邵金良，劉興勇，楊東順，樊建麟，杜麗娟，王麗，汪祿樣

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南昆明650223）

咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量比較分析

邵金良，劉興勇，楊東順，樊建麟，杜麗娟，王麗，汪祿樣

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，云南昆明650223）

建立了高效液相色譜，同時(shí)測(cè)定生咖啡豆、烘炒咖啡豆和咖啡粉等樣品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量的方法，同時(shí)采用SPSS主成分分析和聚類分析法對(duì)咖啡及咖啡制品中的葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因等品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行比較分析。樣品經(jīng)甲醇-0.10%磷酸（50∶50）溶液超聲提取后，過PTFE濾膜后在ShiseidoCAPCELLPAKMGⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），以甲醇-0.10%磷酸（12∶88）溶液為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為254，320 nm。結(jié)果表明，葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因在0.05～50.00 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 5～0.999 8，檢出限（LOD）為0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）為0.81～1.16 mg/L；葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的回收率分別為81.75%～117.2%，85.36%～112.4%和83.74%～110.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.06%～9.94%，3.68%～11.2%和2.87%～8.59%。主成分分析結(jié)果表明，葫蘆巴堿、咖啡因和綠原酸是咖啡及咖啡制品的特征品質(zhì)指標(biāo)，綠原酸和咖啡因?yàn)榈?主成分，貢獻(xiàn)率達(dá)到64.932%；葫蘆巴堿為第2主成分，貢獻(xiàn)率為34.944%，2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.876%。以葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量為指標(biāo)，采用聚類分析對(duì)咖啡及咖啡制品樣品進(jìn)行分類，可將咖啡及咖啡制品分為兩大類，聚類分析結(jié)果表明，云南不同咖啡產(chǎn)品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量具有一定的差異，可為云南咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)數(shù)據(jù)和參考。

咖啡及咖啡制品；葫蘆巴堿；綠原酸；咖啡因；比較分析

咖啡（coffea spp.）是茜草科（Rubiaceae）咖啡屬（coffea）常綠灌木或小喬木，與茶葉、可可并稱為世界三大飲料，其消費(fèi)量是可可的2倍，是茶葉的3倍。近年來，咖啡產(chǎn)業(yè)在我國(guó)發(fā)展比較迅速，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，已成為獨(dú)具優(yōu)勢(shì)的特色產(chǎn)業(yè)[1-2]。葫蘆巴堿為尼克酸甲基化的產(chǎn)物，是植物體內(nèi)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）代謝或轉(zhuǎn)化而產(chǎn)生的，具有降血糖、抗腫瘤等功效，其含量與咖啡品種、生長(zhǎng)環(huán)境和加工工藝有關(guān)[3-4]。綠原酸為咖啡酸與奎尼酸形成的酯，是咖啡中獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗腫瘤、保肝利膽、清除自由基等功效[5-6]。咖啡因是存在于許多天然植物（如茶葉、咖啡豆、可可豆等）中的一類屬于甲基黃嘌呤的生物堿，是一種中樞神經(jīng)興奮劑，對(duì)心腦血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤化療的生化調(diào)節(jié)、神經(jīng)官能癥和偏頭痛等均有積極作用[7-8]，呈典型的苦味，是咖啡中較為重要的風(fēng)味物質(zhì)[9]?？Х榷菇?jīng)過烘焙，綠原酸、葫蘆巴堿、多糖、脂肪和蛋白質(zhì)等發(fā)生不同程度的美拉德、Strecker降解、焦糖化等化學(xué)反應(yīng)，生成吡嗪類、呋喃類、吡咯類、吡喃類和吡啶類化合物，還有大量的醛類、酮類、酚類、酯類、醇類化合物，這些復(fù)雜的化合物形成了咖啡的特征風(fēng)味[10-12]。有關(guān)葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因等化合物的分析國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道，檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[13]、毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法[14]、液相色譜-質(zhì)譜法[15]和分光光度法[16]等，但是采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定咖啡及其制品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量的研究報(bào)道較少。

云南具有低緯度、高海拔、晝夜溫差大等獨(dú)特的氣候和多變的高原立體地理環(huán)境，特別適合小粒咖啡的生長(zhǎng)，種植的咖啡具有口味層次多樣化等優(yōu)點(diǎn)，是全國(guó)最大的咖啡生產(chǎn)和出口基地[17-20]。受氣候和土壤等環(huán)境因素的影響，不同產(chǎn)地的咖啡其葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量存在一定的差異。

本研究收集云南本地46份生咖啡豆、烘焙咖啡豆半成品和速溶咖啡噴干粉等樣品，通過優(yōu)化色譜分離條件，建立高效液相色譜法，同時(shí)測(cè)定并進(jìn)一步比較云南不同咖啡產(chǎn)品葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因等重點(diǎn)品質(zhì)指標(biāo)的含量差異性，以期為云南咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供科學(xué)參考和借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

所用試驗(yàn)材料均于2014年6月至2015年7月在云南本地超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買，生咖啡豆和烘焙咖啡豆粉碎后過0.297 mm篩，備用。

甲醇（色譜純）：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；水為娃哈哈飲用純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；葫蘆巴堿、綠原酸、咖啡因?qū)φ掌罚ń?jīng)HPLC峰面積歸一化法測(cè)定，純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98%）：成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（在線脫氣機(jī)，四元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，2998二極管陣列檢測(cè)器，Empower 2色譜數(shù)據(jù)工作站）：美國(guó)Waters公司產(chǎn)品；JJ200電子分析天平：江蘇省常熟市雙杰測(cè)試儀器廠產(chǎn)品；KQ500-E型超聲清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理精密稱取0.50 g咖啡樣品，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇-0.10%磷酸水溶液（50∶50），室溫下超聲波（功率200 W，頻率40 kHz）提取10 min，靜置，放冷，轉(zhuǎn)移定容于50 mL容量瓶中；繼續(xù)加入20 mL甲醇-0.10%磷酸水溶液（12∶88）到250 mL具塞錐形瓶中，室溫下超聲（功率200 W，頻率40 kHz）提取10 min，靜置，放冷，合并濾液到50 mL容量瓶中，用甲醇-0.10%磷酸水溶液（50∶50）定容，過0.45 μm濾膜備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取葫蘆巴堿、綠原酸、咖啡因的對(duì)照品100 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，搖勻，得到單一對(duì)照品溶液；然后分別量取上述對(duì)照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，并用甲醇定容，得到葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合對(duì)照品溶液，4℃儲(chǔ)存，備用。

1.3.3 液相色譜條件Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流動(dòng)相選用甲醇-0.10%磷酸（12∶88），流速1.00 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：葫蘆巴堿和咖啡因254 nm、綠原酸320 nm，柱溫35.0℃，進(jìn)樣量10.0 μL。

1.3.4 高效液相色譜檢測(cè)方法的建立

1.3.4.1 線性方程配制葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.05，0.10，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0，50.0 mg/L系列標(biāo)準(zhǔn)工作液按照1.3.3方法進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定，以葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的峰面積A（mAU）為縱坐標(biāo)，葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的濃度C（mg/L）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限（LOD）為3倍的信噪比，定量限（LOQ）為10倍的信噪比[21]。

1.3.4.2 準(zhǔn)確度和精密度[22]準(zhǔn)確度：分別以生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉樣品作為空白基質(zhì)，添加已知質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3方法測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算回收率。

精密度：分別以生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉樣品作為空白基質(zhì)，根據(jù)待測(cè)樣品目標(biāo)化合物的含量，添加低、中、高質(zhì)量濃度的葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3方法測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因加標(biāo)回收的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft office excel 2007計(jì)算平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)咖啡及咖啡制品葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、聚類分析和主成分分析[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜條件的優(yōu)化和建立

2.1.1 液相色譜流動(dòng)相的優(yōu)化取配制好的含有葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的混合對(duì)照品溶液，按1.3.1處理，選擇Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱作為分離柱，以甲醇-0.10%磷酸溶液為流動(dòng)相。結(jié)果表明，增加流動(dòng)相中甲醇的比例可以加快分離，但葫蘆巴堿出峰時(shí)間過早，不利于色譜分離；降低流動(dòng)相中甲醇的比例可以使分離度變大，但分離時(shí)間延長(zhǎng)，峰形易變寬。兼顧分離速度和效果的基礎(chǔ)上，確定甲醇-0.10%磷酸（12∶88）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min時(shí)，分離效果較好（圖1，2）。

2.1.2 線性范圍、檢出限和定量限葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因在0.05～50.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 5～0.999 8，檢出限（LOD）為0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）為0.81～1.16 mg/L（表1）。

表1 3種化合物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度方法的回收率和精密度（n＝5）如表2所示。

表2 方法的回收率和精密度（n＝5）

從表2可以看出，生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉樣品等3種供試樣品，葫蘆巴堿的回收率為81.75%～117.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.06%～9.94%；綠原酸的回收率為85.36%～112.40%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.68%～11.20%；咖啡因的回收率為83.74%～110.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.87%～8.59%。

2.2 供試樣品葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量的分析測(cè)定

由表3，4可知，咖啡及其咖啡制品中均含有葫蘆巴堿、咖啡因和綠原酸等3種化合物，且不同樣品同一化合物其質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05）?？Х燃翱Х戎破泛J巴堿含量為0.09%～1.41%，其含量平均值大小為生咖啡豆＞速溶咖啡冷凍粉＞速溶咖啡噴干粉＞速溶咖啡噴霧粉＞速溶咖啡凝聚粉＞焙炒咖啡豆=速溶咖啡凍干粉；綠原酸含量為0.32%～6.24%，其含量平均值大小為生咖啡豆＞速溶咖啡冷凍粉＞速溶咖啡噴干粉＞速溶咖啡噴霧粉＞速溶咖啡凝聚粉＞速溶咖啡凍干粉＞焙炒咖啡豆；咖啡因含量為1.10%～4.62%，其含量平均值大小為速溶咖啡噴霧粉＞速溶咖啡冷凍粉＞速溶咖啡凍干粉＞速溶咖啡噴干粉＞速溶咖啡凝聚粉＞焙炒咖啡豆＞生咖啡豆。

表3 供試咖啡及咖啡制品類別及葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量%

表4 咖啡及咖啡制品葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量的方差分析%

咖啡及其咖啡制品中綠原酸含量差異變化最大，其變異系數(shù)高達(dá)180.20%，數(shù)據(jù)離散程度大，不同供試樣品指標(biāo)測(cè)定值差異大，這一結(jié)果與試驗(yàn)選擇的不同加工工藝咖啡及產(chǎn)品有關(guān)；咖啡因次之，變異系數(shù)為101.80%；差異較小的為葫蘆巴堿，其變異系數(shù)為37.94%。

2.3 主成分分析

主成分分析的目的之一是用盡可能少的因子來解釋觀測(cè)到的變量，主成分的特征根及貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)[24-25]。表5描述了主成分分析初始解對(duì)原有變量總體描述情況，其中，綠原酸和咖啡因?yàn)榈?主成分，貢獻(xiàn)率達(dá)到64.932%；葫蘆巴堿為第2主成分，貢獻(xiàn)率為34.944%，2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.876%。

表5 總方差解釋

由圖3主成分散點(diǎn)圖可知，生咖啡豆與咖啡制品區(qū)別較明顯，生咖啡豆綠原酸含量比較高，由于綠原酸在整個(gè)烘焙加熱過程中，受熱分解，其酯鍵斷裂，從而生成奎寧酸及阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸等物質(zhì)，使綠原酸的含量急劇下降；咖啡因熱穩(wěn)定性比較強(qiáng)，在烘焙加熱過程中含量較為穩(wěn)定，咖啡生豆內(nèi)含10%左右的水分，經(jīng)過高溫脫水和高溫反應(yīng)等工藝，生咖啡豆中的水分逐漸減少，焙炒咖啡豆和速溶咖啡粉等樣品比生咖啡豆咖啡因含量高；葫蘆巴堿受熱分解，生成大量的CO2及風(fēng)味物質(zhì)，所以，焙炒咖啡豆和速溶咖啡粉等制品的葫蘆巴堿含量較生咖啡豆急劇下降。

2.4 聚類分析

進(jìn)一步對(duì)7種類型的咖啡及咖啡制品46個(gè)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，聚類距離采用歐氏距離平方法，聚類方法采用ward法，得到46個(gè)咖啡及咖啡制品的聚類樹狀圖（圖4）。

由圖4可知，46份咖啡及咖啡制品用綠原酸、咖啡因和葫蘆巴堿含量作為聚類變量，可以把樣品分為兩大類，生咖啡聚為一類；焙炒咖啡豆、速溶咖啡噴干粉、速溶咖啡凝聚粉、速溶咖啡凍干粉、速溶咖啡冷凍粉和速溶咖啡噴霧粉聚為一類。通過比較聚類分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，綠原酸、咖啡因和葫蘆巴堿在咖啡不同加工制品之間存在一定的差異，焙炒咖啡豆與咖啡粉區(qū)別不明顯，但從圖中可以看出，焙炒咖啡豆、速溶咖啡噴干粉及凝聚粉聚在一起，速溶咖啡凍干粉、冷凍粉及噴霧粉聚在一起，這與主成分分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究建立了咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的高效液相色譜定量分析方法，葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因在0.05～50.0 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 5～0.999 8，檢出限（LOD）為0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）為0.81～1.16 mg/L；葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因的回收率分別為81.75%～117.2%，85.36%～112.4%和83.74%～110.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為4.06%～9.94%，3.68%～11.2%和2.87%～8.59%?？Х燃翱Х戎破分校J巴堿、綠原酸和咖啡因含量分別為0.09%～1.41%，0.32%～6.24%和1.10%～4.62%。本研究提供了咖啡及咖啡制品中葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因含量測(cè)定的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，為咖啡的深入研究提供了科學(xué)依據(jù)。主成分分析結(jié)果表明，葫蘆巴堿、綠原酸和咖啡因是咖啡及咖啡制品的特征品質(zhì)指標(biāo)之一，綠原酸和咖啡因?yàn)榈?主成分，貢獻(xiàn)率達(dá)到64.932%，葫蘆巴堿為第2主成分，貢獻(xiàn)率為34.944%，2個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.876%。以葫蘆巴堿、咖啡因和綠原酸含量為指標(biāo)采用聚類分析可將供試樣品分為生咖啡和咖啡制品兩大類，聚類分析結(jié)果在一定程度上表明，綠原酸、葫蘆巴堿和咖啡因在咖啡不同加工制品之間存在一定的差異。

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［25］劉小芳，薛長(zhǎng)湖，王玉明，等.刺參中無機(jī)元素的聚類分析和主成分分析[J].光譜學(xué)與光譜分析，2011，31（11）：3119-3122.

Comparative Analysis on Trigonelline,Chlorogenic Acid and Caffeine Content in Coffee and Its Product

SHAO Jin-liang，LIU Xing-yong，YANG Dong-shun，F(xiàn)AN Jian-lin，DU Li-juan，WANG Li，WANG Lu-xiang
（Institute of Agriculture Quality Standards＆Testing Technique，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming650223，China）

A analytic method for simultaneous determination of trigonelline,chlorogenic acid and caffeine content in the green coffee beans,roasted coffee beans and coffee powder was developed by using high performance liquid chromatography.The content trigonelline,chlorogenic acid and caffeine of coffee and its product were compared by principal component analysis and cluster analysis using SPSS software.The sample was methanol-0.10%phosphoric acid（50∶50）solution after ultrasonic extraction,over PTFE membrane after Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18column（4.6 mm×250 mm,5.0 μm）column using methanol-0.10%phosphoric acid（12:88）solution as mobile phase isocratic elution,detection wavelength of254,320 nm.Trigonelline,chlorogenic acid and caffeine in the 0.05-50.00 mg/L range with good linear correlation coefficient（r）was 0.999 5-0.999 8,the detection limit（LOD）was 0.28-0.41 mg/L,the limit of quantification（LOQ）was 0.81-1.16 mg/L;rate of recovery of trigonelline,chlorogenic acid and caffeine were 81.75%-117.2%,85.36%-112.4%and 83.74%-110.9%,respectively,relative standard deviations（RSD）were 4.06%-9.94%,3.68%-11.2%and 2.87%-8.59%,respectively.Principal component analysis showed that trigonelline,caffeine and chlorogenic acid was characterized by quality indicators coffee and coffee products,chlorogenic acid and caffeine as the first principal component,the contribution rate was 64.932%,the second main trigonelline component contribution rate 34.944%,the two main components of the cumulative contribution rate 99.876%.In trigonelline,chlorogenic acid and caffeine content of indicators by cluster analysis of samples of coffee and coffee products were classified,coffee and its product could be divided into two categories,cluster analysis showed a certain extent different Yunnan coffee products trigonelline,chlorogenic acid and caffeine other key indicators of the quality of content differences,could provide scientific data and reference for the development of Yunnan coffee industry.

coffee and its product;trigonelline；chlorogenic acid;caffeine；comparative analysis

TS273

A

1002-2481（2016）02-0158-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.07

2015-10-22

農(nóng)業(yè)部2014年行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂項(xiàng)目（農(nóng)質(zhì)發(fā)2014[61]號(hào)-219）；云南省科技惠民專項(xiàng)（農(nóng)業(yè)）重點(diǎn)項(xiàng)目（2014RA054）；云南省科技創(chuàng)新平臺(tái)建設(shè)計(jì)劃（公共科技服務(wù)）項(xiàng)目（2014DA001）

邵金良（1979-），男，云南陸良人，副研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與分析檢測(cè)工作。汪祿樣為通信作者。