常林，楊瑞麗，陳紅兵，陽(yáng)艷麗

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院,南京210009；2東南大學(xué))

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·基礎(chǔ)研究·

肝癌組織中父系表達(dá)基因10的表達(dá)變化

常林1，楊瑞麗2，陳紅兵1，陽(yáng)艷麗1

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院,南京210009；2東南大學(xué))

目的 觀察不同肝癌細(xì)胞系、肝癌和鄰近癌旁組織及不同分化程度的肝癌組織中印記基因父系表達(dá)基因10(PEG10)的表達(dá)。方法 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室制備的高特異性抗PEG10單克隆抗體，采用Westernblotting法檢測(cè)肝癌細(xì)胞系MHCC97L、HepG2、BEL-7404、HepG2.215、SMMC-7721細(xì)胞及正常肝細(xì)胞系L02、卵巢癌細(xì)胞系HO8910、食管癌細(xì)胞系EC9706中PEG10表達(dá)；采用免疫組化法檢測(cè)不同分化程度肝癌組織、癌旁組織中PEG10表達(dá)。肝癌分化程度與PEG10表達(dá)間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。結(jié)果 五株肝癌細(xì)胞系均較強(qiáng)表達(dá)PEG10蛋白，而正常肝細(xì)胞系L02和卵巢癌細(xì)胞系HO8910、食管癌細(xì)胞系EC9706均不表達(dá)PEG10蛋白。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，同一病例的肝癌組織高表達(dá)PEG10蛋白，而相應(yīng)的鄰近癌旁組織低表達(dá)或不表達(dá)PEG10蛋白。相關(guān)分析顯示，肝癌分化程度與PEG10蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.822，P<0.05)。結(jié)論P(yáng)EG10在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，而在正常肝組織、肝細(xì)胞中及其他器官的腫瘤細(xì)胞株中均不表達(dá)；PEG10表達(dá)與肝癌分化程度呈正相關(guān)關(guān)系。

肝腫瘤；印記基因父系表達(dá)基因10；單克隆抗體

父系表達(dá)基因10(PEG10)是2001年Ryuichi等[1]在肝細(xì)胞癌組織中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的遺傳印記基因，是一個(gè)反轉(zhuǎn)座子衍生來(lái)的父系遺傳印記基因。本課題組已于早前制備出高特異性的抗PEG10抗體兩株[2]。研究表明，PEG10基因的高表達(dá)與腫瘤特別是肝癌發(fā)生關(guān)系密切[3]。目前，關(guān)于PEG10基因與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)相關(guān)性的研究較少，Okabe等[4]于2003年發(fā)現(xiàn)PEG10基因在絕大多數(shù)人肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中高表達(dá),癌旁組織表達(dá)水平很低或不表達(dá)；從病變前癌旁肝組織到病變?cè)缙贖CC組織再到晚期HCC組織,其PEG10基因表達(dá)呈明顯上升趨勢(shì)。隨后，有研究顯示，PEG10基因在正常肝組織及良性肝臟疾病組織中均不表達(dá)，而在肝癌中表達(dá)增強(qiáng)[5]。2007～2010年，我們觀察了不同肝癌細(xì)胞系、肝癌和鄰近癌旁組織及不同分化程度的肝癌組織中PEG10的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系MHCC97L、HepG2、BEL-7404、HepG2.215、SMMC-7721細(xì)胞；正常肝細(xì)胞系L02；卵巢癌細(xì)胞系HO8910、食管癌細(xì)胞系EC9706。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海西塘公司；抗a-tubulin單抗，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、生物素標(biāo)記羊抗小鼠IgG及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記親和素購(gòu)自Sigma公司；抗PEG10單抗為本實(shí)驗(yàn)室制備(3E8株)；ECL顯色底物(Maximum Sensitivity Substrate)購(gòu)自上海吉泰生物有限公司；DAB顯色液購(gòu)自中杉金橋公司；PVDF膜購(gòu)自南京創(chuàng)瑞公司；X線片購(gòu)自美國(guó)Kodak公司。15對(duì)同一病例肝癌及鄰近癌旁組織蠟塊，由南京市鼓樓醫(yī)院和南京市第一人民醫(yī)院惠贈(zèng)。病理切片由東南大學(xué)病理教研室制作。

1.2 細(xì)胞系蛋白樣本制備 用1×PBS懸浮細(xì)胞；反復(fù)凍融懸浮細(xì)胞3～4次；離心，10 000 r/min，10 min，取上清，-20 ℃保存。

1.3 不同肝癌細(xì)胞系中PEG10蛋白表達(dá)測(cè)定 采用Western blotting法。將本實(shí)驗(yàn)室已有的正常肝細(xì)胞L02、肝癌細(xì)胞系(HepG2、HepG2.215、SMMC-7721、BEL-7404、MHCC-97L)和卵巢癌細(xì)胞HO8910、食管癌細(xì)胞EC9706復(fù)蘇后，用1×PBS懸浮細(xì)胞，反復(fù)凍融懸浮細(xì)胞，離心，提取各細(xì)胞系總蛋白。不同細(xì)胞系蛋白經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定，根據(jù)蛋白定量結(jié)果調(diào)整上樣量，每孔上樣蛋白量為15～20 μg,各樣品加入1/4體積4×SDS樣品加樣緩沖液混勻，每孔最大上樣體積為20 μL。具體操作過(guò)程：10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBS于4 ℃封閉過(guò)夜，TBST洗膜3次(10 min/次)后，加入本實(shí)驗(yàn)室制備的抗PEG10單克隆抗體，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)，按1∶5 000加入二抗(熒光標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次(10 min/次)后用濾紙吸去多余液體，顯色。

1.4 肝癌組織和鄰近癌旁組織中PEG10蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。將切片分為肝癌組織、癌旁組織，用本實(shí)驗(yàn)室制備的抗PEG10單克隆抗體進(jìn)行免疫組化染色以分析PEG10在HCC組織中的表達(dá)部位。免疫組化的染色方法參照SABC試劑盒說(shuō)明書。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Carcangin雙計(jì)分法：細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度計(jì)分為3分(深棕色)、2分(棕色)、1分(淡棕色)和0分(陰性)；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多少計(jì)分為3分(60%以上)、2分(20%～60%)、1分(20%以下)和0分(陰性)。兩種計(jì)分相乘的積總分≥4分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)或陰性。

1.5 不同分化程度肝癌組織中PEG10蛋白表達(dá)檢測(cè) 取15例份肝癌組織切片，其中低分化(病理分級(jí)為Ⅲ級(jí))7例、中分化(病理分級(jí)為Ⅱ級(jí))4例和高分化(病理分級(jí)為Ⅰ級(jí))4例，用單克隆抗體3E8進(jìn)行免疫組化染色。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)采用Carcangin雙計(jì)分法：細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度計(jì)為3分(深棕色)、2分(棕色)、1分(淡棕色)和0分(陰性)；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量多少計(jì)為3分(6O%以上)、2分(20%～60%)、1分(20%以下)和0分(陰性)。兩種計(jì)分相乘的積總分≥4分為高表達(dá)，≤3分為低表達(dá)或陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。肝癌分化程度和PEG10表達(dá)量間的關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝癌細(xì)胞系中PEG10蛋白表達(dá)比較 五株肝癌細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)有PEG10表達(dá)，見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)HepG2細(xì)胞系中PEG10蛋白表達(dá)量最高，MHCC-97L細(xì)胞系中PEG10蛋白表達(dá)量最低。而正常肝細(xì)胞系L02、食管癌細(xì)胞系EC9706和卵巢癌細(xì)胞系HO8910中均未檢出PEG10表達(dá)。

2.2 肝癌組織和鄰近癌旁組織中PEG10蛋白表達(dá)比較 73.3%(11/15)的肝癌組織PEG10高表達(dá)，而相應(yīng)93.3%(14/15)的癌旁組織低表達(dá)或不表達(dá)。肝癌組織平均分為5.8分，癌旁組織平均分為1.4分。

2.3 不同分化程度肝癌組織中PEG10蛋白表達(dá)比較 HCC低分化癌組織中PEG10均呈高表達(dá)(7/7)；HCC中分化癌組織中PEG10高表達(dá)率為75%(3/4)；HCC高分化癌組織中PEG10高表達(dá)率為25%(1/4)。低分化、中分化和高分化肝癌組織中PEG10表達(dá)平均分分別為3.2、5.5、8.5分，相關(guān)性分析示肝癌分化程度與PEG10表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.822，P<0.05)。

注：1為MHCC-97L細(xì)胞裂解液；2為HepG2.215細(xì)胞裂解液；3為SMMC-7721細(xì)胞裂解液；4為HepG2細(xì)胞裂解液；5為BEL-7404細(xì)胞裂解液。

3 討論

我國(guó)是肝癌高發(fā)區(qū)，約占全世界肝癌的45%[6]。目前臨床使用的以甲胎蛋白(AFP)為基礎(chǔ)的血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)是早期診斷HCC相對(duì)準(zhǔn)確的方法, 但AFP對(duì)肝癌早期診斷有很大局限性，肝癌患者AFP呈陰性或低濃度陽(yáng)性的原因尚無(wú)定論[7]。另外，肝癌的治療方法仍以肝部分切除術(shù)和肝移植為主，但由于缺乏與肝癌的分期相結(jié)合的“分子分型”信息指導(dǎo)，治療時(shí)常出現(xiàn)類似病情的不同患者對(duì)相同治療措施卻出現(xiàn)不同的臨床反應(yīng)，以及難以對(duì)患者做出準(zhǔn)確的預(yù)后判斷，術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移率較高。因此，我們迫切需要一種新的肝癌分子標(biāo)志物，在肝癌的早期診斷、個(gè)體化治療及預(yù)后判斷等方面發(fā)揮作用。

PEG10 是一個(gè)父系表達(dá)的遺傳印記基因，其在小鼠中的同源基因亦屬于印記。目前研究提示該基因與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。從2001年首次報(bào)道PEG10基因以來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)PEG10作用于肝癌的報(bào)道尚不多。張海等[7]發(fā)現(xiàn)PEG10對(duì)HCC預(yù)后有很好的評(píng)估價(jià)值，但其特異性高而敏感性不高，需要聯(lián)合其他指標(biāo)作出綜合評(píng)價(jià)。張美平[8]認(rèn)為PEG10在絕大多數(shù)肝癌中特異性高表達(dá),其致癌作用很可能部分歸因于Wnt/β-catenin信號(hào)通路。根據(jù)Jia等[9]2007年的報(bào)道,用定量PCR綜合分析PEG10基因和其他四個(gè)肝癌相關(guān)基因在HCC組織中的過(guò)表達(dá),能較準(zhǔn)確地診斷HCC患者,包括那些血清AFP正常的HCC患者和小肝癌患者。

Okabe等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PEG10具有高度組織特異性，在多數(shù)人肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中高表達(dá)，而在正常肝組織和肝細(xì)胞中及其他器官的腫瘤細(xì)胞株、胰腺、結(jié)腸、胃、淋巴細(xì)胞和表皮細(xì)胞中均不表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為了驗(yàn)證PEG10的高度組織特異性，亦為了比較各個(gè)肝癌細(xì)胞系間PEG10表達(dá)差異，通過(guò)Western blotting法檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系、正常肝細(xì)胞系和非肝癌細(xì)胞系。結(jié)果顯示，正常肝細(xì)胞系L02和非肝癌細(xì)胞系HO8910和EC9706不表達(dá)PEG10，而所選用的五株肝癌細(xì)胞系(HepG2、MHCC97L、HepG2.215、BEL-7404、SMMC-7721)均檢測(cè)到不同程度的表達(dá)，其中HepG2表達(dá)最強(qiáng)而MHCC97L表達(dá)最弱。以上結(jié)果一方面為了確證抗PEG10單抗適合用Western blotting方法檢測(cè)PEG10蛋白表達(dá)，另一方面亦證實(shí)了PEG10在肝癌細(xì)胞系中的高度特異性。從臨床應(yīng)用價(jià)值方面看，本實(shí)驗(yàn)制備的抗PEG10單抗能在HepG2、MHCC97L、HepG2.215、BEL-7404、SMMC-7721五種細(xì)胞中檢測(cè)到PEG10表達(dá)，為進(jìn)一步研究PEG10表達(dá)上調(diào)對(duì)細(xì)胞系抗藥性、轉(zhuǎn)移性、侵襲力等一系列生物學(xué)性狀的影響等奠定了基礎(chǔ)，亦為個(gè)體化治療研究提供了依據(jù)。

近年來(lái)，隨著免疫組化技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的出現(xiàn)，免疫組織化學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中已被廣泛應(yīng)用，使諸多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規(guī)腫瘤病理診斷中，5%～10%的病例單靠HE染色難以作出明確的形態(tài)學(xué)診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑒別診斷中的實(shí)用價(jià)值得到普遍認(rèn)可，其在低分化或未分化腫瘤的鑒別診斷時(shí)，準(zhǔn)確率可達(dá)50%～75%。既然PEG10蛋白很有可能是一種新的肝癌分子標(biāo)志物，尋找能應(yīng)用免疫組化染色技術(shù)的抗PEG10單克隆抗體尤為重要。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用制備的單抗PEG10株，采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)15對(duì)肝癌、癌旁組織中PEG10表達(dá)情況，結(jié)果顯示73.3%(11/15)肝癌組織高表達(dá)，而只有6.7%(1/15)的癌旁組織高表達(dá)，93.3%(14/15)癌旁組織表達(dá)很低或不表達(dá)PEG10。此與Okabe等[4]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單抗PEG10株能適用于免疫組化技術(shù)來(lái)檢測(cè)PEG10蛋白表達(dá)。根據(jù)肝癌分化程度，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)HCC低分化癌組織中PEG10均高表達(dá)(7/7)；HCC中分化癌組織中PEG10的高表達(dá)率為75%(3/4)；HCC高分化癌組織中PEG10高表達(dá)率為25%(1/4)。以上結(jié)果提示PEG10與HCC的關(guān)系更密切，我們可初步認(rèn)為PEG10高表達(dá)與HCC的分化程度存在一定相關(guān)性，即HCC的分化程度越低，PEG10表達(dá)量越高。其中，第A0902號(hào)標(biāo)本癌旁組織中檢測(cè)到PEG10高表達(dá)。分析可能原因是癌旁組織中混有表達(dá)PEG10的癌組織，因?yàn)樵诟吻谐中g(shù)中，不能用顯微切割來(lái)準(zhǔn)確分離癌和癌旁組織。今后仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步證明以上的結(jié)果判斷。

總之，PEG10具有高度組織特異性，其在肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，而在正常肝組織和肝細(xì)胞中及其他器官的腫瘤細(xì)胞株中均不表達(dá)；PEG10在不同分化程度的肝癌組織中表達(dá)量不同，且惡性程度越高，PEG10表達(dá)量越高，提示PEG10表達(dá)量與惡性程度具有一定相關(guān)性。本研究有助于進(jìn)一步研究PEG10表達(dá)上調(diào)對(duì)肝癌細(xì)胞系生物學(xué)性狀的影響；探索PEG10作為肝癌分化程度、臨床分期、大體分型、靶向性治療靶分子及判斷患者預(yù)后等可行性提供可靠的工具。僅在肝癌細(xì)胞和組織中檢測(cè)PEG10的表達(dá)，對(duì)于提高肝癌的早期診斷顯然不夠。所以，將制備出的抗體初步應(yīng)用于血清學(xué)診斷，擴(kuò)大臨床樣本，以提高肝癌的早期診斷，特別是提高AFP陰性肝癌的早期診斷還有待進(jìn)一步研究。

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江蘇省衛(wèi)生廳課題(H200758)。

楊瑞麗(E-mail：yrl812@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.008

R735.7

A

1002-266X(2016)41-0030-03

2016-05-06)