簡 麗， 趙啟全， 賈 蓓， 黃文祥

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院 1內分泌科， 2呼吸內科，重慶 402360；3重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，重慶 400016)

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·短篇論著·

金葡菌主動外排蛋白QacA α-螺旋1、2及TMS1氨基酸的功能研究*

簡 麗1， 趙啟全2， 賈 蓓3△， 黃文祥3

(重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院1內分泌科，2呼吸內科，重慶 402360；3重慶市傳染病寄生蟲病學重點實驗室，重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院感染科，重慶 400016)

目的： 評價金黃色葡萄球菌多藥耐藥主動外排蛋白QacA α-螺旋1和2及跨膜區(qū)(TMS)1上的氨基酸對于底物轉運的重要性。方法:采用半胱氨酸定點誘變的方法誘變QacA蛋白α-螺旋1和2及TMS1上的氨基酸I2、S3、F4、F5、T6、K7、D10、M11、R17、W18、T19、A20、V21、V22、V23、F29、D34、P43、E48、E50、P51和Q55。測定誘變菌株最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)以及熒光運輸試驗分析氨基酸的功能變化。結果:MIC和MBC結果分析提示獲得的誘變菌株S3C、T6C、R17C、T19C、A20C、F29C和E50C對所測藥物完全恢復敏感性,F4C、F5C和P51C對所測藥物耐藥性明顯降低。運輸試驗結果與MIC、MBC結果一致，提示10株誘變菌株失去對底物的轉運能力。結論:QacA蛋白α-螺旋1和2及TMS1上的氨基酸S3、F4、F5、T6、R17、T19、A20、F29、E50 和 P51可能與QacA蛋白一價和二價陽離子底物的結合和轉運功能密切相關。

金黃色葡萄球菌； QacA蛋白；跨膜區(qū)； α-螺旋； 半胱氨酸定點誘變

金黃色葡萄球菌是導致社區(qū)感染和院內感染的重要病原菌[1]。金黃色葡萄球菌胞壁及其分泌的外毒素具有極強的致病力[2-3]。該菌對多種抗菌藥物的高度耐藥性給臨床治療帶來了極大的困難。據(jù)國內耐藥監(jiān)測統(tǒng)計，2008～2011年金黃色葡萄球菌院內感染率分別為32.2%、32.5%、32.8%和35.56%，感染的分布各地區(qū)雖有不同，但總體上有逐年上升的趨勢。事實上，經(jīng)醫(yī)護人員傳播是導致院內感染的主要原因之一，因此，阻斷其傳播的重要措施就是使用消毒劑和殺菌劑對潛在污染的手、工作服、器具、房間等進行去污處理。研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌對消毒劑和殺菌劑耐藥的主要機制即多藥外排泵，其中最主要的是qac基因編碼的Qac多藥外排泵。近年來的研究表明qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacF、qacG、qacH、qacJ等，其中以金葡菌多重耐藥質粒如pSK1[4-5]上的qacA基因研究較多。qacA基因編碼的QacA外排蛋白至少對30種一價和二價的親脂性陽離子類抗菌藥物耐藥[6]，其外排的多數(shù)抗菌藥物為臨床重要的消毒劑和殺菌劑，包括溴化乙錠(ethidium bromide，EB)、苯扎氯銨(benzalkonium chloride，BC)、派若寧(pyronin Y，PY)、地喹氯銨(dequanlinium chloride，DC)、氯己定(chlorhexidine，CH)等。QacA蛋白有514個氨基酸，約54 kD，屬于主動外排蛋白的主要易化超家族中的DHA14亞類，具有14個跨膜α-螺旋[4]。既往研究顯示QacA 蛋白中的甘氨酸、脯氨酸、芳香族氨基酸，如在TMS1的D34，TMS2的Y63，TMS4的R114，TMS5的P161，TMS6的H174，TMS10的M319、D323、P328，TMS10的G313，TMS11 的Y358C，TMS13的D411和Y410，TMS13的Y429等[5-6]與其外排作用密切相關，這些氨基酸定點誘變后，能使QacA 蛋白對一價和二價的親脂性陽離子類抗菌劑的耐藥性和運輸活性均降低。因此對金黃色葡萄球菌QacA蛋白上氨基酸的研究可以進一步了解金葡菌的耐消毒劑和殺菌劑機制。本研究對QacA蛋白α-螺旋(α-helix)1、2細胞膜上的14個氨基酸和跨膜區(qū)(transmembrane segment, TMS)1的8個氨基酸位點進行半胱氨酸定點誘變，測定誘變后菌株最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)的變化，并進行運輸試驗比較誘變前后細菌的轉運功能變化。

材 料 和 方 法

1 菌株和質粒

重組質粒pBluescript II SK(+)/qacA由本實驗室提供，大小為4 511 bp，具有氨芐青霉素抗性，該克隆質粒經(jīng)序列測定和分析，證明其編碼框序列完整，無突變、缺失。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購于北京鼎國公司。

2 主要試劑及材料

溴化乙錠、苯扎氯胺、派若寧、地喹氯銨、氯己定等購于Sigma。

3 半胱氨酸定點誘變

根據(jù)qacA基因的全序列及氨基酸序列，設計寡核苷酸引物(可引入適合的內切酶位點)，以QacA 野生型(wild-type，WT)的質粒 [qacA克隆入pBluescript II SK(+)] 為模板，用PCR擴增基因，用DpnI除去模板質粒后，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選12株轉化菌株，提取質粒用相應的內切酶篩選可能的突變株，并測序(由重慶醫(yī)科大學省部共建感染性疾病分子生物學重點實驗室完成)確證無二次突變，保存菌株。然后以MIC和MBC檢測各突變株突變后的耐藥情況并比較表達量。誘變引物序列見表1。誘變PCR條件為95 ℃ 4 min；95 ℃ 50 s，60 ℃ 30 s，68 ℃ 9 min。

4 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定

選取有代表性的一價和二價化合物(Py、Dc、Ch、Bc和Eb)，采用瓊脂平板稀釋法，以QacA WT為陽性對照，pBluescript II SK(+)轉化入大腸桿菌DH5α為陰性對照，測試誘變株的藥物敏感性。分別于接種后24 h觀察細菌生長情況界定MIC，48 h后觀察MBC。

5 運輸試驗

本實驗使用EB進行熒光運輸試驗。將離心過夜培養(yǎng)的半胱氨酸定點誘變成功的菌株用20 mmol/L的HEPES(pH 7.0)重懸，均將A650值調整到0.6。每 1 mL細菌液中加入甲酸鈉溶液，再加入不同濃度(0.1 mg/L、0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L、10.0 mg/L、11.0 mg/L)的EB，37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用熒光分光光度儀(Eppendorf)測定菌株的運輸活性。

結 果

1 MIC的測定結果

22株誘變菌株的MIC值測定結果提示，S3C、T6C、R17C、T19C、A20C、F29C和E50C對所測藥物完全恢復敏感性；F4C、F5C和P51C對所測藥物耐藥性明顯降低；I2C、K7C、D10C、M11C、W18C、V21C、V22C、V23C、D34C、P43C、E48C和Q55C與陽性對照菌株(QacA WT)結果近似。其中T6C菌株的生長能力有所下降，多次搖床培養(yǎng)均較其余菌株需要更多的時間，見表2。

表1 誘變的引物序列

F: forward; R: reverse.

表2 半胱氨酸定點誘變株MIC的變化

Table 2.The changes of the MIC (mg/L ) from the mutants after cysteine site-directed mutagenesis

StrainPYDCCHBCEBVector64320.2512816QacAWT1282562256512I2C2563222561024S3C16320.56416F4C641281256256F5C64640.5128256T6C64320.25256512K7C2562562256>1024D10C2562562256>1024M11C2562562256>1024R17C8320.2525616W18C322562256128T19C16320.525616A20C32320.564128L21C322560.25128512V22C642561256256V23C642562512512F29C32320.25256256D34C2562564256>1024P43C2562562256>1024E48C2562562256>1024E50C8320.512816P51C64320.5128256Q55C2562562128>1024

2 MBC的測定結果

22株誘變菌株的MBC值測定結果大致同MIC值，S3C、T6C、R17C、T19C、A20C、F29C和E50C對所測藥物完全恢復敏感性；F4C、F5C和P51C對所測藥物耐藥性明顯降低；I2C、K7C、D10C、M11C、W18C、V21C、V22C、V23C、D34C、P43C、E48C和Q55C與陽性對照菌株(QacA WT)結果近似，見表3。

表3 半胱氨酸定點誘變株MBC的變化

Table 3.The changes of the MBC (mg/L) from the mutants after cysteine site-directed mutagenesis

StrainPYDCCHBCEBVector1282560.564256QacAWT25651222561024I2C51212825122048S3C64640.525632F4C1282561256512F5C1282561256512T6C1281280.5256512K7C25625622562048D10C256102422562048M11C25625622562048R17C64640.2525616W18C12810242256512T19C1282560.525632A20C32641128256L21C1285121256512V22C12851222561024V23C1285122512512F29C64640.52561024D34C25651242562048P43C25651221282048E48C25625622562048E50C128640.5128256P51C128641128512Q55C25651221282048

3 運輸試驗的結果

運輸試驗的結果如圖1、圖2所示，S3C、F4C、F5C、T6C、R17C、T19C、A20C、F29C、E50C和P51C誘變菌株失去對EB的轉運能力;I2C、K7C、D10C、M11C、W18C、V21C、V22C、V23C、D34C、P43C、E48C和Q55C仍保持較高的轉運活性。

Figure 1.The activity of transporting EB in the QacA mutants of I2C, S3C, F4C, F5C, T6C, K7C, D10C, M11C, R17C, W18C and T19C strains.

圖1 QacA誘變株I2C、S3C、F4C、F5C、T6C、K7C、D10C、M11C、R17C、W18C和T19C對EB的運輸活性

Figure 2.The activity of transporting EB in the QacA mutants of A20C, V21C, V22C, V23C, F29C, D34C, P43C, E48C, E50C, P51C and Q55C strains.

圖2 QacA誘變株A20C、V21C、V22C、V23C、F29C、D34C、P43C、E48C、E50C、P51C和Q55C對EB的運輸活性

討 論

Rouch等1990年在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)了qacA基因。Miyazaki等2001年在部分歐洲醫(yī)院中發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus, MRSA)中qacA基因的陽性率達到62.6%。Wang等[7]2008年對國內多家醫(yī)院的調查中發(fā)現(xiàn)在MRSA中qacA基因陽性率達到55%。大量抗菌劑的不合理使用是導致細菌耐藥的重要原因[8-9]。以前有人認為細菌外膜通透性降低是細菌多重耐藥的主要機制，但是隨著主動外排系統(tǒng)研究的深入，現(xiàn)在人們普遍認為主動外排機制比細菌外膜通透性機制更加重要。在金黃色葡萄球菌中，QacA就是一個對消毒劑及殺菌劑的多藥外排蛋白，在轉運物質出細胞膜的過程中涉及單向轉運、同向轉運、反向轉運等機制[7,10]。對QacA多藥外排蛋白結構與功能的深入理解將為設計有效的外排泵抑制劑提供有力的分子生物學理論基礎。

定點誘變技術是研究蛋白結構與功能的重要方法，由于半胱氨酸體積中等，替換后對原蛋白結構影響小，而且QacA蛋白不含半胱氨酸，因此可對QacA蛋白每個氨基酸進行半胱氨酸定點誘變。我們成功運用半胱氨酸定點誘變技術替換QacA蛋白單個氨基酸獲得22株誘變菌株。S3C、F4C 、F5C 、T6C, R17C 、T19C 、A20C 、F29C 、E50C和P51C誘變株與qacA克隆菌株相比MIC 及MBC值降低明顯，且轉運能力也下降，提示它們在QacA蛋白一價和二價底物的轉運中可能具有重要作用。其中S3(絲氨酸)和T6(蘇氨酸)屬于羥基類氨基酸，R17(精氨酸)和E50(谷氨酸)屬于帶電荷氨基酸，F(xiàn)4、F5和F29(苯丙氨酸)屬于芳香族氨基酸。既往國內外有研究表明，谷氨酸和精氨酸都是屬于帶負電荷的氨基酸，它們在羧基基團結構上雖然只有微小的差別，但它們在功能上是不能被替換的[11]；芳香族氨基酸的苯環(huán)能提供被稱為陽離子-π相互作用的負性靜電區(qū)，它能比較牢固的結合陽離子底物；多藥轉運蛋白中對于轉運和/或結合親脂性陽離子，位于膜內的芳香族氨基酸許多也是必須的。本實驗大部分結果與既往國內外研究結果一致。但本次實驗中D34C的實驗結果與前期研究結果不一致，需進一步研究加以驗證。T6C菌株較為特殊，其生長能力有所下降，多次搖床培養(yǎng)均較其余菌株需要更長時間，其原因可能與T6C誘變菌株的生長受到抑制有關。目前國內外尚無對T6(蘇氨酸)的研究報道，有待深入進一步研究其與QacA蛋白的關系。

我們對QacA蛋白部分氨基酸進行了功能的研究，下一步可進一步比較突變株蛋白表達的差異，也可根據(jù)N-己基順丁烯二酰亞胺(N-ethylmaleimide，NEM)與半胱氨酸的反應強度判斷每個氨基酸所處的環(huán)境，判斷各氨基酸的位置處于周質，膜亦或細胞質，更加深入全面了解QacA蛋白與外排底物功能密切相關的氨基酸，進一步明確各個氨基酸在QacA蛋白一價和二價底物的轉運中的重要性。目前國內對QacA蛋白二級結構的獲得還是主要通過對一級蛋白的測序預測，對獲得的2-D模型再通過物理、生物學、遺傳學等分析的方式進行驗證。對于QacA蛋白功能評估的文獻報道也較少，國際上對外排蛋白的研究方法也是對數(shù)個或某種氨基酸進行定點誘變后進行藥敏實驗以及動力學實驗來分析和判斷氨基酸的重要性[5-6, 12-17]。研究外排蛋白系統(tǒng)分子水平的結構和功能，對弄清多藥結合轉運機制，獲得三維結晶結構等起著關鍵性的作用，同時也是開發(fā)新外排泵抑制劑的必要基礎。因此本研究可促進我國相關研究的進展，為下一步進行三維結晶結構的研究奠定基礎，同時從理論上也有利于降低金黃色葡萄球菌的耐藥率，具有重要的臨床意義和流行病學意義[14, 18-19]。

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(責任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Functional study on amino acid residues in α-helix 1, 2 and TMS1 of multidrug exporter QacA from Staphylococcus aureus

JIAN Li1, ZHAO Qi-quan2, JIA Bei3, HUANG Wen-xiang3

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofRespiratoryMedicine,People’sHospitalofDazuDistrict,Chongqing402360,China;3TheKeyLaboratoryofInfectiousandParasiticDiseasesinChongqing,DepartmentofInfectiousDiseases,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.E-mail:beijia7410@163.com)

AIM: To determine the importance of the amino acid residues in α-helix 1, 2 and transmembrane segment (TMS) 1 of multidrug exporter QacA fromStaphylococcusaureus. METHODS: Cysteine site-directed mutagenesis was used to mutate the residues including I2, S3, F4, F5, T6, K7, D10, M11, R17, W18, T19, A20, V21, V22, V23, F29, D34, P43, E48, E50, P51 and Q55. Minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC)determination and transport assay were performed to analyze the function of these mutants. RESULTS: The results of MIC and MBC analysis suggested that the drug sensitivity of the mutants S3C, T6C, R17C, T19C, A20C, F29C and E50C to the detected substrates restored completely, and the resistance of the mutants F4C, F5C and P51C to the detected substrates reduced significantly. The results of the fluorimetric transport assay were in agreement with those of MIC and MBC analysis, which indicated that the mutants of S3C, F4C，F(xiàn)5C, T6C, R17C, T19C, A20C, F29C, E50C and P51C could not transport the tested substrates.CONCLUSION: The residues including S3， F4， F5， T6， R17， T19， A20， F29， E50 and P51 are probably involved in the substrate binding and translocation in α-helix 1, 2 and TMS1 of multidrug exporter QacA.

Staphylococcusaureus; QacA protein; Transmembrane segment; α-helix; Cysteine site-directed mutagenesis

1000- 4718(2016)11- 2073- 06

2016- 05- 23

2016- 10- 09

國家自然科學基金資助項目(No. 30973592)

R378．1+1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.11.026

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