劉桂彪，張銘鋒，申璐，黃劍秋，郭瑩，黃文飛，閉麗華，王保山，王彩冰，方曉燕

(右江民族醫(yī)學院，廣西百色533000)

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白花九里明對急性肝損傷小鼠的保護作用及機制

劉桂彪，張銘鋒，申璐，黃劍秋，郭瑩，黃文飛，閉麗華，王保山，王彩冰，方曉燕

(右江民族醫(yī)學院，廣西百色533000)

目的 探討白花九里明提取液對急性肝損傷小鼠的保護作用及機制。方法 取KM小鼠50只，隨機均分為5組，正常對照組和模型對照組給予0.9%NaCl注射液，聯(lián)苯雙酯組給予0.2g/kg聯(lián)苯雙酯，白花九里明低濃度組和高濃度組分別給予15、30g/kg的白花九里明提取液灌胃7d；同時在灌胃的第1、3、5天，對正常對照組給予0.9%NaCl注射液腹腔注射，模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度和高濃度組均給予0.1%四氯化碳(CCl4)溶液腹腔注射。末次灌胃1h后，采血分離血清、取肝左葉制肝懸液分離上清液、取肝右葉制備組織切片。檢測肝勻漿和血清的總蛋白(TP)含量、谷丙轉氨酶(GPT)活性、谷草轉氨酶(GOT)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量，鏡下觀察肝組織結構變化。結果 模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組肝勻漿TP含量明顯高于正常對照組(P均<0.01)，白花九里明高濃度組肝勻漿TP含量明顯高于正常對照組和模型對照組(P均<0.05)，正常對照組、模型對照組、白花九里明低濃度組肝勻漿GPT活性明顯高于聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組(P均<0.05)，白花九里明低濃度組血清GOT活性明顯低于正常對照組(P<0.05)；白花九里明高濃度組、聯(lián)苯雙酯組、模型對照組肝勻漿SOD活性明顯低于正常對照組(P均<0.05)，白花九里明低濃度組的肝勻漿SOD活性明顯高于聯(lián)苯雙酯組(P<0.05)，白花九里明低濃度組血清SOD活性明顯高于正常對照組、模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明高濃度組(P均<0.01)；白花九里明低濃度組和高濃度組肝勻漿MDA含量明顯低于正常對照組(P均<0.05)；其余各組血清TP含量、GPT活性、GOT活性、SOD活性、MDA含量組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。鏡下示聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組和高濃度組與模型對照組相比，肝組織結構清晰，肝細胞變性溶解壞死數(shù)量等均有較大改善，白花九里明低濃度組的少數(shù)中央靜脈管腔內(nèi)見少量的脫落肝組織結構。結論 白花九里明對CCl4誘導的急性肝損傷有明顯的保護作用，且呈濃度依賴性，高濃度白花九里明保護肝細胞效應與聯(lián)苯雙酯相當；其機制可能與促進和調動SOD清除自由基、阻斷和降低肝細胞的脂質過氧化反應、提高肝細胞蛋白質合成有關。

急性肝損傷；壯藥；白花九里明提取液；谷丙轉氨酶活性;谷草轉氨酶活性;超氧化物歧化酶活性;丙二醛；小鼠

白花九里明為菊科植物，分布于廣西、廣東、云南等地,常生長于山坡灌叢、密林、林邊、溪旁、路邊，性微溫、味微苦，在壯族民間內(nèi)服治療月經(jīng)不調、產(chǎn)后流血、風濕骨痛，外用治療跌打腫痛[1,2]。有文獻報道，白花九里明有促進止血和凝血、增強小腸運動、抑制離體心臟收縮力、降低血壓等作用[3～6]。而白花九里明對肝臟損傷方面的影響尚未見文獻報道，本實驗用四氯化碳(CCl4)制備小鼠急性肝損傷模型，采用白花九里明的民間用量[1,2]按體表面積換算成小鼠用量給小鼠灌胃，研究白花九里明提取液對肝損傷的保護作用及機制，并與臨床上保肝藥物聯(lián)苯雙酯[7]的保肝作用相比，為白花九里明的開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：健康普通級KM小鼠，雌雄各半，體質量25～30 g, 由廣西右江民族醫(yī)學院動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證號：SYXK 桂2011-0010，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK桂2012-0003。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為室溫18～22 ℃、濕度50%～60%、日光照12 h。藥材及實驗器材： 白花九里明采于廣西百色市郊(經(jīng)右江民族醫(yī)學院民族醫(yī)教研室覃道光教授認定)，曬干備用。聯(lián)苯雙酯滴丸(Bifendate Pills，萬邦德制藥集團股份有限公司，規(guī)格：1.5 mg，批號：A02141115)；0.9%氯化鈉注射液(貴州天地藥業(yè)有限責任公司，批號：A15031618)；99.5%CCl4(成都市科龍化工試劑廠，批號：20110222)；甲醛(成都市科龍化工試劑廠，20101021)；TP定量測試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20151008、20151009、20151009、20150929、20150818)。酶標儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司，型號：Multiskan MK3)；數(shù)碼顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司，型號：BA210Digital)；離心機(上海安亭科學儀器廠，型號：TGL-16G)；勻漿機(PRO Scientific Inc Oxford CT USA，型號：PR0200)；水浴箱(江蘇金壇宏凱儀器廠，型號：HSY-2M)。

1.2 白花九里明提取液的制備 取白花九里明干草200 g，用30 ℃溫水2 000 mL浸泡4 h，文火煮沸1 h，過濾液隔水文火濃縮至200 mL，提取液濃度為1 g/mL(每毫升含干藥材1 g)放4 ℃冰箱保存。

1.3 小鼠急性肝損傷模型的制備 取99.5%CCl4溶液0.1 mL加入至99.9 mL的茶籽油中，配制成0.1%CCl4溶液。在灌胃的第1、3、5天，對小鼠按10 mL/kg體質量腹腔注射0.1%CCl4油溶液。小鼠出現(xiàn)毛發(fā)粗糙、不光滑，精神萎靡，大便稀爛，血標本AST、ALT增高，肝組織結構模糊不清、細胞水腫或細胞溶解壞死等現(xiàn)象，說明制模成功。

1.4 動物分組與給藥 取小鼠50只，按體質量隨機均分為5組。正常對照組和模型對照組給予0.9% NaCl注射液,聯(lián)苯雙酯組給予20 mg/mL聯(lián)苯雙酯,白花九里明低濃度組和高濃度組分別給予含白花九里明干藥材濃度的0.5、1.0 g/mL白花九里明提取液灌胃，灌胃量按30 mL/kg體質量計算，1次/d，共7 d；同時在灌胃的第1、3、5天，對正常對照組給予0.9% NaCl注射液腹腔注射，模型對照組、聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度和高濃度組均給予0.1%CCl4溶液腹腔注射[8]，注射量按10 mL/kg體質量計算。

1.5 小鼠血清TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平的檢測 在實驗的第7天，末次灌胃30 min后，摘除眼球法取血液，靜置2 h待血液凝固后，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，分離出血清，分別用TP定量測試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，按說明書要求進行操作，用酶標儀檢測血清TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平。

1.6 小鼠肝勻漿TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平的檢測 在實驗的第7天，末次灌胃30 min取血后，迅速剖腹取肝左葉，剪取0.4 g肝組織放入含3.6 mL冰凍0.9%NaCl溶液試管中，用勻漿機攪拌成10%肝懸液，用離心機4 000 r/min離心10 min取上清夜，分別用TP定量測試盒、GPT試劑盒、GOT試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒，按說明書操作，用酶標儀檢測肝勻漿TP、GPT、GOT、SOD、MDA水平。

1.7 小鼠肝組織結構變化觀察 末次灌胃1 h后摘除眼球法采血離心分離血清；迅速剖腹取肝左葉加生理鹽水攪拌制成10%肝懸液離心分離上清液；取肝右葉浸泡于10%甲醛溶液固定30 min后，脫水、石臘包埋、HE染色制成組織切片，通過數(shù)碼顯微鏡檢查各組小鼠肝臟的組織結構并攝影。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肝勻漿和血清TP、GPT、GOT水平比較 見表1。

表1 各組小鼠肝勻漿和血清的TP含量、GPT水平比較

2.2 各組小鼠肝勻漿和血清SOD、MDA水平比較 見表2。

表2 各組小鼠肝勻漿和血清的SOD、MDA水平比較

2.3 各組小鼠肝組織切片鏡下結構變化 正常對照組肝組織結構清晰，肝索排列規(guī)則，肝細胞形態(tài)正常，無肝細胞變性、壞死。模型對照組肝組織結構模糊不清，肝索排列紊亂，肝細胞彌漫水腫，胞質疏松，胞核體積變小甚至溶解，細胞溶解壞死明顯，中央靜脈管腔變小，管腔內(nèi)堆積大量的脫落肝組織結構。聯(lián)苯雙酯組、白花九里明低濃度組和高濃度組與模型對照組相比較，前三者的肝組織結構清晰，肝細胞變性溶解壞死數(shù)量等均有較大的改善，白花九里明低濃度組的少數(shù)中央靜脈管腔內(nèi)見少量的脫落肝組織結構。

3 討論

肝臟是蛋白質合成的主要場所，肝細胞膜受損可致血清TP水平升高；CCl4在肝微粒體細胞色素P450酶系作用下生成自由基CCl3·和CCl3O2·，攻擊肝細胞膜磷脂引起脂質過氧化，亦可與肝細胞的脂質和蛋白質發(fā)生共價結合而破壞肝細胞膜結構，導致肝細胞受損；聯(lián)苯雙酯通過調控細胞色素P450同工酶作用起到保肝作用；GPT、GOT是胞內(nèi)酶，參與蛋白質合成，正常情況下在血清中的水平很低，肝細胞膜受損時可引起血清GPT、GOT水平升高[9，10]。

SOD是體內(nèi)主要的抗氧化酶，能清除體內(nèi)超氧自由基，避免細胞膜發(fā)生脂質過氧化反應生成的脂質過氧化物(LPO)造成細胞損傷。正常情況下，體內(nèi)自由基生成與清除能力處于動態(tài)平衡，無論是自由基生成過多或清除能力下降，均會導致細胞損傷。應急狀態(tài)下，SOD被緊急動員而水平往往高于正常。通過SOD水平的測定能反映氧自由基含量，LPO中間代謝產(chǎn)物MDA水平的測定能反映脂質過氧化物濃度[11]。

本實驗結果顯示，白花九里明高濃度組和低濃度組、聯(lián)苯雙酯組、模型對照組的肝勻漿TP水平明顯高于正常對照組，白花九里明高濃度組和聯(lián)苯雙酯組的肝勻漿GPT水平明顯低于正常對照組、模型對照組、白花九里明低濃度組，肝勻漿GOT水平在各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義；提示CCl4誘導肝損傷的肝細胞內(nèi)蛋白質合成增多，這是肝細胞抵抗損傷、啟動修復程序的一種積極體現(xiàn)，肝勻漿中的TP水平升高與GPT水平降低呈反比關系，說明GPT參與肝內(nèi)蛋白質合成[9]。血清TP、GPT水平在各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義，血清GOT水平除白花九里明低濃度組明顯低于正常對照組外，其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義，而白花九里明高濃度組血清GOT水平接近于白花九里明低濃度組；提示CCl4誘導的急性肝損傷還未能在血清TP、GPT、GOT等指標上的及時表達，白花九里明可降低血清GOT水平。白花九里明高濃度組肝勻漿TP水平明顯高于模型對照組，血清TP水平模型對照組比白花九里明低濃度和白花九里明高濃度組高。肝勻漿GPT水平白花九里明高濃度組和聯(lián)苯雙酯組明顯低于模型對照組；血清GPT水平模型對照組比白花九里明低濃度和白花九里明高濃度組高。提示白花九里明具有提高肝細胞蛋白質合成的作用。模型對照組、聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組的肝勻漿SOD水平明顯低于正常對照組，而血清SOD水平與正常對照組無統(tǒng)計學差異，肝勻漿和血清的MDA水平未出現(xiàn)明顯高于正常對照組的現(xiàn)象；提示CCl4在肝細胞內(nèi)生成的自由基被SOD完全清除，但從肝組織切片觀察到使用CCl4的各組肝細胞均都呈現(xiàn)損傷表現(xiàn)，提示CCl4對肝細胞損傷不僅僅是通過自由基途徑。從肝組織切片我們觀察模型對照組損傷程度最嚴重，聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組損傷程度最輕，白花九里明低濃度組損傷程度較聯(lián)苯雙酯組和白花九里明高濃度組明顯，但白花九里明低濃度組肝勻漿SOD水平明顯高于聯(lián)苯雙酯組而與正常對照組無統(tǒng)計學差異，白花九里明高濃度和低濃度組的肝勻漿MDA水平明顯低于正常對照組；提示白花九里明和聯(lián)苯雙酯均有保護肝細胞的作用，白花九里明高濃度比低濃度對肝細胞的保護作用強，白花九里明不僅能促進肝細胞SOD清除自由基，還能調動機體其他組織SOD進入血循環(huán)，有利于運輸?shù)礁渭毎l(fā)揮作用，同時能阻斷和降低肝細胞的脂質過氧化反應。

綜上所述，白花九里明保護肝細胞可能通過促進和調動SOD清除自由基，并阻斷和降低肝細胞的脂質過氧化反應；提高肝細胞蛋白質合成作用，修復肝細胞損傷、維護肝細胞膜穩(wěn)定、降低血清GPT和GOT水平實現(xiàn)；而白花九里明保護肝細胞的作用是否還存在其他途徑，有待于今后進一步研究。

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Protective effect of Blumea megacephala on acute liver injury in mice

LIUGuibiao,ZHANGMingfeng,SHENLu,HUANGJianqiu,GUOYing,HUANGWenfei,BILihua,WANGBaoshan,WANGCaibing,FANGXiaoyan

(YoujiangMedicalCollegeforNationalities,Baise533000,China)

Objective To investigate the protective effect of Blumea megacephala extracting solution on acute liver injury of mice and its mechanism of action. Methods Fifty KM mice were randomly divided into 5 groups. Normal control group and model control group were given 0.9% NaCl injection, bifendatatum group was given 0.2 g/kg bifendatatum, Blumea megacephala low-concentration group and high-concentration group were respectively given 15 and 30 g/kg Blumea megacephala extracting solution for 7 days by gastric irrigation. Meanwhile, on day 1, 3 and 5 of gastric irrigation, the normal control group was given 0.9% NaCl by intraperitoneal injection, the rest of the groups were given 0.1%Carbon tetrachloride (CCL4) liquid. One hour 1 h after the last intragastric administration, we collected and separated the serum, and took the left lobe of liver to make and separate the liver supernatant, took the right lobe of liver to make tissue section. The total protein (TP), glutamic-pyruvic transaminase (GPT), glutamic-oxalacetic transaminase (GOT), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) content or activity in liver homogenate and serum were detected and we observed the structure changes of liver tissue microscopically. Results The TP content of liver homogenate in the model control group, bifendatatum group and Blumea megacephala low-concentration group was obviously higher than that of the normal control group (allP<0.01). The TP content of liver homogenate in the Blumea megacephala high-concentration group was higher than that of the normal control group and model control group (allP<0.05). The GPT activity of liver homogenate in the normal control group, model control group and Blumea megacephala low-concentration group was higher than that of the bifendatatum group and Blumea megacephala high-concentration group (allP<0.05). The GOT activity of serum in the Blumea megacephala low-concentration group was lower than that of the normal control group (P<0.05). The SOD activity of liver homogenate in the Blumea megacephala high-concentration group, bifendatatum group and model control group was lower than that of the normal control group (allP<0.05). The SOD activity of liver homogenate in the Blumea megacephala low-concentration group was higher than that of the bifendatatum group (P<0.05), but the SOD activity of serum was higher than that of the normal control group, model control group, bifendatatum group and Blumea megacephala high-concentration group (P<0.01). The MDA content of liver homogenate in the Blumea megacephala low-concentration group and high-concentration group was lower than that of the normal control group (allP<0.05). No statistically significant difference were found in the TP content, GPT activity, GOT activity, SOD activity and MDA content of serum among these groups (P>0.05). The histological examinations showed that the liver tissue structure was clear, less liver cells were degenerated, dissolved and necrotic and a small number of central venous cavities had a small amount of shedding liver tissue structure in the bifendatatum group, Blumea megacephala low-concentration and high-concentration group as compared with the model control group.Conclusions Blumea megacephala have protective effect on CCl4-induced acute liver injury with dose-effect relationship. The high-concentration Blumea megacephala have the same effect as bifendatatum on liver cells, whose mechanism may be related to facilitation and regulation of SOD in scavenging free radicals, blocking and reducing lipid peroxidation of liver cells, and enhancing protein synthesis in liver.

acute liver injury; Zhuang-nationality drugs; Blumea megacephala extracting solution; glutamic-pyruvic transaminase activity; glutamic-oxalacetic transaminase activity; superoxide dismutase activity; malondialdehyde; mice

2015年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510599009)。

劉桂彪(1992-)，男，本科在讀，專業(yè)為臨床醫(yī)學。E-mail：83866781@qq.com

簡介：王彩冰(1962-)，女，副教授，主要研究方向為藥物藥效學研究及生理教學研究。E-mail：wangcb4444@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.41.004

R575；R931.71

A

1002-266X(2016)41-0014-04

2016-06-06)