明吸附于低電荷密度聚合物多層膜表面上的溶菌酶與AFM的吸引力更大，說明低電荷密度表面的電荷排斥力較小,因此能吸附更多的溶菌酶分子。

圖8 AFM觀察蛋白質(zhì)在聚合物刷表面的吸附[94]

采用EM測試時,樣品通常需要通過染色來提高對比度。EM的分辨率要比普通的光學(xué)顯微鏡高得多,因此被廣泛地用于直接觀察聚合物刷-生物分子復(fù)合體系[96]。近年來,TEM也逐漸成為研究聚合物刷-生物分子復(fù)合物的重要表征方法。尤其與冷凍技術(shù)相結(jié)合時,冷凍TEM能為聚合物刷-生物分子復(fù)合體系提供原位的結(jié)合信息。Gummel等[97]報道了利用冷凍TEM觀察聚電解質(zhì)刷-蛋白質(zhì)復(fù)合物的緊密球形結(jié)構(gòu)。Kayitmazer等[98]也采用冷凍TEM觀察牛血清蛋白-PDADMAC復(fù)合物的致密結(jié)構(gòu)。在高分辨率下,他們還進一步觀察到牛血清蛋白-PDADMAC復(fù)合物聚集態(tài)的大小約為50 nm。

3 聚合物刷在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用進展

相比于傳統(tǒng)的基材或自由線型聚合物,聚合物刷具有特殊的結(jié)構(gòu)和功能,它具有可調(diào)控的接枝密度和功能基團數(shù)量,快速的pH、溫度、磁響應(yīng)性。這些優(yōu)越的特性使聚合物刷在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用,例如蛋白質(zhì)的吸附或抗吸附、藥物輸送、生物傳感器等。

3.1 蛋白質(zhì)的固定化及其分離純化

經(jīng)聚合物刷固定后,生物分子的自聚被抑制,避免了生物分子的沉淀和變性,提高了生物分子的穩(wěn)定性并保持了其生物活性。Tran等[99]報道了無論在聚電解質(zhì)內(nèi)部還是外部,金納米粒子表面修飾的多層聚合物刷能抑制朊蛋白沉淀的發(fā)生[99]。de Vos[20-21]、Czeslik[16-18]、Kusumo[19]等系統(tǒng)研究了牛血清蛋白、α-乳球蛋白、溶菌酶和胰島素在平面聚合物刷上的吸附,發(fā)現(xiàn)固定在平面聚合物刷內(nèi)的蛋白質(zhì),其二級結(jié)構(gòu)得到了很好的保留[17]。紅外光譜檢測結(jié)果也證實了吸附于球形聚合物刷內(nèi)部的牛血清蛋白、β-乳球蛋白、核糖核酸酶的二級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化,生物分子的生物活性也得到了保持[22]。Ballauff課題組對球形聚合物刷固載不同的生物分子(如牛血清蛋白[100-105]、牛血紅蛋白[28]、β-乳球蛋白[106]、熒光蛋白[31])和酶(葡萄糖化酶[107]、β-葡萄苷酶[108-109]、核糖核酸酶[22])進行了全面而深入的研究,他們采用熒光光譜觀察不同離子強度下熒光蛋白(mEosFP)在聚合物刷表面的吸附及脫附行為,發(fā)現(xiàn)在低離子強度下聚合物刷能大量且自發(fā)地吸附熒光蛋白[31]。但隨著體系離子強度的上升,熒光蛋白逐步從聚合物刷內(nèi)部脫附到溶液中。同時,利用SAXS證實了生物分子均勻地固定于聚合物刷內(nèi)部[103]。

通常,工業(yè)化的蛋白質(zhì)分離過程耗時耗力耗財,如液相層析色譜和膜分離法。而且當?shù)鞍踪|(zhì)等電點的差異小于0.5個pH單位時,基于這些技術(shù)的分離效果顯著變差。聚合物刷能選擇性地與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物,能對結(jié)構(gòu)相似或等電點相近的蛋白質(zhì)進行分離[39]。Chen[110]等觀察到低聚物修飾的納米金聚合物刷能選擇性地吸附β-乳球蛋白(BLG)的2個變體(BLG-A和BLG-B),從而實現(xiàn)BLG-A與BLG-B的分離和純化。Boeris等[111]利用酶與殼聚糖形成聚集態(tài)沉淀,使胃蛋白酶的純化率達到90%。Aravind等[112]研究表明，當pH為8.8時,卵清蛋白在殼聚糖-聚苯乙烯磺酸鹽多分子層刷上的吸附率達到了100%。Wang等[30]研究表明,陽離子球形聚電解質(zhì)刷與牛血清蛋白、β-乳球蛋白、木瓜蛋白酶的結(jié)合行為有明顯的差異,由ITC和UV測定的結(jié)合能、結(jié)合強度、結(jié)合數(shù)量,表明它們的結(jié)合能力依次為β-乳球蛋白 > 牛血清蛋白 > 木瓜蛋白酶。通過調(diào)節(jié)體系的pH、離子強度、化學(xué)計量比,并利用聚合物刷與蛋白形成的聚集態(tài),陽離子球形聚合物刷能對牛血清蛋白、β-乳球蛋白、木瓜蛋白酶進行分離。Qin等[34]研究表明,磁性陽離子聚合物刷能選擇性吸附牛血清蛋白和β-乳球蛋白,實現(xiàn)對不同蛋白的磁導(dǎo)向分離?？偟膩碚f,聚合物刷是生物分子的優(yōu)良載體,能在水相中可控地吸附及脫附生物分子,通過接枝功能化的聚合物鏈,聚合物刷能選擇性地結(jié)合目標分子,實現(xiàn)生物分子的固定、分離和純化。

3.2 酶固定催化

酶是功能性的蛋白質(zhì),具有很高的催化效率。越來越多的研究關(guān)注利用聚電解質(zhì)與蛋白質(zhì)的締合作用來保持酶的活性,并應(yīng)用于酶催化反應(yīng)?；诰垭娊赓|(zhì)刷與蛋白質(zhì)的相互作用,聚電解質(zhì)刷能作為酶固定的優(yōu)良載體。平面聚合物刷的吸附會引起核糖核酸酶活性的損失[22],而球形聚合物刷不僅具有更高的結(jié)合量,還能提高酶的活性[26-27,29,113]。Ballauff等[85]采用溫敏性球形聚合物刷(PS@PNIPA)固載β-D-葡萄糖苷酶,并對催化反應(yīng)活性進行定量研究。研究表明:固定在球形聚合物刷上的酶催化活性相比于溶液中自由狀態(tài)的酶活性增大3倍以上。Kudina等[114]利用球形PAA刷(100 nm)固載纖維素酶(CEL)形成一個酶-微凝膠生物催化體系。由于體系的負載能力、酶活性、接觸面積和酶流動性有了提高,催化效率也得到了顯著的增加。酶-微凝膠體系在生物燃料和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用,因為固載后的纖維素酶(CEL)能高效地將纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖。Xu等[36]制備了一種磁性PAA刷用于酶固定,達到了高效的催化性能(如圖9),并能有效地回收酶,因此在酶催化、分離、純化和再利用方面具有巨大的應(yīng)用前景。RNase A通過共價鍵和氫鍵等相互作用可以固定于納米球形聚合物刷內(nèi)部[115]。RNase A的RNA基質(zhì)是一個大分子,通過增加酶的結(jié)合力可以增大基質(zhì)的擴散層。因此,通過優(yōu)化酶的結(jié)合力能使聚合物刷-酶復(fù)合物的催化效率達到最大值。這也充分證明了聚合物刷是良好的生物酶載體,具有巨大的應(yīng)用潛力,能作為納米級生物反應(yīng)器應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域。

圖9 磁性聚合物刷固載葡糖淀粉酶催化淀粉水解反應(yīng)[36]Fig.9 Amylolysis catalyzed by amyloglucosidase immobilized in magnetic polymer brushes[36]

3.3 藥物控釋和傳遞

生物分子-聚電解質(zhì)復(fù)合物的形成和分解隨體系的pH和離子強度而改變。在復(fù)合物的形成和分解過程中,目標生物分子得以固定和釋放。例如,在極端的pH條件下,許多的復(fù)合物會經(jīng)歷溶脹的過程。當復(fù)合物處于強酸性的消化液中時,復(fù)合物溶脹的特性就會被激發(fā),于是生物分子會被釋放出來。相同的生物分子釋放過程也可發(fā)生在高離子強度下,例如在生理鹽濃度下。生物分子-聚電解質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)決定了生物分子的吸附和運輸效率。近年來,利用凝聚物形成的微型聚合物膠囊一直被廣泛應(yīng)用在食品中[116]。利用疏水改性后的藻朊酸鹽和疏水改性后的蠶絲蛋白間形成的凝聚物可以誘捕模型藥物熒光右旋糖酐。隨著pH的增加,凝聚物的溶解使熒光右旋糖酐得以釋放[117]。最近,也有研究將復(fù)合物形成的微型膠囊用于藥物的刺激-響應(yīng)控釋(見圖10)[118]。

圖10 聚合物改性的碳酸鈣微囊用于藥物的pH響應(yīng)釋放[118]Fig.10 Encapsulation of CaCO3 modified by polymers for pH-sensitive drug release application [118]

在多孔顆粒表面接枝具有響應(yīng)性聚合物鏈就形成了可控釋放的智能體系,而這些具有響應(yīng)性的聚電解質(zhì)刷就充當了分子信息傳遞者[119-122]的角色。尤其是以介孔硅顆粒(MSN)為核的丙烯酸刷能作為高效的pH響應(yīng)性體系用于固定或釋放客體分子(如藥物、熒光分子或者DNA)[123]。另外,藥物可以固載于聚合物刷鏈層中[124],PAA刷進一步與靶向制劑結(jié)合能建立靶向給藥的機制[125]。將具有pH和溫度雙重響應(yīng)性的PNIPA-PAA聚合物刷作為載體可用于藥物控釋和靶向給藥等領(lǐng)域,在癌癥的治療方面具有潛在的應(yīng)用價值。此外,Motornov等[126]證實了混合的PAA-聚乙烯基吡啶刷具有兩性聚電解質(zhì)的特性,通過調(diào)節(jié)體系的pH能可控地捕獲陽離子或陰離子。因此,聚電解質(zhì)刷能作為一種智能的藥物控釋體系。球形聚合物刷也是一種優(yōu)良的藥物載體,引入磁性粒子后,載藥后的聚合物刷可以在磁場控制下,把藥物輸送到生物體內(nèi)的病灶位置,實現(xiàn)靶向給藥。二氧化硅中空微球在藥物控釋、活性物質(zhì)儲存方面具有潛在的應(yīng)用前景[127]。Huang等[128]通過St?ber方法將二氧化硅沉積在球形聚電解質(zhì)刷表面,形成厚度均勻的殼層,再利用有機溶劑除去核得到規(guī)則的二氧化硅空心微球刷。這種中空微球能包覆藥物,應(yīng)用于藥物控釋。功能化的聚合物刷能為藥物緩釋、靶向給藥提供新的途徑[129]。

3.4 生物傳感

1962年,人們首次提出了生物傳感器的概念[130],這類傳感器主要包含兩個部分：(1)可以結(jié)合目標體的生物識別元素(通常叫作生物受體);(2)能夠基于結(jié)合事件發(fā)出相應(yīng)信號的傳導(dǎo)元素,這個信號通常和分析物的濃度成比例。最新的納米技術(shù)提供了大量如何設(shè)計和制備可控納米結(jié)構(gòu)的素材,這將大大地提高生物傳感器的性能[131-133]。聚合物刷能吸附多層生物分子[134],且擁有特殊的功能性,例如比色傳感[135]、熒光傳感[136]、電化學(xué)傳感[137]等響應(yīng)性,因此聚合物刷能作為一個典型的生物傳感器載體。

利用聚電解質(zhì)刷的三維結(jié)構(gòu),通過改變聚合物的結(jié)構(gòu)形態(tài)和固載能力可以優(yōu)化其對生物分子的吸附及固定[138]。球形PAA刷比普通的平面刷和傳統(tǒng)的二維平面更適合于固定免疫球蛋白(IgG),以及之后的anti-IgG抗體的識別[139]。同時,在生理條件下,PAA刷或聚甲基丙烯酸(PMAA)刷吸附生物分子,作為生物傳感器能降低背景信號的強度。此外,聚電解質(zhì)鏈的伸縮和彎曲使聚合物刷表面特性發(fā)生改變,賦予其不同的生物功能性。Ma等[140]制備了一種雙功能的雙層聚合物刷(PEGMA-PAA),上層的PAA層促進抗體的固定,而下層的聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)層則抑制非特異性吸附。Hess等[141]在石墨烯表面接枝了PDMAEMA-PAA嵌段聚合物刷作為生物傳感器體系。PAA端用于固定酶,而聚甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基乙酯(PDMAEMA)端對pH具有響應(yīng)性,酶反應(yīng)使體系pH發(fā)生變化從而產(chǎn)生信號。

球形PAA刷可作為另一種新的生物傳感器。Gu等[143]證明了在超敏感ELISA體系中,功能的球形PAA刷可替代傳統(tǒng)的酶標記抗體(圖11)。

圖11 酶或抗體功能化的球形PAA刷作為生物傳感器領(lǐng)域中的信號放大器[142]

靜電捕獲后,通過化學(xué)偶聯(lián)(CCEE)的方法把熒光分子和抗體分別化學(xué)固定在PAA刷的內(nèi)部和外部空間,賦予聚合物刷雙重功能,用于待測物的識別并產(chǎn)生檢測信號。作為一種高效的酶載體,PAA刷能將檢測信號放大,檢測靈敏度能提高267倍。相比于傳統(tǒng)的相同尺寸的硅納米顆粒[144-146],以及其他的用于增大酶負載量的功能標記顆粒(例如介孔硅顆粒[142]、中空顆粒[147-148],或者微米級的磁珠[149]),PAA刷的檢測信號放大效應(yīng)更明顯。PAA刷標記物可作為生物傳感器領(lǐng)域中多功能的信號放大器。另外,Liu等[150]利用雜化乳液聚合法將熒光量子點引入到球形聚合物刷的核內(nèi),成功制備了具有熒光特性的聚合物刷,可作為新型的納米探針用于生物醫(yī)學(xué)診斷和治療。

3.5 細胞黏附和抗吸附

細胞黏附和擴散是當今各種生物技術(shù)的核心課題,例如組織工程學(xué)和生物傳感器領(lǐng)域[151]。隨著表面修飾和聚合技術(shù)的不斷進步,結(jié)構(gòu)和功能被精心設(shè)計的聚合物刷能作為細胞-基質(zhì)相互作用的優(yōu)良載體。通常情況下,PMAA刷是抗細胞吸附[152]的材料,但通過加入細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)(例如膠原蛋白[153])或者多肽(例如RGD),使PMAA刷具有細胞黏附的特性,細胞黏附量隨空間上RGD密度的增加而上升。半乳糖是肝細胞脫唾液酸糖蛋白受體的特殊配體,將半乳糖吸附于PMAA刷上能促進肝細胞的黏附[154]。由SI-ATRP方法制備的具有梯度PAA鏈層的PNIPA-PAA共聚刷,在加入RGD功能化后能用于黏附HepG2細胞基質(zhì)。細胞基質(zhì)的拓撲結(jié)構(gòu)和表面特性對細胞的行為、功能及形態(tài)影響很大[155]。短鏈聚合物刷比長鏈聚合物刷更易于細胞黏附和擴散。溫敏性的PNIPA聚合物刷能在不同溫度下方便可控地黏附和釋放細胞。因此,聚合物刷可作為優(yōu)異的模型材料用于細胞黏附。

另一方面,抗生物分子吸附材料一直受到食品工業(yè)、衛(wèi)生材料、日化產(chǎn)品和生物制藥的廣泛關(guān)注,因為這些功能性聚合物能應(yīng)用于抗菌領(lǐng)域(見圖12)。迄今為止,聚合物刷在抗菌材料方面的應(yīng)用還很少?？沟鞍孜接伤蠈右餥157],因此兩性聚合物刷引起了人們的關(guān)注。陰離子PMAA刷在一定程度上能防止細菌的黏附[158],而進一步功能化的PMAA刷能實現(xiàn)抗細菌滋生。具有仿生結(jié)構(gòu)的陰離子聚合物刷也可應(yīng)用于細胞外基質(zhì)或細胞表面進行抗蛋白質(zhì)的非特異性吸附[159]。該陰離子聚合物刷的結(jié)構(gòu)類似于黏多糖,其聚合物鏈與肝素相似。采用PAA刷對纖維素紙進行表面修飾,其抗菌(E.coli)效果優(yōu)于原本的PAA刷和普通的纖維素紙[160]。Chiang等[161]通過改變聚合物刷的尺寸、聚合物鏈層厚度及構(gòu)象,能在抗細胞吸附和細胞黏附之間進行切換。另外,Wu等[162]以磁性聚合物刷為反應(yīng)器,原位制備了納米金屬銀,這種負載銀納米粒子的功能聚合物刷可應(yīng)用于抗菌領(lǐng)域。深入探索細胞對于三維聚合物刷表面的黏附行為,無論是對基礎(chǔ)研究還是應(yīng)用研究都具有重要的意義。

圖12 聚合物刷抗菌材料[156]Fig.12 Antibacterial polymer brushes material[156]

4 總結(jié)與展望

近十幾年來聚合物刷的合成及其應(yīng)用迅速發(fā)展,尤其在生物分子固定和相關(guān)生物醫(yī)藥方面的應(yīng)用研究正在快速發(fā)展。表面修飾技術(shù)的發(fā)展使聚合物刷能可控地與生物分子結(jié)合。近年來的研究主要集中于同時具有多功能的聚合物混合刷,它們具有不同的結(jié)構(gòu)形態(tài)和特殊的響應(yīng)性,接枝的多種官能團使其產(chǎn)生多種功能和刺激響應(yīng)性?？蒲泄ぷ髡邆儗酆衔锼⑴c生物分子相互作用的機理進行了大量的研究,但對于聚合物刷與細胞、細菌、復(fù)合生物分子的相互作用還有待進一步探索。精心設(shè)計的聚合物刷能可控地固載藥物,具有蛋白質(zhì)吸附、細胞黏附、抗菌、防污等功能性。未來隨著合成技術(shù)的不斷進步,更多的智能化、多功能的聚合物刷會不斷涌現(xiàn)。聚合物刷應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究才剛剛起步。預(yù)計在不久的將來,材料化學(xué)、物理化學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的大量相關(guān)研究成果將不斷推動聚合物刷在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

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WANG Si-yi1, GUO Xu-hong2, CHEN Kai-min3

(1.Testing Center,Shanghai Research Institute of Chemical Industry,Shanghai 200062,China;2.State Key Laboratory of Chemical Engineering,School of Chemical Engineering,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 3.College ofChemistry and Chemical Engineering,Shanghai University of Engineering Science,Shanghai 201620,China)

Polymer brush is a structure with polymer chains attached with one end to a curved or planar surface.In recent years,with the development of polymer preparation methods and surface modification technology,the application range of polymer brush is continuously expanded.Relevant researches of polymer brush become one of the hotpots in the area of functional polymeric materials.Polymer brushes with unique structure and surface properties become suitable candidates in the application of biomolecule immobilization,protein separation,enzymatic catalyst and controlled drug delivery.In this review,the latest progress in interactions between polymer brushes and biomolecules is systematically described,and some possible directions for further research are forecasted.

polymer brush; biomolecule; interaction; protein immobilization; enzymatic catalyst

1008-9357(2016)04-0359-018

10.14133/j.cnki.1008-9357.2016.04.001

2016-08-24

國家自然科學(xué)基金(21504052);上海市青年科技英才揚帆計劃(15YF1404800)

王思懌(1986-)，女，上海人，博士，研究方向為新型聚合物材料及化學(xué)品安全性評價。E-mail:wsymsds@163.con

郭旭虹,E-mail:guoxuhong@ecust.edu.cn;陳凱敏，E-mail:kmchen@sues.edu.cn

O63