張春鳳，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

谷子秸稈黃色素提取的響應面分析

張春鳳，郝林

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷030801）

以谷子秸稈為原料，研究微波-乙醇助提秸稈中黃色素的工藝條件。通過單因素試驗考察乙醇體積分數(shù)（V/V）、微波功率、微波輻射時間、料液比及提取次數(shù)對谷子秸稈中黃色素提取的影響，并由因子篩選試驗選出顯著影響因素；在此基礎上，采用Box-Behnken響應面試驗設計確定最佳工藝。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：72%乙醇（V/V）為提取劑，料液比為1∶20（g/mL），320 W微波處理30 s，提取3次，得到色素提取液平均吸光度為0.634，與軟件預測值0.641基本一致（相對誤差1.09%）。

谷子秸稈；微波-乙醇助提；黃色素；響應面

近年來，食品中合成色素的安全性已引起越來越多的關注。據(jù)文獻報道[1-4]，合成色素在不同程度上存在慢性毒副作用和致癌性，其應用受到限制和禁止；而天然色素主要來自于動、植物組織，安全性和營養(yǎng)價值高，具有一定的生物活性和抑菌、抗菌作用，且其色調(diào)與食品天然色調(diào)接近。這些優(yōu)勢決定了天然色素必將取代合成色素，成為消費的主流。黃色素是一類重要的天然色素，占色素總需求量的60%，具有廣闊的應用前景[5]。目前，常用的黃色素種類不多，且價格昂貴。因此，尋求和挖掘天然色素新資源，對保障人民身體健康和促進食品工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。

谷子是我國種植面積較大的雜糧作物之一[6]。山西省素有“小雜糧王國”之稱，每年都會生產(chǎn)得到大量的谷子秸稈。隨著人民生活水平的提高，秸稈已不再適合作為家庭能源使用；而且秸稈回收利用成本高，運輸不便，效益不明顯。因此，就地焚燒成為農(nóng)戶的首選，這會造成嚴重的大氣污染。有研究表明，谷物中的色素大部分屬于類胡蘿卜素、花色素，其種皮或秸稈、胚芽中含有大量的天然色素[7]。目前，國內(nèi)外對玉米和小米黃色素研究報道較多，而對谷子秸稈中黃色素的研究尚未見報道。微波法提取玉米黃色素具有時間短、耗能少、效率高等特點，被廣泛應用于天然色素的生產(chǎn)中[8]。微波法提取秸稈黃色素，特別是響應面法優(yōu)化其提取工藝的研究未見報道。提取谷物中的色素類物質(zhì)，不僅為天然色素開拓了新資源，又為農(nóng)副產(chǎn)物的深細加工和增值、谷子秸稈的處理方法開辟了一條新途徑[9-11]。

本試驗以張雜谷10號的秸稈為原料，以一定濃度的乙醇溶液為提取劑，微波提取黃色素。在單因素試驗和因子篩選試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面試驗設計進行工藝條件的優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝，為谷子秸稈的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

谷子秸稈（張雜谷10號）來自山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)作站；無水乙醇為國產(chǎn)分析純。

UV WinLab V6紫外可見分光光度計（珀金埃爾默儀器有限公司）；JDG-0.2真空凍干試驗機（蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司）；R2010-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；722 G可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；HCP-100型華晨高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）；ML-2080 EG型微波爐（青島膠南海爾微波制品有限公司）；TDL-4低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試驗方法

本試驗于2014年12月至2015年1月在山西農(nóng)業(yè)大學食品學院實施完成。

1.2.1 色素提取工藝原料→清洗→40℃熱風干燥→粉碎→過篩（0.25 mm）→微波輔助一定濃度乙醇提取→抽濾→離心（4 000 r/min，10 min）→減壓濃縮（45℃，0.08 MPa）→初步純化→冷凍干燥（板溫40℃，真空度40～50 Pa）→黃色素粗提物（橘紅色粉末）。

1.2.2 最大吸收波長的確定將色素提取液稀釋至一定濃度（以吸光度大小計），用紫外可見分光光度計在380～800 nm進行光譜掃描，確定該色素在可見光范圍內(nèi)的最大吸收波長。

1.2.3 單因素試驗分別稱取一定量秸稈粉末，加入相應提取劑，于反應裝置中反應一段時間，抽濾、離心后取上清液，在最大吸收波長處測其吸光度。每個處理重復3次，取平均值。以乙醇體積分數(shù)（V/V）40%，60%，80%，100%，微波功率160，320，480，640，800 W，微波輻射時間10，20，30，40，50，60 s，料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35（g/mL）及提取次數(shù)1，2，3次分別進行單因素試驗，確定最佳的提取工藝參數(shù)。

1.2.4 Plackett-Burman因子篩選試驗在單因素試驗基礎上，對乙醇體積分數(shù)（X1）、微波功率（X2）、微波輻射時間（X3）、料液比（X4）和提取次數(shù)（X5）進行PB試驗，以色素提取液吸光度為響應值。每個因素取2水平（以-1，1編碼），自變量因素水平列于表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平

1.2.5 響應面法優(yōu)化提取工藝在單因素和因子篩選試驗基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[12]，以乙醇體積分數(shù)、微波輻射時間和提取次數(shù)3個顯著影響因子為自變量，吸光度為評價指標，設計3因素3水平的響應面試驗，自變量因素水平如表2所示。其他因素條件為：微波輻射功率320 W，料液比1∶20（g/mL）。

表2 響應面試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

以95%乙醇溶液為提取劑，380～800 nm波長內(nèi)對谷子秸稈黃色素提取液進行光譜掃描。該色素在444 nm處有最大吸收峰，即最大吸收波長為444 nm（圖1）。因最大吸收波長處靈敏度大，吸光度隨物質(zhì)濃度變化的幅度最大，也可避免其他物質(zhì)的干擾，所以，選擇最大吸收波長為444 nm。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對色素提取的影響從圖2可以看出，隨乙醇體積分數(shù)增大，色素提取液吸光度逐漸增大；當乙醇體積分數(shù)達到80%時，色素提取液吸光度最大；超過80%后，色素提取液的吸光度逐漸減小。這可能是由于乙醇溶液濃度太低時，水分含量多，不能有效地將色素溶出；若乙醇濃度太高，會溶出大量醇溶蛋白，蛋白質(zhì)與色素形成復合物，離心時會帶走部分色素，使其含量下降。因此，最佳乙醇體積分數(shù)以80%為宜。

2.2.2 微波輻射功率對色素提取的影響由圖3可知，隨微波功率增大，色素提取液吸光度逐漸增大，在320～640 W之間達到峰值。這可能是由于隨微波功率逐漸增強，機械振動效應加強，當功率大于320 W時，微波對秸稈的組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了較強的破壞作用，體系中有微小的淀粉粒析出，這些淀粉粒會吸附部分色素分子，被吸附的色素分子在隨后的離心過程中會隨淀粉等大分子顆粒發(fā)生沉降分離，從而導致提取液中色素含量下降[13]；同時又由于微波功率太大，易導致熱效應，使提取物體系因溫度急劇上升而爆沸，破壞了色素結(jié)構(gòu)，且容易發(fā)生危險[14-15]。因此，最佳微波輻射功率以320W為宜。

2.2.3 微波輻射時間對色素提取的影響由圖4可知，當微波功率一定時，隨微波輻射時間的延長，色素提取液的吸光度逐漸增大；當微波輻射時間達到20 s時，色素提取液吸光度最大，超過20 s后，色素提取液吸光度又逐漸下降。這可能是由于同等質(zhì)量的物料在相同功率條件下，微波輻射時間越長，提取物體系吸收的微波能就越多，物料溫度也會越高，可加快體系擴散速度[16]；當微波輻射時間過長，提取物長期處于較高溫度下，色素的部分結(jié)構(gòu)可能遭到破壞。因此，最佳微波輻射時間以20 s為宜。

2.2.4 料液比對色素提取的影響由圖5可知，隨料液比減少，色素提取液吸光度逐漸增大；當料液比為1∶25（g/mL）時，色素提取液吸光度最大，而小于1∶25（g/mL）時，吸光度逐漸下降。這可能是由于當料液比較高時，提取劑與物料的濃度差較小，色素提取不完全；隨著料液比的減小，溶劑體系的擴散速度增大，有利于色素溶出；但當料液比低于1∶25（g/mL）后，吸光度基本不變，可能是色素已完全浸出。當料液比為1∶20，1∶25（g/mL）時，吸光度變化不大，考慮到過大提取劑用量會造成溶劑浪費，后續(xù)濃縮回收困難，生產(chǎn)成本高。因此，最佳料液比以1∶20（g/mL）為宜。

2.2.5 提取次數(shù)的確定由圖6可知，隨提取次數(shù)增加，色素提取液的吸光度逐漸增大，但由于提取次數(shù)過多，導致溶劑浪費，浸提時間延長，且后續(xù)工作繁多。因此，提取次數(shù)以2次為宜。

2.3 Plackett-Burman試驗因子篩選結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗設計與結(jié)果如表3所示，經(jīng)Minitab 16.0軟件對表3進行方差分析，結(jié)果如表4所示。

從表4可以看出，該模型顯著（P＜0.05），說明此模型可以進行因子的篩選。乙醇體積分數(shù)、微波輻射時間和提取次數(shù)對谷子秸稈色素提取液的吸光度影響顯著，而微波功率和料液比對吸光度影響不顯著。因此，選擇乙醇體積分數(shù)、微波輻射時間和提取次數(shù)進行響應面試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結(jié)果

表4 Plackett-Burman試驗方差分析

2.4 響應面結(jié)果分析

2.4.1 回歸模型的建立及方差分析按照表5進行組合試驗，采用Design Expert 8.0.5統(tǒng)計分析軟件進行方差分析，擬合后得到乙醇體積分數(shù)、提取次數(shù)和微波輻射時間的二次多項式回歸方程。

對回歸模型（1）進行方差分析，結(jié)果列于表6。從表6可以看出，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬相對于純誤差不顯著（P＞0.05），說明試驗誤差小?；貧w模型的決定系數(shù)R2為0.992 6，說明響應值的變化有99.26%來自于自變量。該回歸模型的自變量與響應值之間存在良好的線性關系，對試驗的擬合度較好，可以客觀地描述各自變量與響應值之間的真實關系。

從表6可以看出，一次項A和C對秸稈黃色素吸光度的影響極顯著，B對秸稈黃色素的影響不顯著；交互相AC對秸稈黃色素的影響極顯著，而AB和BC對其的影響不顯著；二次項A2對其影響極顯著，B2和C2對其影響不顯著。說明各因素對谷子秸稈黃色素提取工藝的影響不是簡單的線性關系[17]。

表5 響應面設計方案與試驗結(jié)果

表6 回歸模型的方差分析

2.4.2 各因素交互項的響應面分析[18]從圖7可以看出，乙醇體積分數(shù)和提取次數(shù)的交互作用對該色素的提取影響極顯著，該曲面較陡，響應值變化越大，且軸向等高線密集；乙醇體積分數(shù)對色素提取的影響不及提取次數(shù)顯著，曲面緩和，軸向等高線相對稀疏。

由圖8可知，微波輻射時間和乙醇體積分數(shù)的交互作用對該色素的提取影響不顯著；微波輻射時間對秸稈黃色素吸光度的影響不顯著。圖7，8結(jié)果與回歸方程的方差分析結(jié)果相吻合，說明響應面試驗設計可以較好地反映自變量對響應值的影響。

2.4.3 提取工藝的優(yōu)化及驗證試驗通過回歸方程的預測，谷子秸稈黃色素的最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)72%，料液比1∶20（g/mL），微波輻射功率320 W，微波輻射時間30 s，提取3次。按最佳提取條件進行驗證試驗，重復3次，得色素提取液平均吸光度為0.634，與軟件預測值0.641基本一致（相對誤差1.09%）。這也說明響應面法適合對色素的提取進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 討論與結(jié)論

體積分數(shù)高的乙醇提取會造成大量醇溶蛋白溶出，且試驗成本較高，而體積分數(shù)低的乙醇因水分含量高，物料吸收微波能少，色素溶出也較少。本試驗優(yōu)化得到的最佳乙醇體積分數(shù)為72%，既減少了醇溶蛋白等雜質(zhì)，降低了成本，又保證了提取效果。本試驗設計了多個單因素試驗，并采用Plackett-Burman因子篩選試驗確定出主要影響因子，避免了因為單因素選擇不佳而造成響應面模型的不顯著，進而不能真實地描述自變量與響應值之間的關系。

本研究在單因素和因子篩選試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計原理，建立各影響因素的二次回歸模型。利用統(tǒng)計學方法對該模型進行回歸分析，得出該回歸模型可以客觀地描述各自變量與響應值之間的真實關系。一次項A和C對秸稈黃色素吸光度的影響極顯著，B影響不顯著；交互相AC影響極顯著，AB和BC影響不顯著；二次項A2影響極顯著，B2和C2影響不顯著。說明各因素對谷子秸稈黃色素提取工藝的影響不是簡單線性關系。通過響應面分析可知，微波-乙醇助提法可實現(xiàn)高效、快速提取。響應面分析結(jié)果表明，秸稈黃色素最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)為72%（V/V），料液比1∶20（g/mL），微波功率320 W，微波處理時間30 s，提取3次。在此條件下進行驗證試驗，得到黃色素提取液的吸光度為0.634，這與預測值0.641基本一致。

［1］王海棠，田子俊，陽勇，等.小米黃色素的研究Ⅱ—提取工藝及穩(wěn)定性[J].中國糧油學報，2005，20（5）：40-45.

［2］Munawar N，Jamil H M T H.The islamic perspective approach on plant pigments as natural food colourants[J].Procedia Social and Behavioral Sciences，2014，121：193-203.

［3］李宗哲，李德遠，蘇丹，等.天然色素加工新進展及發(fā)展對策研究[J].中國食物與營養(yǎng)，2015，21（2）：39-42.

［4］Assous MT M，Abdel H MM，Medany G M.Evaluation of red pigment extracted from purple carrots and its utilization as antioxidant and natural food colorants[J].Annals of Agricultural Sciences，2014，59（1）：1-7.

［5］呼延曉穎，單磊，達超超，等.黃色素提取工藝的研究進展[J].飲料工業(yè)，2011，14（2）：9-1.

［6］楊延兵，管延安，秦嶺，等.不同地區(qū)谷子小米黃色素含量與外觀品質(zhì)研究[J].中國糧油學報，2012，27（1）：14.

［7］張丙華，張暉，朱科學.谷物色素研究進展[J].糧食與食品工業(yè)，2009，16（4）：18-21.

［8］Farhat A，F(xiàn)abiano-Tixier A，Maataoui M E，et al.Microwave steam diffusion fou extraction of essential oil from orange peel：Kinetic data，extract's global yield and mechanism[J].Food Chemistry，2011，125（1）：255-261.

［9］Tang J，Mao R，Tung MA，et al.Gelling temperature，gel clarity and texture of gellan gels containing fructose or sucrose[J].Carbohydrate Polymers，2001，44：197-209.

［10］Pallaroni L，Von Holst C，Eskiisson C，et al.Microwave-assisted extraction of zearalenone from wheat and corn[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，374（1）：161-166.

［11］Grigonis D，Venskutonis P R，Sivik B，et al.Comparation of different extraction techniques for isolation of antioxidants from sweet grass（Hierochlo? odorata）[J].The Journal of Supercritical Fluids，2005，33（3）：223-233.

［12］Dong C H，Xie X Q，Wang X L，et al.Application Box-behnken design in optimization for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J].Food and Bioproducts Processing，2008，53：1-6.

［13］趙猛，朱洪梅.小米黃色素超聲波輔助提取工藝的響應面優(yōu)化[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2009，37（10）：182-183.

［14］Dragan Znidarcic，Dean Ban，Helena Sirelj.Carotenoid and chlorophyll composition of commonly consumed leafy vegetables in Mediterranean countries[J].Food Chemistry，2011，129：1164-1168.

［15］李曉玲，陳相艷，王世清，等.超微粉碎輔助超聲-微波法提取玉米黃色素[J].中國食品學報，2014，14（8）：99-106.

［16］姚壯和.微波輔助提取芒果皮黃色素的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（8）：1973-1975.

［17］Alisa Perry，Helen Rasmussen，Elizabeth J Johnson.Xanthophyll（lutein，zeaxanthin）content in fruits，vegetables and corn and egg products[J].Journal of Food Compostion and Analysis，2009，22：9-15.

［18］趙廣河，謝慧媛，陳振林.微波輔助提取桃金娘色素的工藝研究[J].中國食品添加劑，2015（1）：71-76.

Analysis of Response Surface about Yellow Pigment Extracted From Millet Straw

ZHANG Chun-feng，HAO Lin
（College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The paper took the millet straw as raw material to study the extraction technology of yellow pigment by microwave-ethanol solution.Through the single factor experiments,it investigated the influence of some factors on the extraction of yellow pigment from millet straw,such as ethanol content（V/V）,microwave power,microwave processing time,solid-liquid ratio and extraction times.Then it chose significantly influencing factors by factor screening test.Based on that,the paper used the Box-Behnken response surface method to design the experiment to determine the best process.The result showed that the optimum extracted conditions was as follows:72%ethanol（V/V）was extracting agent,solid-liquid ratio was 1∶20（g/mL）,320 W microwave processed 30 s,extracting 3 times.The average absorbance of pigment extracting solution was 0.634,which was similar with the predicted value（the relative error was 1.09%）.

millet straw;microwave-ethanol extraction;yellow pigment;response surface

S515

A

1002-2481（2016）02-0242-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.29

2015-10-13

張春鳳（1990-），女，山東濟寧人，在讀碩士，研究方向：現(xiàn)代雜糧生產(chǎn)。郝林為通信作者。