□ 王 耕 張 薇 陳安東 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

等溫擴(kuò)增熒光法（IAFT）快速檢測食品中沙門菌方法的建立

□ 王 耕 張 薇 陳安東 王振超 北京晟泰勃科技有限公司

沙門菌屬一類革蘭氏陰性桿菌，是引起人類食物中毒的常見細(xì)菌之一。傳統(tǒng)的沙門菌檢測方法主要是經(jīng)過增菌培養(yǎng)，分離瓊脂平板培養(yǎng)等步驟后，通過形態(tài)學(xué)和染色法和各種生化指標(biāo)，如硫化氫氣體、賴氨酸脫羧酶、氧化酶、靛基質(zhì)尿素和KCN等加以鑒定。

等溫擴(kuò)增熒光技術(shù)（Isothermal Amplification Fluorescent Method，IAFT）是核酸體外擴(kuò)增和熒光法技術(shù)的結(jié)合，在恒溫條件下進(jìn)行，通過添加特殊的DNA聚合酶和特異性引物，在擴(kuò)增的同時加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號累積實時監(jiān)控擴(kuò)增過程，實現(xiàn)核酸快速擴(kuò)增和檢測，并對產(chǎn)物做溶解曲線分析。作為一種全新的快速鑒定方法，該方法所需實驗條件簡單、前處理要求低、特異性強(qiáng)、擴(kuò)增速度快，可廣泛用于食源性微生物快速鑒定領(lǐng)域。

本研究應(yīng)用新型核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)建立食品中沙門菌的快速檢測方法，針對其特異性核酸保守序列fimY基因進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，總計使用了16株多種細(xì)菌的菌株，其中8株為沙門菌，結(jié)果表明，除8株沙門菌有陽性擴(kuò)增曲線外，其余菌株均無擴(kuò)增，該方法具有高度特異性。

實驗儀器及材料

材料

沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌菌液；引物（6條）；IMM，optigene Limited公司；細(xì)菌基因組核酸提取試劑盒（STP）。

儀器

genie Ⅱ。

實驗步驟

引物稀釋

將引物稀釋成以下濃度，F(xiàn)IP/BIP：40 pmol/μL；F3/B3：5 pmol/μL；LF/LP：20 pmol/μL。

反應(yīng)體系

IMM 15 μL；引物6 μL；樣本4 μL。

反應(yīng)程序設(shè)定

65 ℃反應(yīng)40 min。溶解曲線98～80 ℃，0.05℃收集一次熒光信號。

樣本制備

1 核酸提取試劑盒

按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

2 加熱煮沸法

取菌液1 mL離心10 min，棄上清后加入去離子水，100 ℃加熱10 min，置于冰上備用。

實驗結(jié)果

實驗結(jié)果顯示，在16株不同的菌株中，只有8株沙門菌對應(yīng)的樣品中出現(xiàn)了S型擴(kuò)增曲線，其他菌株和陰性對照均未出現(xiàn)擴(kuò)增，結(jié)果特異，如圖1所示。

用加熱煮沸法提取核酸后擴(kuò)增結(jié)果，曲線平滑度和擴(kuò)增時間均比使用試劑盒提取的稍差，但特異性一致，如圖2所示。

圖1 擴(kuò)增曲線

圖2 煮沸法擴(kuò)增曲線

討論

本研究使用等溫擴(kuò)增熒光法（IAFT）為基礎(chǔ)建立了沙門菌的檢測體系，與傳統(tǒng)方法比較，其結(jié)果符合率達(dá)到100%。從上述實驗結(jié)果中可看出，樣本僅需一步增菌即可上機(jī)進(jìn)行檢測，除可使用試劑盒提取純度較高的核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增和檢測外，煮沸法抽提同樣適用，且準(zhǔn)確率與傳統(tǒng)方法一致，實現(xiàn)了未知樣本的核酸現(xiàn)場快速檢測。

結(jié)論

集成核酸等溫擴(kuò)增核心技術(shù)，以等溫擴(kuò)增熒光快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)建立了沙門菌IAFT快速檢測技術(shù)體系。同時使用兩種核酸提取方法進(jìn)行驗證，證明其不但可在實驗室進(jìn)行實驗，野外現(xiàn)場同樣適用，不依賴實驗室儀器。

經(jīng)與傳統(tǒng)方法以及PCR法進(jìn)行比價和評價，其準(zhǔn)確率與傳統(tǒng)培養(yǎng)法完全一致，且更為特異、敏感、精確、快速和便捷，適合于任何條件下的現(xiàn)場快速檢測，對于突發(fā)食物中毒等事件可起到第一時間準(zhǔn)確診斷的作用，不僅適用沙門菌，其他常見的致病食源性微生物同樣可用，可為食品安全的質(zhì)控和監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，應(yīng)用前景廣闊。